Summary
Her introduserer og beskriver vi en ikke-radioaktiv og ikke-invasiv metode for å vurdere de novo proteinsyntese in vivo, ved hjelp av nematoden Caenorhabditis elegans og fluorescens utvinning etter fotobleaching (FRAP). Denne metoden kan kombineres med genetiske og/eller farmakologiske skjermer for å identifisere nye modulatorer av proteinsyntese.
Abstract
Opprettholde en sunn proteome er avgjørende for celle og organisme homeostase. Perturbasjon av balansen mellom proteinoversettelseskontroll og nedbrytning instigates en rekke aldersrelaterte sykdommer. Nedgang av proteostase kvalitetskontroll mekanismer er et kjennetegn på aldring. Biokjemiske metoder for å oppdage de novo proteinsyntese er fortsatt begrenset, har flere ulemper og kan ikke utføres i levende celler eller dyr. Caenorhabditis elegans, å være gjennomsiktig og lett genetisk modifisert, er en utmerket modell for å overvåke proteinsyntese priser ved hjelp av bildeteknikker. Her introduserer og beskriver vi en metode for å måle de novo proteinsyntese in vivo ved hjelp av fluorescensgjenvinning etter fotografering (FRAP). Transgene dyr som uttrykker fluorescerende proteiner i bestemte celler eller vev bestråles av en kraftig lyskilde som resulterer i fluorescens fotobleaching. I sin tur betyr vurdering av fluorescensutvinning ny proteinsyntese i celler og/eller vev av interesse. Derfor kan kombinasjonen av transgene nematoder, genetiske og/eller farmakologiske inngrep sammen med levende avbildning av proteinsynteserater kaste lys over mekanismer som medierer aldersavhengig proteostasekollaps.
Introduction
Proteinsyntese og nedbrytning er avgjørende for organismes homeostase. En rekke aldersrelaterte sykdommer er instigated av defekt proteinproduksjon1,2. For å måle globale proteinoversettelsesrater er det biokjemiske teknikker som ribosomal profilering, som innebærer dyp sekvensering av ribosombeskyttede mRNA-fragmenter for å overvåke uttrykk samt ny proteinsyntese3. Denne metoden, foruten å være en indirekte avlesning av translasjonelle priser, da økt RNA-tilknytning til ribosomer ikke nødvendigvis betyr økt oversettelse, har tekniske ulemper, for eksempel høye kostnader og et krav om en stor mengde startmateriale. På den annen side tillater proteomikkbaserte metoder direkte proteinkvantifisering ved puls metabolsk profilering etterfulgt av massespektrometrianalyse4,5. Dette er imidlertid en semi-kvantitativ tilnærming med begrenset temporal oppløsning som ikke lett kan brukes in vivo. Videre kan merking av proteinet være ulikt fordelt i dyr / vev av interesse. Viktigere, begge disse metodene kan skjule vevsspesifikke eller cellespesifikke variasjoner i proteinoversettelsesrater hos henholdsvis hele dyr eller vev.
Caenorhabditis elegans er en brukervennlig modell organisme som kan dyrkes i stort antall6. I tillegg, sin genetiske mottagelse og åpenhet tillate levende imaging in vivo. Denne protokollen beskriver metodikken for å oppdage proteinsyntesehastigheter ved hjelp av fluorescensgjenoppretting etter fotografering (FRAP). Vi drar nytte av det transgene uttrykket av fluorescerende proteiner, enten i hele organismen eller i spesifikke vev / celler. Transgene dyr kan enten uttrykke GFP ved hjelp av promoter av et gen, som er mye / globalt uttrykt eller en vevsspesifikk promotor for å målrette bestemte celletyper. Denne teknikken kan utvides til en bestemt promotor for å undersøke proteinsynteserater av et bestemt protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Både transkripsjons- og translasjonelle fusjoner med fluoroforer kan brukes til å evaluere de novo proteinoversettelse i flere vev. Proteinsyntese priser kan vurderes for flere protein familier som lokalisert i ulike cellulære rom, inkludert cytoplasma, mitokondrier og kjerne7. Følgende stammer brukes til å overvåke globale og nevronale proteinsynteserater, N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2 (ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3 (ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. Vedlikehold, synkronisering og fremstilling av transgene nematoder for overvåking av de novo proteinsyntese
- Bruk et dissekeringsteromicroscope for å vurdere utviklingsstadier og vekst av vill type (wt) og muterte transgene nematoder.
- Dag 1: Bruk en ormplukk til å velge og overføre 10 L4 larver av wt og muterte transgene dyr som bærer den ønskede fluorescerende reporteren på Nematode Growth Media (NGM) plater seeded med Escherichia coli (OP50) (Tabell 1).
- Gjør en orm plukke ved å feste en platina wire inn i den koniske enden av et glass Pasteur pipette ved å smelte glasset på kontaktstedet på en Bunsen brenner. Deretter flater du enden av platinaledningen inn i en slikkepottform ved hjelp av et hvilket som helst verktøy (f.eks. pincer eller lys hammer).
- Inokuler en enkelt koloni av E. coli (OP50) bakterier i en kolbe som inneholder 50 ml Luria-Bertani (LB) flytende medium og vokser i 10 timer ved 37 ° C i en risting inkubator (200 rpm; Tabell 1). Deretter frø NGM plater med 200 μL bakteriell kultur. Inkuber de seedede platene ved romtemperatur over natten for å tillate veksten av bakteriell plen.
- Inkuber og vokse nematodene ved standardtemperatur på 20 °C.
- Dag 5: Platene inneholder en blandet populasjon av transgene ormer. Velg og overfør 15 L4 larver av hver stamme på nyseedede OP50-NGM plater.
- Dag 6: Utfør FRAP-analyse og overvåk proteinsyntesefrekvensen på dag 1 i voksen alder.
- Forbered og bruk cykloheximid som inneholder NGM plater som en positiv kontroll:
MERK: Klargjør en lageroppløsning av cykloheximid ved å fortynne i vann til en konsentrasjon på 10 mg/ml. Hold lagerløsning ved 4 °C.- Drep bakterier ved å utsette de seedede NGM-platene i 15 minutter med UV-lys (222 μW/cm2 intensitet).
- Tilsett cykloheximid på toppen av bakterielle sådd plater til 500 μg / ml endelig konsentrasjon i agarvolumet.
- La platene tørke ved romtemperatur i 30 minutter.
- Overfør transgene nematoder som uttrykker psod-3GFP på kjøretøy og cykloheximidholdige plater.
- Inkuber dyr i 2 timer ved standardtemperatur på 20 °C.
2. FRAP-analyse ved hjelp av transgene dyr som uttrykker somatiske vevsreportere pife-2GFP og psod-3GFP
MERK: Overvåk den globale proteinsyntesehastigheten i hele dyrekroppen. Disse transkripsjonsreporterne presenterer forskjellige uttrykksnivåer og uttrykkes allestedsnærværende i flere somatiske vev, inkludert tarm, svelg og kroppsveggmuskler.
- Plukk og overfør 1-dagers-voksen transgene dyr til individuelle NGM plater seeded med en 20 μL OP50 dråpe i midten.
- Fjern lokket og plasser hver plate under et 20x objektivobjektiv av et epifluorescencemikroskop.
- Fokuser og ta et referansebilde før fotobleaching (pre-blekemiddel).
- Photobleach hver prøve i 10 minutter.
MERK: Stopp fotoblen når det fluorescerende signalet slukkes til 30 – 50 % intensitet i forhold til bildet som er forbleking. Lysintensiteten og varigheten av blekingsperioden bør justeres tilsvarende for den spesifikke fluorofor, dyrestadiet og cellen eller vevet som er under undersøkelse. Riktig varighet av bestråling som kreves for å nå et tilstrekkelig grad av fotobleaching, for forskjellige prøver bør være eksperimentelt bestemt. - Ta et bilde etter fotografering (blekemiddel).
- Hold dyr i individuelle NGM plater og la dem gjenopprette.
- Bilde og registrere utvinning av hver fluorescerende reporter hver 1 time i minst 6 timer på en fluorescens stereomicroscope.
- Du kan også utføre fluorescerende restitusjonsvurdering ved hjelp av et epifluorescence-mikroskop (f.eks. AxioImager Z2).
- Nøye vurdere dyrehelsen per dyr ved å overvåke bevegelse, berøringsfølsomhet, reproduktiv kapasitet og overlevelse i løpet av de neste 3 dagene. Nematoder som viser tegn på skade etter fotobleaching ble utelukket fra videre analyse.
3. Montere prøvene og utføre FRAP-analyse ved hjelp av transgene nematoder som uttrykker pan-neuronally cytoplasmatisk GFP, punc-119GFP
MERK: Overvåk panneuronalt proteinsyntese ved målrettet fotobleaching i hodeområdet, der nerveringen ligger.
- Forbered 2% agarose pads.
- Legg til en 10 μL dråpe M9-buffer i midten av agaroseputen.
- Overfør 5 transgene nematoder som uttrykker pan-neuronally cytoplasmatisk GFP til en dråpe M9 buffer.
- Bruk et øyenvippe til å spre væsken.
MERK: Dyr viser reduserte bevegelser innen 2 minutter på grunn av M9-absorbans i agaren. - Endre nematodeposisjon for å unngå overlapping ved hjelp av en "øyenvippe" plukke.
- Plasser prøven under et 40x objektivt objektiv av et epifluorescencemikroskop.
MERK: Ikke bruk en dekkslipp. - Fokuser og ta et referansebilde (pre-blekemiddel).
- Photobleach det målrettede interesseområdet i 90 sekunder.
MERK: Stopp fotoblen når det fluorescerende signalet slukkes til 30 – 50 % intensitet i forhold til bildet som er forbleking. Lysintensiteten og varigheten av blekingsperioden bør justeres tilsvarende for den spesifikke fluorofor, dyrestadiet og cellen eller vevet som er under undersøkelse. Riktig varighet av bestråling som kreves for å nå et tilstrekkelig grad av fotobleaching, for forskjellige prøver bør være eksperimentelt bestemt. - Ta et bilde etter fotografering (blekemiddel).
- Legg til en 10 μL dråpe M9-buffer på fotobleached nematoder.
- La dyrene komme seg i 5 minutter.
- Bruk "øyenvippe" plukke eller en pipette for å overføre nematodene til individuelle NGM plater seeded med 20 μL OP50 slipp i midten.
- Ta et bilde av hver prøve hver 1 time under et epifluorescence stereomikroskop.
MERK: Telle t = 0 for gjenopprettingstiden etter fotobleaching.
4. Dataanalyse av bilder tatt under FRAP-analysen
- Analyser de kjøpte bildene ved hjelp av programvare (f.eks. Fiji).
- Åpne bilder med programvaren.
- Velg kommandoen Del kanaler via rullegardinmenyen Bilde og Farge.
MERK: Behold det grønne kanalbildet. - Bruk frihåndsvalgverktøyet til å stille inn det fluorescerende interesseområdet manuelt (f.eks. hele kroppen, hodet, tarmen).
- Velg Kommandoen Måling via analyser-rullegardinmenyen for å måle gjennomsnittlig pikselintensitet for interesseområdet for hvert tidspunkt.
MERK: Prosentandelen av fluorescensgjenoppretting beregnes ved hjelp av referansebildene som er tatt etter fotobleaching.
5. Rapport statistisk analyse
- Bruk minst 20 – 25 nematoder av hver belastning og/eller tilstand.
MERK: Tre biologiske replikeringer skal utføres. - Utfør studenttest(sammenligning mellom to grupper) eller ANOVA (sammenligning mellom flere grupper) for statistisk analyse med P < 0,05 som signifikant ved hjelp av statistisk analyseprogramvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, ble villtype og muterte transgene nematoder som uttrykker følgende somatiske reportere, pife-2GFP, psod-3GFP og punc-119GFP, brukt til å vurdere proteinsyntesehastigheter i henhold til de respektive protokollene.ife- Spesielt ble villtype og ife-2 muterte ormer som uttrykker cytoplasmatisk GFP gjennom hele somatiske vev ved hjelp av ife-2-arrangøren sammenlignet før, umiddelbart etter fotobleaching og 5 timer etter gjenoppretting. Representative bilder og kvantifisering viser at ville dyr fullt ut gjenopprette mens ife-2 mutanter har redusert utvinning kapasitet (Figur 1A). Dermed, vill type ormer initiere de novo protein biosyntese etter fotobleaching mens ormer mangler mRNA oversettelse initiering faktor IFE-2 er ikke i stand til å gjøre det, noe som indikerer at frekvensen av fluorescens utvinning illustrerer frekvensen av proteinsyntese in vivo7. Videre kan cykloheximid, en bestemt hemmer av mRNA-oversettelse, brukes som en positiv kontroll for proteinoversettelseshemming. Faktisk, cycloheximide-behandlet transgene dyr uttrykker cytoplasmatisk GFP under sod-3 promotor, ikke gjenopprette sin fluorescens ved fotobleaching (Figur 1B).
Vi brukte også denne metoden for å oppdage hvordan mRNA behandlingsorganer (P organer) påvirker frekvensen av proteinoversettelse8. Vill type og edc-3 (ok1427) mutant nematoder som uttrykker GFP pan-neuronally ble undersøkt for deres utvinning kapasitet ved målrettet fotobleking på hodet regionen. Fluorescens utvinning er mye tregere i EDC-3 mangelfulle dyr sammenlignet med vill type (Figur 1C). Dette indikerer at EDC-3-mediert mRNA-omsetning hindrer ny proteinsyntese og til slutt undertrykker proteinoversettelsesinitiering9.
Figur 1: In vivo vurdering av de novo proteinsyntese i C. elegans. (A) FRAP analyse i både vill type og IFE-2 mangelfulle nematoder uttrykker cytoplasmatiske GFP under arrangør av ife-2. Transgene dyr blir utsatt for fotobleaching av hele dyr. GFP-signalet reduseres til 30-50 % av den opprinnelige intensiteten. Fluorescens registreres før fotobleaching (pre-blekemiddel), etter slutten av fotobleaching perioden (10 min; blekemiddel) og 5 timer etter utvinning. (B)Cycloheximide behandling hemmer fluorescens utvinning av transgene dyr uttrykker cytoplasmatisk GFP under fremme av sod-3. Transgene dyr blir utsatt for hele dyr fotobleaching. GFP-signalet reduseres til 30-50 % av den opprinnelige intensiteten. Fluorescens registreres før fotobleaching (pre-blekemiddel), etter slutten av fotobleaching perioden (10 min; blekemiddel) og 5 timer etter utvinning (A, B: AxioImager Z2 mikroskop; objektiv linse: 20x, numerisk blenderåpning 0,8; høyeffekts lyskilde, HBO 100; 100 Watt kvikksølvbuelampe; eksitasjon / utslipp filter sett, Zeiss Sett 38 Endow GFP skift gratis). Vektstenger, 500μm. (C) EDC-3 mangelfulle nematoder viser redusert de novo proteinsyntese priser i nevronale celler. Fluorescenssignal av både vill type og edc-3 (ok1427) dyr som uttrykker pan-neuronally cytoplasmatisk GFP måles før fotobleaching (pre-blekemiddel) samt etter fotobleaching perioden (90sec; blekemiddel). Transgene dyr blir utsatt for fotobleaching i hodeområdet (nervering). GFP-signalet reduseres til 30-50 % av den opprinnelige intensiteten (AxioImager Z2; objektivobjektiv: 40x, numerisk blenderåpning 0,75; 30 % selvlysende effekt av lysstoffets belysningskilde (FI-belysningssystem X-Cite 120 XL FL PC, 120 W halogenidlampe i metall) og fullt åpnet iris). Gjennomsnittlig pikselintensitet av fluorescensgjenoppretting måles med en times tidsintervaller. 20 dyr ble kvantifisert per belastning i hvert av tre uavhengige eksperimenter. Data representerer gjennomsnittlig S.E.M., ***P < 0,05, unpaired t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagent | Oppskrift | |
| 2% Agarose pads | 1. Vei 0,5 g o fagarose i et sylindrisk glassbeger | |
| 2. Legg til 25 ml M9-buffer | ||
| 3. Varm i en mikrobølgeovn til den er nær koking. Ta ut, rør med en pipettespiss og kok igjen. Gjenta til agarose er oppløst. | ||
| 4. Plasser et tomt mikroskopsklie på benken. | ||
| 5. Sett en dråpe (~ 50 μL) med frisk 2% agarose løsning i midten av lysbildet. | ||
| 6. Ta et nytt mikroskopsklie og plasser det på toppen av agarose-dråpen. Trykk forsiktig ned for å flate dråpen. | ||
| 7. La agaroseherdet i 30 sekunder og fjern forsiktig det øverste mikroskopet lysbildet. | ||
| 8. Fortsett umiddelbart med prøvepreparatet, siden agaroseputene vil begynne å tørke innen ca. 5 minutter. | ||
| Tips: La det øverste mikroskopet gli som et deksel for å bevare fuktigheten lenger (~ 1 time). Dermed kan flere agarose pads tilberedes og brukes raskt under forsøkene. | ||
| LB flytende medium | 1. Løs opp 10 g Bactotryptone, 5 g Bacto Gjærekstrakt, 5 g NaCl i 1 L destillert vann og autoklav. | |
| M9 buffer | 1. Løs opp 3 g KH2PO4,6 g Na2HPO4og 5 g NaCl i 1 L destillert vann og autoklav. | |
| 2. La avkjøles og tilsett 1 ml 1 M MgSO4 (steril). | ||
| 3. Oppbevar M9-bufferen ved 4 °C. | ||
| Nematode vekst medium (NGM) agar plater | 1. Bland 3 g NaCl, 2,5 g bactopepton, 0,2 g streptomycin, 17 g agar og tilsett 900 ml destillert vann. Autoklav. | |
| 2. La avkjøles til 55-60 °C. | ||
| 3. Tilsett 1 ml kolesterol lagerløsning, 1 ml 1 M CaCl2,1 ml 1 M MgSO4, 1 ml nystatin lagerløsning, 25 ml steril 1 M fosfatbuffer, pH 6.0 og destillert sterilt vann opp til 1 L. | ||
| 4. Pipette 10 ml medium per petriskål og la det stivne. | ||
| 5. Oppbevar platene ved 4 °C til de brukes. | ||
Tabell 1: Anbefalte oppskrifter for reagenser som brukes. Alle reagensoppskrifter som brukes i den presenterte protokollen er skissert her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteinsyntesemodulasjon er avgjørende for organismes homeostase. Under aldring er global så vel som spesifikk proteinsyntese perturbed. Nyere studier viser det faktum at protein oversettelse balanse direkte styrer senescence og aldring er ikke bare et biprodukt av aldringsprosessen. Spesielt kjernekomponenter i oversettelsesmaskineriet som eukaryotisk initieringsfaktor 4E (eIF4E), som letter mRNA-capping under oversettelsesinitiering, og dermed frekvensen av cap-avhengig proteinoversettelse, induserer oksidativt stress og akselerereraldringsprosessen 1. Videre, neuron-spesifikk EDC-3, som samhandler med mRNA behandlingsorganer, P organer og øker frekvensen av mRNA decapping, akselererer også aldringsprosessen8. Spesielt tillater EDC-3 undertrykkelse IFE-2 sekvestrasjon i P-organer, og reduserer til slutt proteinoversettelsesnivåer, forsinker nevronalaldring 9.
FRAP er en teknikk som opprinnelig ble utviklet for å undersøke proteindynamikk, lokalisering, interaksjoner og aktivitet med ikke-invasiv fluorescerende merking ved hjelp av levende bildebehandling in vivo, noe som gjør det til et kraftig verktøy for å studere proteinsyntesehastigheter isanntid 8,,10. Det er imidlertid visse kritiske trinn som krever oppmerksomhet og feilsøking. Vi tilbyr alternative løsninger på disse potensielle hindringene eller begrensningene som oppstår under eksperimentell prosedyre.
Et problem gjelder ormbevegelse da ormen kan unnslippe lyskilden under fotografering. Dette problemet kan delvis overvinnes ved hjelp av transgene dyr som uttrykker rol-6 (su1006) allele, noe som fører til at dyr beveger seg på en sinusformet måte. På denne måten kan fotografering av dyr utføres kontinuerlig. Videre kan eksperimentereren følge bevegelsen av ormen som beveger seg utenfor visningsplanet mye langsommere. Likevel kan agarputer også brukes som et alternativ for å fullstendig immobilisere dyr.
Den optimale varigheten av fotografering er en ekstra kritisk faktor som bør bestemmes og holdes stabil gjennom forsøkene. Det kan ikke oppstå utilstrekkelig fotografering på grunn av umålrettet fotobleaching eller kort varighet. Dette kan overgås ved å øke (a) forstørrelsesmålet og numerisk blenderåpning, (b) lysintensiteten og/eller (c) fotobleaching-varigheten.
Hvis det ikke oppdages noen signifikant fluorescensgjenoppretting, er det potensielle parametere som kan endres. Hvis fotobleaching er overdreven, redusere fotobleaching varighet som prøveskade har oppstått. Skade på ormen kan vurderes ved å observere livstrekk som berøringsfølsomhet, bevegelse, egglegging, svelgpumpe og reproduktiv kapasitet. Hvis kinetikk av protein oversettelse utvinning er treg, tillate lengre utvinning periode. Proteinsyntese utvinning varierer mellom ulike protein familier og avhenger av reporter fusjoner lengde7.
Promoter aktivitet kan påvirke kinetikk av proteinsyntese. Hvis arrangøren er inaktiv under gjenoppretting, endrer du arrangøren som brukes. Promoteraktivitet kan endres på stressforhold, for eksempel fotoskader. Bruk stabile aktivitetsarrangører til å overvåke enten globale (f.eks. la-858, ife-2, sod-3) eller vevsspesifikke (f.eks. kroppsveggmuskler; myo-3, unc-54; svelge: myo-2; pan-neuronal: unc-119, rab-3; mechanosensoriske nevroner: mec-4; tarm: vha-6, ges-1) protein oversettelse priser.
Hvis utilstrekkelig proteinoversettelseshemming av cykloheximid oppstår, vil økende pre-inkubasjonstid for nematodene overvinne dette problemet. En påminnelse som bør tas i betraktning er bruk av transgene ormer overuttrykkende proteiner. Bruk av CRISPR/Cas9-genererte transgene nematoder som uttrykker de fluorescerende taggede proteinene av interesse på fysiologiske nivåer, vil gi et mer nøyaktig bilde av proteinkinetikk og omsetning.
Totale proteinnivåer som oppdages er et resultat av deres proteinnedbrytning og syntesepriser. Protein nedbrytning forekommer alltid på basalnivåer i alle eukaryotiske celler. Dermed er proteinfluorescensgjenvinningshastigheter, som måles i denne protokollen, ikke absolutte, men i forhold til forholdene som sammenlignes. I hovedsak måles fluorescensutvinningen i nærvær av proteinnedbrytning. Derfor antas det at alle forhold har like proteinnedbrytningsrater etter fotografering. For å måle absolutte proteinoversettelseshastigheter, bør proteinnedbrytning-mangelfulle muterte ormstammer brukes. Spesielt kan mutasjoner i gener som rpn-10 av proteasom eller lgg-2 for autofagi brukes som en kontroll11. Alternativt kan RNAi knockdown av proteasomale og autofagiske proteiner utføres. I tillegg kan autofagiske substrater som SQST-1::GFP brukes til å oppdage bidraget fra autofagisk nedbrytning under eksperimentelle forhold valgt12.
I begge eksperimentelle innstillinger er denne FRAP-teknikken ikke-radioaktiv, ikke-invasiv, som oppdager de novo proteinsynteserater in vivo i forskjellige vev i C. elegans. Det gjør det mulig for levende avbildning før og under fotobleaching i en in vivo innstilling og påfølgende overvåking av dyrene for hele livet. Perturbasjon av oversettelse initiering avtar aldring, og dermed måle globale proteinsyntese priser av FRAP kan brukes som en direkte lesing av aldringsprosessen. Denne protokollen kan optimaliseres og brukes i større skala for å screene gener og / eller kjemikalier relatert til aldringsprosessen eller aldersrelatert sykdom. Alternativt kan totale eller spesifikke proteinnedbrytningsrater måles ved fotobleaching under forskjellige genetiske bakgrunner ved hjelp av samme protokoll i kombinasjon med cykloheximid. Som protein oversettelse er hemmet av cycloheximid, vil frekvensen av protein nedbrytning bli oppdaget. Denne protokollen vil bidra til bedre forståelse av proteinnedbrytningsveier i genetiske modeller av proteinaggregasjonssykdommer13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Chaniotakis M. og Kounakis K. for videoopptak og redigering. K.P. finansieres av et stipend fra Hellenic Foundation for Research and Innovation (HFRI) og Generalsekretariatet for forskning og teknologi (GSRT). N.T. er finansiert av tilskudd fra Det europeiske forskningsrådet (ERC – GA695190 – MANNA), Europakommisjonens rammeprogrammer og det greske kunnskapsdepartementet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, Pt A 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N.
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
