Summary
Ici, nous introduisons et décrivons une méthode non radioactive et non invasive pour évaluer la synthèse de la protéine de novo in vivo, en utilisant le nématode Caenorhabditis elegans et la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Cette méthode peut être combinée avec des écrans génétiques et/ou pharmacologiques pour identifier de nouveaux modulateurs de synthèse protéique.
Abstract
Le maintien d’un protéome sain est essentiel pour l’homéostasie cellulaire et organisationnelle. La perturbation de l’équilibre entre le contrôle translationnel des protéines et la dégradation provoque une multitude de maladies liées à l’âge. Le déclin des mécanismes de contrôle de la qualité de la protéostase est une caractéristique du vieillissement. Les méthodes biochimiques de détection de la synthèse des protéines de novo sont encore limitées, présentent plusieurs inconvénients et ne peuvent pas être effectuées dans des cellules vivantes ou des animaux. Caenorhabditis elegans, transparent et facilement génétiquement modifié, est un excellent modèle pour surveiller les taux de synthèse des protéines en utilisant des techniques d’imagerie. Ici, nous introduisons et décrivons une méthode pour mesurer la synthèse de la protéine de novo in vivo en utilisant la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Les animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans des cellules ou des tissus spécifiques sont irradiés par une source lumineuse puissante ayant pour résultat le photobleachage de fluorescence. À son tour, l’évaluation de la récupération de fluorescence signifie une nouvelle synthèse des protéines dans les cellules et/ou les tissus d’intérêt. Par conséquent, la combinaison de nématodes transgéniques, d’interventions génétiques et/ou pharmacologiques ainsi que d’imagerie vivante des taux de synthèse des protéines peut faire la lumière sur les mécanismes de médiation de l’effondrement de la protéostase dépendante de l’âge.
Introduction
La synthèse et la dégradation des protéines sont essentielles à l’homéostasie organisationnelle. Une multitude de maladies liées à l’âge sont provoquées par la production de protéinesdéfectueuses 1,2. Afin de mesurer les taux mondiaux de traduction des protéines, il existe des techniques biochimiques telles que le profilage ribosomal, qui implique le séquençage profond des fragments d’ARNm protégés par le ribosome pour surveiller l’expression ainsi que la synthèse des protéinesnouvelles 3. Cette méthode, en plus d’être une lecture indirecte des taux de traduction, comme l’association accrue de l’ARN aux ribosomes ne signifie pas nécessairement une traduction accrue, a des inconvénients techniques, tels que le coût élevé et une exigence d’une grande quantité de matériel de départ. D’autre part, les méthodes à base de protéomique permettent une quantification directe des protéines par le profilage métabolique des impulsions suivie d’une analyse de spectrométrie de masse4,5. Cependant, il s’agit d’une approche semi-quantitative avec une résolution temporelle limitée qui ne peut pas être facilement utilisée in vivo. En outre, l’étiquetage de la protéine peut être inégalement réparti dans l’animal/tissu d’intérêt. Fait important, ces deux méthodes peuvent dissimuler des variations spécifiques aux tissus ou des cellules dans les taux de traduction des protéines chez des animaux entiers ou des tissus, respectivement.
Caenorhabditis elegans est un organisme modèle facile à utiliser qui peut être cultivé en grand nombre6. En outre, son agrément génétique et sa transparence permettent l’imagerie vivante in vivo. Ce protocole décrit la méthodologie pour détecter les taux de synthèse des protéines à l’aide de la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Nous profitons de l’expression transgénique des protéines fluorescentes, soit dans l’organisme entier, soit dans des tissus/cellules spécifiques. Les animaux transgéniques peuvent soit exprimer le GFP en utilisant le promoteur d’un gène, qui est largement/globalement exprimé ou un promoteur spécifique aux tissus pour cibler des types de cellules spécifiques. Cette technique peut être étendue à un promoteur spécifique pour examiner les taux de synthèse des protéines d’une protéine spécifique.
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Protocol
REMARQUE : Les fusions transcriptionnelles et translationnelles aux fluorophores peuvent être utilisées pour évaluer la traduction de protéines de novo dans plusieurs tissus. Les taux de synthèse des protéines peuvent être évalués pour plusieurs familles de protéines qui ont été localisées dans différents compartiments cellulaires, y compris le cytoplasme, les mitochondries et le noyau7. Les souches suivantes sont utilisées pour surveiller les taux globaux et de synthèse des protéines neuronales, N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. Entretien, synchronisation et préparation de nématodes transgéniques pour la surveillance de la synthèse des protéines novo
- Utilisez un stéréomicroscope disséquant pour évaluer les stades de développement et la croissance du type sauvage (wt) et des nématodes transgéniques mutants.
- Jour 1 : Utilisez une pioche de vers pour sélectionner et transférer 10 larves de L4 d’animaux transgéniques wt et mutants portant le journaliste fluorescent souhaité sur les plaques nematode Growth Media (NGM) ensemencées d’Escherichia coli (OP50) (Tableau 1).
- Faites une sélection de vers en attachant un fil de platine dans l’extrémité effilée d’une pipette pasteur en verre en faisant fondre le verre sur le site de contact sur un brûleur Bunsen. Ensuite, aplatir l’extrémité du fil de platine en forme de spatule à l’aide de n’importe quel outil (p. ex., pince ou marteau léger).
- Inoculer une seule colonie de bactéries E. coli (OP50) dans une fiole contenant 50 ml de milieu liquide Luria-Bertani (LB) et se développer pendant 10 heures à 37 °C dans un incubateur de secousses (200 tr/min; Tableau 1). Ensuite, les plaques de NGM de semences avec 200 μL de culture bactérienne. Incuber les plaques ensemencées à température ambiante pendant la nuit pour permettre la croissance de la pelouse bactérienne.
- Incuber et faire pousser les nématodes à la température standard de 20 °C.
- Jour 5 : Les plaques contiennent une population mixte de vers transgéniques. Sélectionner et transférer 15 larves L4 de chaque souche sur des plaques OP50-NGM fraîchement ensemencées.
- Jour 6 : Effectuer l’analyse FRAP et surveiller le taux de synthèse des protéines le premier jour de l’âge adulte.
- Préparer et utiliser le cycloheximide contenant des plaques NGM comme un contrôle positif :
REMARQUE : Préparez une solution de bouillon de cycloheximide en diluant dans l’eau à une concentration de 10 mg/mL. Conserver la solution de stock à 4 °C.- Tuer les bactéries en exposant les plaques de NGM ensemencées pendant 15 minutes avec la lumière UV (222 μW/cm2 intensité).
- Ajouter le cycloheximide sur les plaques à graines bactériennes à une concentration finale de 500 μg/mL dans le volume d’agar.
- Laisser sécher les assiettes à température ambiante pendant 30 minutes.
- Transférer des nématodes transgéniques exprimant psod-3GFP sur les plaques contenant des véhicules et des cycloheximide.
- Incuber les animaux pendant 2 h à la température standard de 20 °C.
2. Essai FRAP utilisant des animaux transgéniques exprimant les reporters de tissu somatique pife-2GFP et psod-3GFP
REMARQUE : Surveiller le taux global de synthèse des protéines dans tout le corps animal. Ces reporters transcriptionnels présentent différents niveaux d’expression et sont omniprésents dans les tissus somatiques multiples, y compris l’intestin, le pharynx et les muscles de la paroi du corps.
- Choisissez et transférez des animaux transgéniques d’un jour sur des plaques NGM individuelles ensemencées d’une goutte op50 de 20 μL dans le centre.
- Retirez le couvercle et placez chaque plaque sous une lentille objective 20x d’un microscope à épifluorescence.
- Concentrez-vous et capturez une image de référence avant de photobleaching (pré-blanchiment).
- Photobleach chaque échantillon pendant 10 minutes.
REMARQUE : Arrêtez le photobleaching lorsque le signal fluorescent est éteint à 30 – 50 % d’intensité par rapport à l’image de pré-blanchiment. L’intensité lumineuse et la durée de la période de blanchiment doivent être ajustées en conséquence pour le fluorophore spécifique, le stade animal et la cellule ou le tissu à l’étude. La durée appropriée de l’irradiation nécessaire pour atteindre une étendue adéquate de photobleaching, pour différents spécimens, devrait être déterminée expérimentalement. - Capturez une image après photobleaching (blanchiment).
- Gardez les animaux dans des plaques NGM individuelles et laissez-les récupérer.
- Image et enregistrer la récupération de chaque journaliste fluorescent toutes les 1 heure pendant au moins 6 heures à un stéréomicroscope de fluorescence.
- Sinon, effectuer une évaluation de récupération fluorescente à l’aide d’un microscope à épifluorescence (p. ex., AxioImager Z2).
- Évaluez soigneusement la santé animale par animal en surveillant leur locomotion, leur sensibilité au toucher, leur capacité de reproduction et leur survie au cours des 3 prochains jours. Les nématodes montrant des signes de dommages après photobleaching ont été exclus de l’analyse plus poussée.
3. Montage des échantillons et effectuer des essais FRAP à l’aide de nématodes transgéniques exprimant le GFP cytoplasmique pan-neuronal, punc-119GFP
REMARQUE : Surveillez la synthèse des protéines pan-neuronales par photobleaching ciblé à la région de la tête, où se trouve l’anneau nerveux.
- Préparer 2% de coussinets agarose.
- Ajouter une goutte de tampon M9 de 10 μL au centre du tampon agarose.
- Transférez 5 nématodes transgéniques exprimant le GFP cytoplasmique pan-neuronal dans une goutte de tampon M9.
- Utilisez un cil pour répandre le liquide.
REMARQUE : Les animaux affichent des mouvements réduits dans les 2 minutes en raison de l’absorption de M9 dans l’agar. - Changez la position du nématode pour éviter de vous chevaucher à l’aide d’un pic à cils.
- Placez l’échantillon sous une lentille objective 40x d’un microscope à épifluorescence.
REMARQUE : N’utilisez pas de couvercle. - Concentrez et capturez une image de référence (pré-blanchiment).
- Photobleach la zone d’intérêt ciblée pendant 90 secondes.
REMARQUE : Arrêtez le photobleaching lorsque le signal fluorescent est éteint à 30 – 50 % d’intensité par rapport à l’image de pré-blanchiment. L’intensité lumineuse et la durée de la période de blanchiment doivent être ajustées en conséquence pour le fluorophore spécifique, le stade animal et la cellule ou le tissu à l’étude. La durée appropriée de l’irradiation nécessaire pour atteindre une étendue adéquate de photobleaching, pour différents spécimens, devrait être déterminée expérimentalement. - Capturez une image après photobleaching (blanchiment).
- Ajoutez une goutte de tampon M9 de 10 μL sur les nématodes photobleached.
- Laisser les animaux récupérer pendant 5 minutes.
- Utilisez le pic à cils ou une pipette pour transférer les nématodes sur des plaques NGM individuelles ensemencées de 20 μL OP50 au centre.
- Capturez une image de chaque échantillon toutes les 1 heure sous un stéréomicroscope d’épifluorescence.
REMARQUE : Comptez t=0 pour le temps de récupération après le photobleaching.
4. Analyse des données des images capturées pendant l’essai du FRAP
- Analyser les images acquises à l’aide d’un logiciel (p. ex., Fidji).
- Ouvrez des images avec le logiciel.
- Sélectionnez la commande Split Channels via le menu déroulant Image et Couleur.
REMARQUE : Conservez l’image du canal vert. - Utilisez l’outil Sélection à main levée pour régler manuellement la région fluorescente d’intérêt (p. ex., corps entier, tête, intestin).
- Sélectionnez la commande Mesure via le menu déroulant Analyser pour mesurer l’intensité moyenne des pixels de la zone d’intérêt pour chaque point de temps.
REMARQUE : Le pourcentage de récupération de fluorescence est calculé à l’aide des images de référence capturées après le photobleaching.
5. Analyse statistique du rapport
- Utilisez au moins 20 à 25 nématodes de chaque souche et/ou condition.
REMARQUE : Trois répliques biologiques doivent être effectuées. - Effectuer le test t-étudiant(comparaison entre deux groupes) ou ANOVA (comparaison entre plusieurs groupes) pour l’analyse statistique avec P < 0,05 comme significatif à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique.
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Representative Results
À l’aide de la procédure présentée ici, des nématodes transgéniques sauvages et mutants exprimant les reporters somatiques suivants, pife-2GFP, psod-3GFP et punc-119GFP, ont été utilisés pour évaluer les taux de synthèse des protéines selon les protocoles respectifs. En particulier, les vers mutants de type sauvage et d’ife-2 exprimant le GFP cytoplasmique dans leurs tissus somatiques en utilisant le promoteur ife-2 ont été comparés avant, immédiatement après le photobleaching et 5 heures après la récupération. Les images représentatives et la quantification montrent que les animaux de type sauvage récupèrent complètement alors que les mutants ife-2 ont diminué la capacité de récupération (figure 1A). Ainsi, les vers de type sauvage initient la biosynthèse de la protéine novo après le photobleaching tandis que les vers dépourvus de facteur d’initiation à l’ARNm IFE-2 ne sont pas en mesure de le faire, ce qui indique que le taux de récupération de fluorescence illustre le taux de synthèse des protéines in vivo7. En outre, le cycloheximide, un inhibiteur spécifique de la traduction de l’ARNm, peut être utilisé comme un contrôle positif pour l’inhibition de la traduction des protéines. En effet, les animaux transgéniques traités par cycloheximide exprimant le GFP cytoplasmique sous le promoteur du sod-3 ne récupèrent pas leur fluorescence lors du photobleaching (figure 1B).
Nous avons également appliqué cette méthode pour détecter comment les organismes de traitement de l’ARNm (P corps) affectent le taux de traduction des protéines8. Type sauvage et edc-3(ok1427) nématodes mutants exprimant GFP pan-neuronal ont été examinés pour leur capacité de récupération sur photobleaching ciblé à la région de tête. La récupération de la fluorescence est beaucoup plus lente chez les animaux déficients EDC-3 que chez les animaux sauvages (figure 1C). Cela indique que le roulement de l’ARNm à médiation EDC-3 entrave la synthèse des protéines et supprime finalement l’initiation à la traduction des protéines9.
Figure 1 : Évaluation in vivo de la synthèse des protéines de novo dans C. elegans. (A) Analyse frap dans les deux nématodes défectueux de type sauvage et IFE-2 exprimant le GFP cytoplasmique sous le promoteur d’ife-2. Les animaux transgéniques sont soumis à des photobleachings d’animaux entiers. Le signal GFP est réduit à 30-50% de l’intensité initiale. La fluorescence est enregistrée avant le photobleaching (pré-blanchiment), après la fin de la période de photobleaching (10 min; eau de Javel) et 5 heures après la récupération. (B) Le traitement cycloheximide inhibe le rétablissement de fluorescence des animaux transgéniques exprimant le GFP cytoplasmique sous le promoteur du sod-3. Les animaux transgéniques sont soumis à des photobleachings animaux entiers. Le signal GFP est réduit à 30-50% de l’intensité initiale. La fluorescence est enregistrée avant le photobleaching (pré-blanchiment), après la fin de la période de photobleaching (10 min; bleach) et 5 heures après la récupération (A, B: Microscope AxioImager Z2; objectif: 20x, ouverture numérique 0,8; source lumineuse de haute puissance, HBO 100; lampe à arc de mercure de 100 Watts; ensembles de filtres d’excitation/émission, Zeiss Set 38 Endow GFP sans changement). Barres d’échelle, 500μm. (C) EDC-3 les nématodes déficients affichent les taux de synthèse de protéine de novo diminués dans les cellules neuronales. Le signal de fluorescence des animaux de type sauvage et edc-3(ok1427) exprimant le GFP cytoplasmique pan-neuronal est mesuré avant le photobleaching (pré-blanchiment) ainsi que le suivi de la période de photobleaching (90sec; blanchissement). Les animaux transgéniques sont soumis au photobleaching à la région de la tête (anneau nerveux). Le signal GFP est réduit à 30-50% de l’intensité initiale (AxioImager Z2; objectif: 40x, ouverture numérique 0,75; 30% puissance luminescente de la source d’éclairage fluorescent (FI illumination System X-Cite 120 XL FL PC, lampe halogène métallique 120W) et iris entièrement ouvert). L’intensité moyenne des pixels de récupération de la fluorescence est mesurée à des intervalles d’une heure. 20 animaux ont été quantifiés par souche dans chacune des trois expériences indépendantes. Les données représentent la moyenne S.E.M., ***P < 0,05, nonapparié t-test. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Réactif | Recette | |
| 2% coussinets Agarose | 1. Peser 0,5 g o fagarose dans un bécher en verre cylindrique | |
| 2. Ajouter 25 mL de tampon M9 | ||
| 3. Chauffer au micro-ondes jusqu’à ce qu’il soit près de l’ébullition. Sortir, remuer avec une pointe de pipette et faire bouillir à nouveau. Répéter jusqu’à ce que l’agarose soit dissoute. | ||
| 4. Placez une lame de microscope vide sur le banc. | ||
| 5. Déposer une goutte (~ 50 μL) de solution agarose fraîche de 2% au milieu de la glissière. | ||
| 6. Prenez une deuxième lame de microscope et placez-la sur la goutte d’agarose. Appuyez doucement vers le bas pour aplatir la goutte. | ||
| 7. Laissez l’agarose durcir pendant 30 secondes et retirez doucement la lame du microscope supérieur. | ||
| 8. Procéder immédiatement à la préparation de l’échantillon, puisque les coussinets d’agarose commenceront à sécher dans un délai d’environ 5 minutes. | ||
| Conseil : Laissez la lame du microscope supérieur comme couvercle pour préserver l’humidité plus longtemps (~ 1 heure). Ainsi, plusieurs coussinets d’agarose peuvent être préparés et utilisés rapidement pendant les expériences. | ||
| Milieu liquide LB | 1. Dissoudre 10 g de Bactotryptone, 5 g d’extrait de levure de Bacto, 5 g de NaCl dans 1 L d’eau distillée et d’autoclave. | |
| Tampon M9 | 1. Dissoudre 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, et 5 g de NaCl dans 1 L d’eau distillée et d’autoclave. | |
| 2. Laisser refroidir et ajouter 1 mL de 1 M MgSO4 (stérile). | ||
| 3. Stocker le tampon M9 à 4 °C. | ||
| Plaques d’agar de milieu de croissance de nématode (NGM) | 1. Mélanger 3 g de NaCl, 2,5 g de bactopeptone, 0,2 g de streptomycine, 17 g d’agar et ajouter 900 mL d’eau distillée. Autoclave. | |
| 2. Laisser refroidir à 55-60 °C. | ||
| 3. Ajouter 1 mL de solution de stock de cholestérol, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de solution de stock de nystatine, 25 mL de tampon stérile de phosphate de 1 M, pH 6.0, et l’eau stérile distillée jusqu’à 1 L. | ||
| 4. Pipette 10 mL de milieu par plat Petri et laisser se solidifier. | ||
| 5. Conserver les plaques à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées. | ||
Tableau 1 : Recettes recommandées pour les réactifs utilisés. Toutes les recettes de réactifs utilisées dans le protocole présenté sont décrites ici.
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Discussion
La modulation de synthèse protéique est essentielle à l’homéostasie organisationnelle. Pendant le vieillissement, la synthèse globale ainsi que spécifique des protéines est perturbée. Des études récentes révèlent que l’équilibre de traduction de protéine contrôle directement la sénescence et le vieillissement n’est pas simplement un sous-produit du processus de vieillissement. En particulier, les composants de base des machines de traduction tels que le facteur d’initiation eucaryote 4E (eIF4E), qui facilite le plafonnement de l’ARNm lors de l’initiation à la traduction, et donc le taux de traduction des protéines dépendantes du plafond, induit un stress oxydatif et accélère le processus de vieillissement1. En outre, les neurones spécifiques EDC-3, qui interagit avec les organismes de traitement de l’ARNm, les corps P et augmente le taux de décapptage de l’ARNm, accélère également le processus de vieillissement8. Plus précisément, la suppression d’EDC-3 permet la séquestration de l’IFE-2 dans les corps P, réduisant en fin de compte les niveaux de traduction des protéines, retardant le vieillissement neuronal9.
Frap est une technique initialement développée pour étudier la dynamique des protéines, la localisation, les interactions et l’activité avec le marquage fluorescent non invasif à l’aide de l’imagerie vivante in vivo, ce qui en fait un outil puissant pour étudier les taux de synthèse des protéines en temps réel8,10. Toutefois, certaines étapes critiques nécessitent une attention et un dépannage. Nous fournissons des solutions alternatives à ces obstacles potentiels ou limitations rencontrées au cours de la procédure expérimentale.
Un problème concerne le mouvement des vers car le ver peut échapper à la source lumineuse pendant le photobleaching. Ce problème peut être partiellement surmonté en utilisant l’animal transgénique exprimant l’allèle rol-6(su1006), qui provoque les animaux à se déplacer d’une manière sinusoïdale. De cette façon, le photobleaching animal peut être effectué en continu. En outre, l’expérimentateur peut suivre le mouvement du ver qui se déplace à l’extérieur du plan de vue beaucoup plus lent. Néanmoins, les tampons agar peuvent également être utilisés comme une alternative à l’immobilisation complète des animaux.
La durée optimale du photobleaching est un facteur critique supplémentaire qui doit être déterminé et maintenu stable tout au long des expériences. Un photobleaching insuffisant en raison d’un photobleaching non ciblé ou d’une courte durée peut être rencontré. Cela peut être dépassé en augmentant a) l’objectif de grossissement et l’ouverture numérique, b) l’intensité lumineuse et/ou (c) la durée de photobleaching.
Si aucune récupération significative de fluorescence n’est détectée, il y a des paramètres potentiels qui peuvent être modifiés. Si le photobleaching est excessif, réduisez la durée du photobleaching à mesure que des dommages au spécimen se sont produits. Les dommages causés au ver peuvent être évalués en observant les traits de vie tels que la sensibilité au toucher, la locomotion, la ponte, le pompage pharyngé et la capacité de reproduction. Si la cinétique de la récupération de la traduction des protéines est lente, prévoyez une période de récupération plus longue. La récupération de synthèse de protéines varie entre les différentes familles de protéines et dépend de la longueur7des fusions de reporter.
L’activité du promoteur pourrait influencer la cinétique de la synthèse des protéines. Si le promoteur est inactif pendant la récupération, modifiez le promoteur utilisé. L’activité du promoteur peut être modifiée en fonction des conditions de stress, comme le photodamage. Utiliser des promoteurs d’activités stables pour surveiller les muscles globaux (p. ex. let-858, ife-2, sod-3)ou spécifiques aux tissus (p. ex. muscles de la paroi corporelle; myo-3, unc-54; pharynx: myo-2; pan-neuronal: unc-119, rab-3; neurones mécanosensoriels : mec-4; intestin: vha-6, ges-1) taux de traduction des protéines.
Si l’inhibition inadéquate de la traduction des protéines par cycloheximide se produit, l’augmentation du temps de pré-incubation des nématodes permettrait de surmonter ce problème. Une mise en garde qui devrait être prise en considération est l’utilisation de vers transgéniques surexprimant les protéines. L’utilisation de nématodes transgéniques générés par CRISPR/Cas9 exprimant les protéines fluorescentes marquées d’intérêt aux niveaux physiologiques fournira une image plus précise de la cinétique protéique et du chiffre d’affaires.
Les niveaux totaux de protéines détectés sont le résultat de leurs taux de dégradation et de synthèse des protéines. La dégradation des protéines se produit invariablement à des niveaux basaux dans toutes les cellules eucaryotes. Ainsi, les taux de récupération de fluorescence des protéines, qui sont mesurés dans ce protocole, ne sont pas absolus, mais par rapport aux conditions comparées. Essentiellement, la récupération de fluorescence en présence de la dégradation des protéines est mesurée. Par conséquent, on suppose que toutes les conditions ont des taux égaux de dégradation des protéines après le photobleaching. Afin de mesurer les taux absolus de traduction des protéines, il convient d’utiliser des souches de vers mutants déficientes en dégradation de protéines. Plus précisément, les mutations dans des gènes tels que rpn-10 du protéasome ou lgg-2 pour l’autophagie peuvent être utilisées comme un contrôle11. Alternativement, RNAi knockdown des protéines protéasomales et autophagiques peuvent être effectuées. En outre, les substrats autophagiques tels que SQST-1::GFP peuvent être utilisés pour détecter la contribution de la dégradation autophagique dans les conditions expérimentales sélectionnées12.
Dans les deux contextes expérimentaux, cette technique frap est non radioactive, non invasive, qui détecte les taux de synthèse des protéines de novo in vivo dans différents tissus de C. elegans. Il permet l’imagerie en direct avant et pendant le photobleaching dans un cadre in vivo et la surveillance ultérieure des animaux pour toute leur vie. La perturbation de l’initiation à la traduction ralentit le vieillissement, ce qui mesure les taux globaux de synthèse des protéines par le FRAP pourrait être utilisé comme une lecture directe du processus de vieillissement. Ce protocole peut être optimisé et utilisé à plus grande échelle pour examiner les gènes et/ou les produits chimiques liés au processus de vieillissement ou à la maladie liée à l’âge. Alternativement, les taux totaux ou spécifiques de dégradation des protéines peuvent être mesurés par photobleaching sous différents milieux génétiques en utilisant le même protocole en combinaison avec le cycloheximide. Comme la traduction des protéines est inhibée par le cycloheximide, le taux de dégradation des protéines sera détecté. Ce protocole aidera à mieux comprendre les voies de dégradation des protéines dans les modèles génétiques des maladies d’agrégation de protéines13.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions Chaniotakis M. et Kounakis K. pour l’enregistrement vidéo et le montage. K.P. est financé par une subvention de la Fondation hellénique pour la recherche et l’innovation (HFRI) et du Secrétariat général de la recherche et de la technologie (GSRT). N.T. est financé par des subventions du Conseil européen de la recherche (ERC – GA695190 – MANNA), des programmes-cadres de la Commission européenne et du ministère grec de l’Éducation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
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