Summary
يحاول هذا البروتوكول إنشاء بروتوكول قابل للتكرار للخلايا العصبية الأولية وعزل غليا عن مثانة الفئران لإجراء المزيد من التجارب الخلوية.
Abstract
المسالك البولية السفلية لها وظيفتين رئيسيتين، وهما تخزين البول الدوري وmicturition. يتم التوسط في هذه الوظائف من خلال التنظيم العصبي المركزي والمحيطي. على الرغم من إجراء بحوث مستفيضة على الجهاز العصبي المسالك البولية السفلي, وقد ركزت معظم الدراسات على الثقافة الأولية. يقدم هذا البروتوكول طريقة لعزل وثقافة الخلايا العصبية المثانة وغليا من الفئران سبراغ داولي. في هذه الطريقة، تم احتضان الخلايا العصبية وغليا في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 5-7 أيام. ونتيجة لذلك ، نمت إلى أشكال ناضجة مناسبة للتجارب المناعية اللاحقة ذات الصلة. لوحظت الخلايا بشكل مورفولوجي باستخدام المجهر البصري. تم التعرف على الخلايا العصبية، الحويصلات متشابك، وغليا من قبل β-III-tubulin و MAP-2، سينابسين-1، و تلطيخ GFAP، على التوالي. وفي الوقت نفسه، تم إجراء الكيمياء المناعية على العديد من البروتينات ذات الصلة بالناقل العصبي، مثل أسيتيل ترانسفيراز الكولين، DYNLL2، وSLC17A9.
Introduction
المسالك البولية السفلية لها وظيفتين رئيسيتين: تخزين البول الدوري وmicturition1. يتحكم الجهاز العصبي السفلي للمسالك البولية (LUTNS) في هذه الوظائف وهو حساس وعرضة للعديد من الاعتلالات العصبية ، والتي يمكن أن تكون فطرية (البورفيريا) ، المكتسبة (مرض لايم) ، والثانوية لحالات المرض (اعتلال المثانة السكري) ، أو المخدرات الناجمة (التهاب المثانة النزفي) ، أو الجراحة الناجمة (استئصال البطن) ، أو الإصابة الناجمة(إصابةالحبل الشوكي الرضية) 2،3،4،5،6،7. في الدراسات الفسيولوجية / المرضية ، في الجسم الحي وفي المختبر التجارب لا تقل أهمية. بينما في الجسم الحي وقد أجريت البحوث على LUTNS في الجهاز, الخلوية, والمستويات الجزيئية لبعض الوقت, في المختبر البحوث على الخلايا العصبية الأولية من المثانة البولية غير موجود تقريبا8,9. وعلى الرغم من أن هذه الدراسة محدودة، إلا أننا نأمل في ريادة الأبحاث في هذا المجال حتى يتمكن باحثون آخرون من تحسينها. وبهذه الطريقة، قد تؤدي هذه الثقافة المشتركة إلى فهم خلوي للخلل الفسيولوجي في الأنماط الظاهرية، مثل خلل الخلايا العصبية في المثانة.
على النقيض من العضلات المعوية مع اتجاه واضح للخلايا العضلية في طبقات منفصلة ، فإن عضلات المثانة غيرمنظمة 10. لذلك ، بدلا من تقشير الطبقة الخارجية من المثانة ، تقترح هذه الطريقة هضم المثانة بأكملها لتقليل صعوبة التشغيل وتقصير وقت المعالجة المسبقة لمعدل بقاء الخلايا المرتفع.
بعد هذه الطريقة، يمكننا الحصول على ثقافة مختلطة من الخلايا العصبية وغيرها من الخلايا. الخلايا الأخرى لا غنى عنها لأن وجودها يحاكي بيئة في الجسم الحي11. وبالإضافة إلى ذلك، توفر هذه الخلايا المواد غير متوفرة في الوسط.
تتضمن هذه الطريقة خطوتين للهضم. أولا، يستخدم الكولاجين من النوع الثاني لتحلل الكولاجين، يليه تريبسين، لتفكيك الأنسجة إلى خلايا10. وبهذه الطريقة، يتم توزيع أنسجة المثانة في خلايا واحدة ومن ثم تنمو مستقلة نسبيا. عندما تنضج ثقافة الخلايا العصبية، يمكن استخدام الخلايا العصبية للتصوير أو المقايسات الوظيفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتمتثل جميع البروتوكولات التجريبية والإجراءات الحيوانية للمبادئ التوجيهية للمبدأ الأخلاقي للمجلس الوطني للبحوث.
1. إعداد المواد
- تعقيم جميع الأدوات وDDH2O باستخدام الأوتوكلاف قبل إجراء التجربة. وتشمل الأدوات على سبيل المثال لا الحصر المقص الجراحي، ومقص العيون، والملقط، ومقسم نواة الملاعق، والأطباق الزجاجية (قطرها 60-100 ملم)، وقواطع الزجاج.
- إعداد الحل كريبس على النحو التالي (الجدول 1): حل جميع المواد الكيميائية جنبا إلى جنب مع DDH2O قبل الاستخدام. حل CaCI2 بشكل منفصل وإضافة ببطء في حل مختلط في حين اثارة لتجنب الرواسب.
- إعداد وسائل الإعلام شطف، والذي يتكون من وسائل الإعلام F12 مع 10٪ مصل البقر الجنين (FBS) و 1٪ المضادات الحيوية / مضادات الذهان (100x). إضافة 5 مل من FBS و 0.5 مل من المضادات الحيوية / antimycotic إلى 44.5 مل من وسائل الإعلام F12.
- إعداد وسائل الإعلام العصبية A, الذي يتألف من وسائل الإعلام العصبية القاعدية مع 2٪ B-27, 1٪ FBS, 1٪ L-الجلوتامين, 1٪ مضاد حيوي / مضاد للميكويك (100x), و 0.1٪ عامل العصبية المشتقة من غليا (GDNF). إضافة 200 ميكرولتر من B-27، 100 ميكرولتر من FBS، 100 ميكرولتر من L-الجلوتامين، 100 ميكرولتر من المضادات الحيوية / مضادات العضلات (100x)، و 10 ميكروغرام من GDNF (10 ميكروغرام / مل) إلى 9.5 مل من وسائل الإعلام العصبية القاعدية A.
ملاحظة: إعداد الوسائط العصبية A في غضون أسبوع واحد من الاستخدام لضمان نضارة B-27، L-الجلوتامين وGDNF. - إعداد وسائل الإعلام الخلايا العصبية B باستخدام نفس الإجراء كما إعداد وسائل الإعلام العصبية A ولكن من دون إضافة FBS.
- إعداد حل الهضم 1 عن طريق حل 20 ملغ من نوع الكولاجينز الثاني، 6 ملغ من الألبومين مصل البقري، و 200 ميكرولتر من المضادات الحيوية / antimycotic (100x) في 10 مل من محلول كريبس مستقر الأكسجين.
- إعداد حل الهضم 2 عن طريق تخفيف 1 مل من 0.25٪ تريبسين مع 4 مل من محلول الملح المتوازن هانك.
- إعداد لوحة مع الأغطية المغلفة.
- استخدام ملقط في مقعد تدفق صفح عند وضع الأغطية الزجاجية في لوحة ثقافة 48 جيدا.
- تمييع بولي-د-ليسين مع DDH2O إلى تركيز 0.1 ملغم/مل كمخزن بولي-د-ليسين. قم بتخزين المخزون عند -20 درجة مئوية، ثم قم بإذابة الذوبان قبل الاستخدام.
- أضف 40 ميكرولتر من مخزون البولي-د-ليسين فوق كل غطاء، واحتضن المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: بالنسبة للوحات مختلفة ذات مناطق أساس مختلفة، قم بضبط التركيز إلى 4 ميكروغرام/سم2. على سبيل المثال، إذا كانت المنطقة القاعدية من بئر واحد من لوحة 24-جيدا هو 2 سم2،ثم ينبغي لنا نقل 80 ميكرولتر من مخزون البولي-د-ليسين في بئر. وسيحتوي كل سم2 على 4 ميكروغرام من البولي-د-ليسين. - إزالة بولي مد ليسين في لوحة 48 جيدا، وشطف coverlips مع ddH2O ثلاث مرات.
- قم بتجفيف اللوحة في غطاء تدفق صفح لمدة 30 دقيقة على الأقل لضمان أن اللوحة لا يلام.
- تخزين لوحة في 4 °C قبل طلاء صفح لمدة 1 يوم على الأكثر. تخزين اللوحة عند -20 درجة مئوية هو الأفضل للتخزين على المدى الطويل.
- ذوبان صفح في 4 °C. تمييع اللامينين مع ddH2O إلى تركيز 50 ميكروغرام / مل كما مخزون صفينين. تخزين المخزون في -20 درجة مئوية، وذوبان عند 4 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- استخدام ماصة لنقل 100 μL من صفمين المخفف إلى أعلى كل coverslip واحتضان لامينين في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: بالنسبة للوحات مختلفة ذات مناطق أساس مختلفة، قم بضبط التركيز إلى 5 ميكروغرام/سم2. على سبيل المثال، إذا كانت المنطقة القاعدية من بئر واحد من لوحة 24 بئرا 2 سم2،ثم نقل 200 ميكرولتر من صفيحة مخففة في بئر. كل سم2 سوف تحتوي على 5 ميكروغرام من اللامينين. - إزالة محلول صفح، وشطف coverslips مع DDH2O مرة واحدة. قم بإجراء هذه العملية على حافة غطاء الغطاء لتجنب الكشط.
ملاحظة: يمكن تخزين الأغطية المغلفة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين على الأكثر.
2. حصاد المثانة
- الحصول على الفئران سبراغ دولي البالغ من العمر خمسة أسابيع.
- غرس كاربوجين (95٪ أكسجين، 5٪ CO2)في محلول كريبس لمدة 30 دقيقة على الأقل في حمام جليدي للوصول إلى حالة الأكسجين المستقرة ومستوى درجة الحموضة.
- بعد القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم، نقع الفئران في الإيثانول 75٪ لمدة 30 s للتعقيم.
- ضع الفئران على منشفة جراحية معقمة وفضح بطنها. فتح تجويف البطن، وتكشف عن المثانة مع مجموعة من المقص والمملقط.
- رفع المثانة بلطف وقطع المثانة من عنق المثانة مع مجموعة أخرى من مقص والمملقط لتجنب التلوث المتبادل. ضع المثانة بسرعة في محلول كريبس البارد المستقر للأوكسجين لتحسين بقاء الخلية.
ملاحظة: بمجرد إزالة المثانة، قم بإجراء العمليات التالية بسرعة لتحسين احتمال بقاء الخلايا العصبية. - أضف محلول كريبس إلى ثلاثة أطباق زجاجية وقواطع زجاجية.
- إعداد الأطباق الزجاجية وقواطع الزجاج مع الحل كريبس في حمام الجليد لprecooling.
- وضع علامة على هذه الحاويات مع أرقام 1-3 المقابلة لمنع الارتباك.
- إقران كل طبق زجاجي مع ملقط ومقسم نواة الملاعق.
- في طبق زجاجي 1، وقطع فتح المثانة مع مقص العيون، وتكشف مع ملقط ومقسم نواة الملاعق.
- شطف المثانة في كسارة الزجاج 1، ووضعها في طبق زجاجي 2.
- القضاء على الدهون الملتصقة على سطح الأنسجة باستخدام ملقط ومقص العيون في طبق زجاجي 2.
- شطف المثانة في كسارة الزجاج 2، ووضعها في طبق زجاجي 3.
- كشط بلطف المثانة باستخدام ملقط ومقسم نواة الملاعق على طبق زجاجي 3 لإزالة المرفقات الخارجية.
- شطف المثانة في كسارة الزجاج 3، ونقل المثانة إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل مع 14 مل من محلول كريبس الباردة، وتدور العينة لمدة 1 دقيقة في 356 × ز و 4 درجة مئوية.
- كرر الخطوة السابقة مرتين في أنبوبين آخرين مع حل كريبس للحد من التلوث.
3. الهضم المثانة خطوتين
- نقل المثانة من أنبوب الطرد المركزي إلى قارورة 2 مل تحتوي على 1 مل من محلول الهضم 1. استخدم مقص العيون لقطع المثانة إلى قطع صغيرة (أصغر من 1 مم) في المحلول.
- اخلطي محلول المثانة مع 9 مل من محلول الهضم 1 في طبق زراعة الخلايا العقيمة (قطره 100 مم). إجراء عملية الهضم الخطوة 1 في حاضنة اهتزاز لمدة 1 ساعة تحت 5٪ CO2،37 درجة مئوية، و 200 دورة في الدقيقة.
- بعد الخطوة 1 الهضم، والطرد المركزي الحل في 356 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
- ضع محلول الهضم 2 في حمام مائي 37 درجة مئوية لتسخن.
- بعد الطرد المركزي، قم بإزالة المادة الفائقة التي تحتوي على محلول الهضم 1، وحصاد رواسب الخلية. يسمح ببعض السوائل المتبقية. قد يؤدي الإزالة الكاملة للحل إلى تعزيز فقدان الخلية.
- اخلطي رواسب الخلايا مع محلول الهضم الدافئ 2 في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل، وهزي الخليط أثناء الهضم في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. لا تتجاوز 7 دقائق من الخطوة 2 الهضم أو الخلايا العصبية سوف يهلك.
- بعد الهضم، على الفور تعطيل تريبسين في الخليط مع 10 مل من وسائل الإعلام شطف الباردة.
ملاحظة: تنفيذ الخطوات التالية عند 0 °C-4 °C. حمام جليدي يمكن أن يوفر مثل هذه الحالة. - حصاد رواسب الخلية بعد الطرد المركزي في 356 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. إزالة أكبر قدر ممكن من وسائل الإعلام لأن التريبسين المتبقية ضارة لنمو الخلية.
- Resuspend الرواسب مع 3 مل من وسائل الإعلام العصبية بلطف. تأكد من عدم توليد فقاعات الهواء في المحلول الذي يحتوي على خلايا لمعدل بقاء مرتفع.
- تصفية وسائط الخليط من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
- الحفاظ على filtrate على شاكر في 30 دورة في الدقيقة في حمام جليدي لمدة 30 دقيقة. هذه الخطوة ليست ضرورية ولكن يوصى بها.
- جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 356 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق، وإعادة تثبيت بلطف الكريات الخلية في 1 مل من وسائل الإعلام العصبية A.
- إضافة 500 ميكرولتر من خليط الخلية في كل بئر من لوحة 48 جيدا المعدة.
- خلايا الثقافة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- استبدال جميع وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام العصبية B في 1 ساعة لتوفير ثقافة خالية من المصل.
- تغيير نصف وسائط الخلايا العصبية B كل 3 أيام.
ملاحظة: الخلايا العصبية جاهزة للتجارب الكيميائية المناعية بعد 5-7 أيام من الثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في عملية ثقافة الخلية الأساسية، كانت الخلايا المكتسبة مستديرة مع حدود مشرقة وواضحة قبل الحالة المرفقة. مع نمو الخلايا العصبية، بدأت التشعبات والمؤوسات تكون متميزة. بعد 5-7 أيام من الثقافة، وصلت الخلايا العصبية إلى شكل ناضج مع توقعات طويلة، والتي كانت مثالية للتصوير أو دراسات الوظائف. على الرغم من أن معظم الشوائب وحطام الخلية يمكن إزالتها بسبب تغير وسائل الإعلام، كانت بعض بقايا تعلق على بولي-د-ليسين وطلاء صفح مرئية (الشكل 1).
بعد الثقافة السليمة، يمكن تحديد الخلايا العصبية عن طريق نموذجي β-III-توبولين و MAP-2المناعية 10،12. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحديد جليا على وجه التحديد عن طريق GFAPالمناعية 10. وضعت الخلايا العصبية الناضجة العمود الفقري متشابك, التي كانت قريبة من التخصصات presynaptic التي حددها المناعي من صانع البروتين متشابك, synapsin-1 (الشكل 2)12. وأشارت هذه النتائج إلى أن الخلايا الناضجة مع نقاط الاشتباك العصبي متطورة تم الحصول عليها من خلال هذه الطريقة. وتشير هذه النتيجة إلى دورها الهام في دراسات الوظائف المستقبلية.
وفي الوقت نفسه، تم التعرف على العديد من الأنواع الفرعية العصبية من خلال تجارب الكيمياء المناعية (الشكل 3). كانت الخلايا العصبية Peptidergic ، التي تحتوي على مختلف المبيدات العصبية ، ملطخة بالمناعة مع المادة P13. تم التعرف على الخلايا العصبية Purinergic مع ناقلات النيوكليوتيدات المركبات أعرب عن طريق SLC17A9تلطيخ 14. تم تصور الخلايا العصبية Nitrergic مع DYNLL-2، الذي يربط nNOS مع البروتينات الحركية في الخلايا العصبية15. وكانت الخلايا العصبية الكوليني تنشيط المناعة مع أسيتيل ترانسفيراسي الكولين16.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام التي يمكن أن صور تباين المرحلة للخلايا الأولية المعزولة عن ثقافة المثانة الفئران التي اتخذت في 1, 3, و 7 أيام بعد الطلاء (A, B, C, على التوالي). شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم ال صور immunofluorescence من الخلايا الأولية معزولة عن المثانة الفئران. أظهر تحليل المجهر Confocal تلطيخ بروتين الخلايا العصبية الخلوية (β-III-tubulin, RRID: AB_2827688, 1:200) في الخلايا العصبية الثقافة الأولية (A) وفي إعداد المثانة جبل كامل (B). في الخلايا العصبية الثقافة الأولية, الخلايا العصبية phosphoprotein immunostaining (MAP 2, RRID:AB_2827689, 1:200) كما تصور(C). تم التعرف على جليا عن طريق تلطيخ البروتين الحمضي الرجفان الدبقية (D; RRID: AB_627673، 1:50). تم تصور Synapsins عن طريق تلطيخ بروتين المشبك (Synapsin-1، RRID: AB_2798146، 1:200) في الخلوية (E) والأنسجة (F) المستويات. وكانت الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة على النحو التالي: اليكسا فلور 488 (الأخضر، الماعز المضادة للأرانب LGG، 1:200)، اليكسا فلور 555 (الأحمر، الماعز المضادة للفأرة lgG، 1:200). تم تصور النواة باستخدام Hoechst 33342 (A ، C ، D ، E؛ الأزرق ، 1 ميكروغرام / مل). شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 - الأرقام صور immunofluorescence من عدة أنواع فرعية من الخلايا العصبية الأولية. وكانت الخلايا العصبية Peptidergic مناعة مع مادة P (A; RRID: AB_785913، 1:50). تم تحديد الخلايا العصبية Purinergic عن طريق تلطيخ SLC17A9 (ب; RRID: AB_10597575، 1:200). تم تصور الخلايا العصبية Nitrergic عن طريق DYNLL-2 تلطيخ (C; RRID: AB_654147، 1:50). وكانت الخلايا العصبية الكولينية المناعية مع أسيتيل ترانسفيراسي الكولين (د; RRID: AB_2244867، 1:100). وكانت الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة على النحو التالي: اليكسا فلور 488 (الأخضر، الماعز المضادة للأرانب LGG، 1:200)، اليكسا فلور 555 (الأحمر، الماعز المضادة للفأرة lgG، 1:200). تم تصور النواة باستخدام Hoechst 33342 (A ، B ، C ، D، الأزرق ، 1 ميكروغرام / مل). شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المكونات | المولارية (mM) |
| نا سي آي | 120 |
| KCI | 5.9 |
| ناهكو3 | 25 |
| Na 2HPO4· 12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| الجلوكوز | 11.5 |
الجدول 1 - الجداول تكوين حل كريبس
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إعداد اللوحة
استخدام الأغطية الزجاجية في 6-، 12-، أو 48 جيدا لوحات الثقافة لتجارب التصوير المناعي أو الكالسيوم هو عملية اقتصادية وتجنيب العينة. تنمو الخلايا بشكل جيد في لوحات دون coverlips أثناء إعداد ثقافات الخلايا الأولية. لذلك ، يمكن الاستغناء عن الأغطية في التجارب ، مثل تفاعل سلسلة البوليميراز أو البوليميراز الغربي. وعلاوة على ذلك، طلاء هو خطوة ضرورية قبل الطلاء الخلايا، مع أو بدون coverlips. اللامينين وبولي د ليسين هي الخيارات الشائعة في طلاء الخلايا العصبية, لا سيما صفمين, وهو أمر ضروري لنمو الخلايا العصبية17.
إعداد وسائل الإعلام
بعد استبدال المتوسطة الأولى, عزل الخلية يتطلب وسائل الإعلام دون مصل لأن المصل يحفز انقسام الخلايا ويؤدي إلى مساحة محدودة زراعة الخلايا العصبية18. وبالتالي، فإن عوامل نمو الخلايا العصبية حاسمة. نوعية B27 و GDNF يمكن أن تختلف إلى حد كبير من دفعات مختلفة وتسبب تأثيرات كبيرة على نمو الخلايا العصبية19. ولذلك، من المستحسن التحقق من عدد كبير من وسائل الإعلام عندما تسفر الخلايا العصبية سيئة. وفي الوقت نفسه، فإن مخزون وسائل الإعلام الجديدة أمر بالغ الأهمية. يجب حساب المبلغ المطلوب وإعداده مسبقا في كل مرة قبل استبدال الوسائط.
الحيوانات
وتستخدم الفئران سبراغ دولي في هذه الطريقة. فئران C57BL/6 مقبولة أيضا في هذه التجربة. لذلك ، يمكن أيضا اعتماد سلالات أخرى من الفئران أو الفئران لهذه الطريقة على الرغم من بعض الاختلافات في مورفولوجيا ودوائر الخلايا العصبية. وفيما يتعلق بالنماذج الحيوانية المختلفة، ينبغي للباحثين وضع بروتوكول محسن ومستهدف. وعلاوة على ذلك، ينبغي دائما النظر في الحيوانات الصغيرة قبل تطبيق هذه الطريقة.
علاج الأنسجة
خلال التجارب، باستثناء عملية الهضم، والحفاظ على الأنسجة في درجة حرارة منخفضة أمر ضروري لزيادة صلاحية الخلية، والتي يمكن أن تقلل من استقلاب الخلايا وتجنب نقص الطاقة. مستويات الأكسجين, التغذية, وhh يمكن أن تؤثر أيضا على إنتاج الخلية11. علاوة على ذلك ، بالنسبة للأنسجة الأخرى ، نقترح أن يقوم الباحثون بإجراء هذه الطريقة مع حالة الهضم المعدلة.
ثقافة الخلية
سمة واحدة رائعة من الخلايا العصبية عند تلقيحها هو تمسكهم السريع لوحات المغلفة20. في هذه الحالة، ينصح تغيير وسائل الإعلام بعد 1 ساعة من الثقافة للحصول على نسبة عالية من الخلايا العصبية. وعلاوة على ذلك، عندما تبدأ معظم الخلايا في النمو pseudopodium، يمكن تقليل وتيرة تغيير وسائل الإعلام بشكل مناسب اعتمادا على لون وسائل الإعلام والدولة الخلوية. تعرض ثقافة الخلية الأساسية في حالة جيدة سوما سوداء مع حد مشرق.
معظم الخلايا العصبية المعزولة عن المثانة هي العقدة داخل المثانة ، والتي تتكون من ال الداخليات المفتونة والمهيجة للمثانة13. وعلاوة على ذلك، لا توجد عصابة الحوض الرئيسية موجودة في الأنسجة المحصودة. توزع تحت عنق المثانة21.
الحد
هذا هو بحث أولي لعزل وثقافة الخلايا العصبية وغليا. وقد بذلت محاولات عديدة، مثل معالجة السيتارابين أو الطرد المركزي المتدرجة للكثافة. ومع ذلك ، فإن نسبة الخلايا المطلوبة لا تزال غير مثالية ، وظهر المزيد من فقدان الخلايا. وعلاوة على ذلك، من المرجح أن تؤدي الظروف الهضمية التقليدية في هذا البروتوكول، مثل 37 درجة مئوية، إلى القضاء على بعض أنواع الخلايا العصبية الحساسة، وتسبب تعبيرات جينية محتملة22.
في الختام، يقدم هذا البروتوكول طريقة لثقافة الخلايا العصبية وغليا من المثانة الفئران. العزلة سهلة التكرار ، وفعالة من حيث الوقت ، وتنطوي على الحد الأدنى من التلوث الميكروبي. على الرغم من أن التحسين الذي يثير نقاء الخلايا العصبية ضروري ، نأمل أن تساهم هذه الطريقة في أبحاث LUTNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب كبير في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81673676) ومكتب دونغقوان للعلوم والتكنولوجيا (المنحة رقم 2019622101002). يشكر المؤلفون الدكتورة ماريروز سوليفان (أستاذة مساعدة في الجراحة، كلية الطب بجامعة هارفارد) على الاستشارات التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Golbidi, S., Laher, I.
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, Pt 9 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants - A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G.
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
