Summary
Dieses Protokoll versucht, ein wiederholbares Protokoll für primäre Neuronen und Gliaisolation von Rattenblase für weitere zelluläre Experimente zu etablieren.
Abstract
Die unteren Harnwege hat zwei Hauptfunktionen, nämlich regelmäßige Urinlagerung und Micturition; diese Funktionen werden durch zentrale und periphere Neuroregulation vermittelt. Obwohl umfangreiche Forschung über die unteren Harnwege Nervensystem durchgeführt wurde, die meisten Studien haben sich auf primärkultur konzentriert. Dieses Protokoll führt eine Methode zur Isolierung und Kultur von Blasenneuronen und Glia von Sprague-Dawley Ratten ein. Bei dieser Methode wurden die Neuronen und Glia in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator für 5–7 Tage inkubiert. Infolgedessen wuchsen sie zu ausgereiften Formen heran, die für verwandte nachfolgende Immunfluoreszenzexperimente geeignet waren. Die Zellen wurden mit einem optischen Mikroskop morphologisch beobachtet. Neuronen, synaptische Vesikel und Glia wurden durch β-III-Tubulin und MAP-2, Synapsin-1 bzw. GFAP-Färbung identifiziert. In der Zwischenzeit wurde die Immunzytochemie an mehreren Neurotransmitter-bezogenen Proteinen durchgeführt, wie Cholin-Acetyltransferase, DYNLL2 und SLC17A9.
Introduction
Der untere Harnweg hat zwei Hauptfunktionen: periodische Urinlagerung und Micturition1. Die unteren Harnwege Nervensystem (LUTNS) steuert diese Funktionen und ist empfindlich und anfällig für viele Neuropathien, die angeboren sein können (Porphyrie), erworben (Lyme-Krankheit), sekundär zu Krankheitszuständen (diabetische Zystopathie), medikamentös induziert (hämorrhagische Zystitis), Chirurgie verursacht (abdominoperinealresektion), oder Verletzungen verursacht (traumatische Rückenmarksverletzung)2,3,4,5,6. In physiologisch-pathologischen Studien sind In-vivo- und In-vitro-Experimente gleichermaßen wichtig. Während in vivo Forschung auf LUTNS wurde auf Organ-, zelluläre, und molekulare Ebene für einige Zeit durchgeführt, In-vitro-Forschung an primären Neuronen aus der Harnblase ist fast nicht existent8,9. Obwohl die vorliegende Studie begrenzt ist, hoffen wir, die Forschung in diesem Bereich voranzutragen, damit andere Forscher sie verbessern können. Auf diese Weise, Diese Co-Kultur kann zu einem zellulären Verständnis der physiologischen Dysfunktion in Phänotypen führen, wie Blase Neuron Dysfunktion.
Im Gegensatz zu enterischen Muskeln mit einer klaren Richtung der Muskelzellen in diskrete Schichten sind die Muskeln der Blase unorganisiert10. Anstatt die äußere Schicht der Blase abzuschälen, schlägt diese Methode daher vor, die gesamte Blase zu verdauen, um die Schwierigkeit des Betriebs zu reduzieren und die Vorverarbeitungszeit für eine hohe Zellüberlebensrate zu verkürzen.
Nach dieser Methode können wir eine gemischte Kultur von Neuronen und anderen Zellen erhalten. Die anderen Zellen sind unentbehrlich, da ihre Anwesenheit eine in vivo Umgebung imitiert11. Darüber hinaus liefern solche Zellen die Substanzen, die im Medium nicht verfügbar sind.
Diese Methode umfasst zwei Schritte für die Verdauung. Zunächst wird Kollagenase Typ II verwendet, um Kollagen zu hydrolysieren, gefolgt von Trypsin, um das Gewebe in Zellen10zu dissoziieren. Auf diese Weise werden Blasengewebe in einzelne Zellen dispergiert und wachsen dann relativ unabhängig. Wenn die Kultur der Neuronen reift, können die Neuronen für bildgebende oder funktionelle Assays verwendet werden.
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Protocol
Alle Versuchsprotokolle und Tierverfahren entsprachen den ethischen Grundsätzen des Nationalen Forschungsrates.
1. Herstellung von Materialien
- Sterilisieren Sie alle Instrumente und ddH2O mit einem Autoklaven, bevor Sie das Experiment durchführen. Zu den Instrumenten gehören u.a. chirurgische Schere, Augenscheren, Zangen, Löffelkernteiler, Glasschalen (60–100 mm Durchmesser) und Glasbrecher.
- Bereiten Sie die Krebs-Lösung wie folgt vor (Tabelle 1): Alle Chemikalien zusammen mit ddH2O vor gebrauchen auflösen. CaCI2 separat auflösen und unter Rühren langsam in die Mischlösung geben, um Sedimente zu vermeiden.
- Bereiten Sie die Spülmedien vor, die aus F12-Medien mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Antimykotika (100x) bestehen. Fügen Sie 5 ml FBS und 0,5 ml Antibiotikum/Antimykotik um 44,5 ml F12-Medien hinzu.
- Bereiten Sie neuronen Medien A, die neurobasale A-Medien mit 2% B-27, 1% FBS, 1% L-Glutamin, 1% Antimykotik (100x) und 0,1% Glia-abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF) umfasst. Fügen Sie 200 l B-27, 100 l FBS, 100 l L L-Glutamin, 100 l Antibiotikum/Antimykotik (100x) und 10 l GDNF (10 g/ml) bis 9,5 ml neurobaales A-Medium hinzu.
HINWEIS: Bereiten Sie Neuronenmedien A innerhalb einer Woche nach gebrauch, um die Frische von B-27, L-Glutamin und GDNF zu gewährleisten. - Bereiten Sie Neuronenmedien B mit dem gleichen Verfahren wie die Vorbereitung von Neuronenmedien A vor, ohne jedoch FBS hinzuzufügen.
- Bereiten Sie die Verdauungslösung 1 vor, indem Sie 20 mg Kollagenase Typ II, 6 mg Rinderserumalbumin und 200 l Antibiotikum/Antimykotik (100x) in 10 ml sauerstoffstabiler Krebslösung auflösen.
- Bereiten Sie die Verdauungslösung 2 vor, indem Sie 1 ml 0,25% Trypsin mit 4 ml der ausgewogenen Salzlösung von Hank verdünnen.
- Bereiten Sie eine Platte mit beschichteten Abdeckungen.
- Verwenden Sie Zangen in einer laminaren Strömungsbank, wenn Sie Glasabdeckungen in eine 48-Well-Kulturplatte legen.
- Poly-D-Lysin mitddH2O auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml als Poly-D-Lysin-Bestand verdünnen. Lagern Sie den Lagerbestand bei -20 °C und tauen Sie vor Gebrauch.
- Fügen Sie 40 L Poly-D-Lysin-Lager auf jedem Deckelschlupf hinzu und inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 10 min.
ANMERKUNG: Stellen Sie bei verschiedenen Platten mit unterschiedlichen Basalbereichen die Konzentration auf 4 g/cm2ein. Wenn z.B. die Basalfläche eines Brunnens aus einer 24-Well-Platte 2 cm2beträgt, dann sollten wir 80 l Poly-D-Lysin-Bestand in einen Brunnen übertragen. Jeder cm2 würde 4 g Poly-D-Lysin enthalten. - Entfernen Sie Poly-D-Lysin in der 48-Well-Platte und spülen Sie Dielipse mit ddH2O dreimal.
- Trocknen Sie die Platte in einer laminaren Durchflusshaube für mindestens 30 min, um sicherzustellen, dass die Platte wasserfrei ist.
- Lagern Sie die Platte bei 4 °C vor der Laminierung höchstens 1 Tag. Die Lagerung der Platte bei 20 °C ist für eine Langzeitlagerung vorzuziehen.
- Laminin bei 4 °C auftauen. Laminin mit ddH2O auf eine Konzentration von 50 g/ml als Lamininvorrat verdünnen. Lagern Sie den Lagerbestand bei -20 °C und tauen Sie vor Gebrauch bei 4 °C auf.
- Verwenden Sie eine Pipette, um 100 l verdünntes Laminin an die Oberseite jedes Deckellipszuglases zu übertragen und Laminin bei 4 °C für 1 h zu inkubieren.
ANMERKUNG: Stellen Sie bei verschiedenen Platten mit unterschiedlichen Basalbereichen die Konzentration auf 5 g/cm2ein. Wenn z. B. die Basalfläche eines Brunnens aus einer 24-Well-Platte 2 cm2beträgt, dann 200 l verdünntes Laminin in einen Brunnen geben. Jede cm2 würde 5 g Laminin enthalten. - Entfernen Sie die Lamininlösung und spülen Sie die Abdeckungen einmal mit ddH2O. Führen Sie diesen Vorgang am Rand des Deckslips aus, um Einschübe zu vermeiden.
HINWEIS: Beschichtete Abdeckungen können höchstens 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
2. Blasenernte
- Erhalten Sie fünf Wochen alte Sprague-Dawley-Ratten.
- Indercarbogen (95% Sauerstoff, 5%CO2) in die Krebs-Lösung für mindestens 30 min in einem Eisbad, um einen stabilen Sauerstoffzustand und pH-Wert zu erreichen.
- Nach der Euthanasie durch Zervixdislokation die Ratten in 75% Ethanol für 30 s zur Sterilisation einweichen.
- Legen Sie Ratten auf ein sterilisiertes chirurgisches Handtuch und setzen Sie ihren Bauch aus. Öffnen Sie die Bauchhöhle, und offenbaren Sie die Blase mit einer Reihe von Scheren und Zangen.
- Heben Sie die Blase sanft an und schneiden Sie die Blase mit einer weiteren Schere und Zange aus dem Blasenhals, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Legen Sie die Blase schnell in kalte sauerstoffstabile Krebslösung, um das Zellüberleben zu verbessern.
HINWEIS: Sobald die Blase entfernt ist, führen Sie die folgenden Operationen schnell durch, um die Aussicht auf neuronen Überleben zu verbessern. - Fügen Sie Krebs-Lösung in drei Glasschalen und Glasbrecher.
- Bereiten Sie Glasgeschirr und Glasbrecher mit Krebs-Lösung in einem Eisbad zur Vorkühlung vor.
- Markieren Sie diese Behälter mit den Zahlen 1–3 entsprechend, um Verwechslungen zu vermeiden.
- Kombinieren Sie jede Glasschale mit Zangen und einem Löffel Kernteiler.
- In Glasschale 1 die Blase mit einer Augenschere aufschneiden und mit Zangen und einem Löffelkernteiler aufklappen.
- Spülen Sie die Blase in Glasbrecher 1, und legen Sie es in Glasschale 2.
- Beseitigen Sie anhaftendes Fett auf der Gewebeoberfläche mit den Zangen und der Augenschere in Glasschale 2.
- Spülen Sie die Blase in Glasbrecher 2, und legen Sie es in Glasschale 3.
- Kratzen Sie die Blase vorsichtig mit den Zangen und dem Löffelkernteiler auf Glasschale 3, um exogene Anhänge zu entfernen.
- Spülen Sie die Blase im Glasbrecher 3, übertragen Sie die Blase in ein 15 ml Zentrifugenrohr mit 14 ml kalter Krebslösung und drehen Sie die Probe 1 min bei 356 x g und 4 °C.
- Wiederholen Sie den vorherigen Schritt zweimal in zwei anderen Rohren mit Krebs-Lösung, um die Kontamination zu reduzieren.
3. Zweistufige Blasenverdauung
- Die Blase aus dem Zentrifugenrohr in eine 2 ml Durchstechflasche mit 1 ml Verdauungslösung 1 übertragen. Verwenden Sie eine Augenschere, um die Blase in kleine Stücke (kleiner als 1 mm) in Lösung zu schneiden.
- Mischen Sie die Blasenlösung mit 9 ml Verdauungslösung 1 in einer sterilen Zellkulturschale (100 mm Durchmesser). Schritt 1 Verdauung in einem Schüttelinkubator für 1 h unter 5%CO2,37 °C und 200 U/min durchführen.
- Nach Schritt 1 Vergärung zentrieren Sie die Lösung bei 356 x g bei 4 °C für 8 min.
- Die Verdauungslösung 2 zur Vorwärmung in ein 37 °C-Wasserbad geben.
- Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand, der die Verdauungslösung 1 enthält, und ernten Sie das Zellsediment. Etwas Restflüssigkeit ist erlaubt. Vollständige Entfernung der Lösung kann Zellverlust fördern.
- Zellsediment mit warmer Verdauungslösung 2 in einem 15 ml Zentrifugenrohr mischen und die Mischung schütteln, während sie in einem 37 °C-Wasserbad für 5 min verdauen. Nicht mehr als 7 min Schritt 2 Verdauung oder Neuronen gehen unter.
- Nach der Verdauung Sofort Trypsin in der Mischung mit 10 ml Kaltspülmedium deaktivieren.
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte bei 0 °C–4 °C aus. Ein Eisbad könnte einen solchen Zustand bieten. - Das Zellsediment nach Zentrifugation bei 356 x g bei 4 °C für 8 min ernten. Entfernen Sie so viele Medien wie möglich, da das verbleibende Trypsin schädlich für das Zellwachstum ist.
- Sediment mit 3 ml Neuronenmedien sanft aufsetzen. Stellen Sie sicher, dass Luftblasen nicht in der Lösung erzeugt werden, die Zellen für eine hohe Überlebensrate enthält.
- Filtern Sie das Mischungsmedium durch ein 70-m-Zellsieb in ein 50 ml Zentrifugenrohr.
- Halten Sie das Filtrat bei 30 Umdrehungen pro Minute in einem Eisbad 30 min auf einem Shaker. Dieser Schritt ist nicht notwendig, wird aber empfohlen.
- Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation bei 356 x g bei 4 °C für 8 min, und setzen Sie die Zellpellets in 1 ml Neuronenmedium A sanft wieder auf.
- Fügen Sie 500 l Zellmischung in jeden Brunnen der vorbereiteten 48-Well-Platte.
- Kulturzellen in einem Inkubator bei 37 °C und 5%CO2.
- Ersetzen Sie alle Medien durch Neuronenmedien B in 1 h, um eine serumfreie Kultur bereitzustellen.
- Ändern Sie alle 3 Tage die Hälfte der Neuronenmedien B.
HINWEIS: Neuronen sind bereit für immunzytochemische Experimente nach 5–7 Tagen Kultur.
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Representative Results
Im Prozess der primären Zellkultur waren die erfassten Zellen rund mit hellen und klaren Grenzen vor dem angefügten Zustand. Als die Neuronen wuchsen, begannen Dendriten und Axone zu unterscheiden. Nach 5–7 Tagen Kultur erreichten die Neuronen eine reife Form mit langen Projektionen, die ideal für Bildgebungs- oder Funktionsstudien waren. Obwohl die meisten Verunreinigungen und Zellablagerungen aufgrund wechselnder Medien entfernt werden konnten, waren bestimmte Residuen, die an Poly-D-Lysin- und Lamininbeschichtungen befestigt waren, sichtbar (Abbildung 1).
Nach der richtigen Kultur konnten Neuronen über typische β-III-Tubulin und MAP-2-Immunostainierung10,12identifiziert werden. Darüber hinaus wurde Glia speziell mittels GFAP-Immunostainierung10identifiziert. Reife Neuronen entwickelten synaptische Stacheln, die in der Nähe der präsynaptischen Spezialisierungen durch die Immunostainierung des synaptischen Proteinherstellers identifiziert wurden, Synapsin-1 (Abbildung 2)12. Diese Ergebnisse zeigten, dass reife Zellen mit gut entwickelten Synapsen durch diese Methode erhalten wurden. Dieses Ergebnis deutet auf seine wichtige Rolle in zukünftigen Funktionsstudien hin.
In der Zwischenzeit wurden mehrere Neuronensubtypen durch Immunzytochemie-Experimente erkannt (Abbildung 3). Peptidergische Neuronen, die verschiedene Neuropeptide enthalten, wurden mit der Substanz P13immungefärbt. Purinerge Neuronen mit exprimiertem vesikulären Nukleotidtransportern wurden mittels SLC17A9 Färbung14identifiziert. Nitrerge Neuronen wurden mit DYNLL-2 visualisiert, das nNOS mit motorischen Proteinen in Neuronen15verbindet. Cholinerge Neuronen waren immunreaktiv mit Cholin-Acetyltransferase16.
Abbildung 1. Phasenkontrastbilder von Primärzellen, die aus der Rattenblasenkultur isoliert sind und bei 1, 3 und 7 Tagen nach der Beschichtung aufgenommen wurden (A, B, C). Maßstabsleiste: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Immunfluoreszenzbilder von Primärzellen, die aus der Rattenblase isoliert sind. Die konfokale Mikroskopie-Analyse zeigte neuronische Zytoskelett-Proteinfärbung (β-III-Tubulin, RRID: AB_2827688, 1:200) in Primärkulturneuronen (A) und in der gesamten Mount-Blasenpräparation (B). In Primärkultur-Neuronen wurde auch neuronale Phosphoprotein-Immunostainierung (MAP 2, RRID:AB_2827689, 1:200) visualisiert (C). Glia wurden durch glialfibrilläre saure Proteinfärbung identifiziert (D; RRID: AB_627673, 1:50). Synapsine wurden über Synapsin-Proteinfärbung (Synapsin-1, RRID: AB_2798146, 1:200) in zellulären (E) und Gewebe (F) Ebenen visualisiert. Die sekundären Antikörper wurden wie folgt eingesetzt: Alexa Fluor 488 (grün, Ziege Anti-Kaninchen lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (rot, Ziege Anti-Maus lgG, 1:200). Der Kern wurde mit Hoechst 33342 (A, C, D, E; blau, 1 g/ml) visualisiert. Maßstabsleiste: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Immunfluoreszenzbilder von mehreren Neuronensubtypen primärer Neuronen. Peptidergische Neuronen wurden mit Substanz P (A; RRID: AB_785913, 1:50). Purinerge Neuronen wurden mittels SLC17A9-Färbung (B; RRID: AB_10597575, 1:200). Nitrerge Neuronen wurden mittels DYNLL-2-Färbung visualisiert (C; RRID: AB_654147, 1:50). Cholinerge Neuronen waren immunreaktiv mit Cholin-Acetyltransferase (D; RRID: AB_2244867, 1:100). Die sekundären Antikörper wurden wie folgt eingesetzt: Alexa Fluor 488 (grün, Ziege Anti-Kaninchen lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (rot, Ziege Anti-Maus lgG, 1:200). Der Kern wurde mit Hoechst 33342 (A, B, C, D, blau, 1 g/ml) visualisiert. Maßstabsleiste: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Zutaten | Mollichkeit (mM) |
| Naki | 120 |
| Kci | 5.9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4bei 12H2O | 1.2 |
| MgCI2bei 6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| Glukose | 11.5 |
Tabelle 1. Krebs Lösungzusammensetzung
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Discussion
Plattenvorbereitung
Die Verwendung von Glasabdeckungen in 6-, 12- oder 48-Well-Kulturplatten für immunfluoreszierende oder Kalzium-Bildgebungsexperimente ist eine wirtschaftliche und probenschonende Operation. Zellen wachsen gut in Platten ohne Decklippen während der Herstellung von primären Zellkulturen. Daher sind Coverlips in Experimenten wie Western Blot oder Polymerase-Kettenreaktion entbehrlich. Darüber hinaus ist die Beschichtung ein notwendiger Schritt vor der Beschichtung von Zellen, mit oder ohne Abdeckungen. Laminin und Poly-D-Lysin sind häufige Entscheidungen bei der Beschichtung von Neuronen, insbesondere Laminin, das für das Neuronenwachstum17wesentlich ist.
Medienvorbereitung
Nach dem ersten mittleren Ersatz erfordert die Zellisolation Medien ohne Serum, da Serum die Zellteilung stimuliert und zu einem begrenzten neuronwachsenden Raum führt18. Daher sind Neuronenwachstumsfaktoren entscheidend. Die Qualität von B27 und GDNF kann stark von verschiedenen Chargen abweichen und erhebliche Auswirkungen auf das Neuronenwachstum verursachen19. Daher wird empfohlen, die Chargennummer der Medien zu überprüfen, wenn die Neuronenausbeute schlecht ist. In der Zwischenzeit ist der Frische-Medien-Bestand von entscheidender Bedeutung; der erforderliche Betrag sollte jedes Mal vor dem Austausch der Medien im Voraus berechnet und vorbereitet werden.
Tiere
Sprague-Dawley Ratten werden bei dieser Methode verwendet. C57BL/6-Mäuse sind auch in diesem Experiment akzeptabel. Daher können auch andere Stämme von Ratten oder Mäusen für diese Methode trotz einiger Variationen in der Morphologie und neuronalen Schaltkreise angenommen werden. In Bezug auf verschiedene Tiermodelle sollten Forscher ein optimiertes und zielgerichtetes Protokoll entwickeln. Darüber hinaus sollten Jungtiere immer vor der Anwendung dieser Methode in Betracht gezogen werden.
Gewebebehandlung
Während der Experimente, mit Ausnahme des Verdauungsprozesses, ist es wichtig, Gewebe bei einer niedrigen Temperatur zu halten, um die Zelllebensfähigkeit zu erhöhen, was den Zellstoffwechsel reduzieren und Energiedefizitvermeiden kann. Sauerstoffgehalt, Ernährung und pH-Wert können sich auch auf die Zellausbeute11auswirken. Darüber hinaus schlagen wir für andere Gewebe vor, dass Forscher diese Methode mit angepasstem Verdauungszustand durchführen.
Zellkultur
Ein bemerkenswertes Merkmal von Neuronen bei der Inokulatur ist ihre schnelle Haftung an beschichteten Platten20. In diesem Fall wird empfohlen, die Medien nach 1 h Kultur zu wechseln, um einen hohen Anteil an Neuronen zu gewinnen. Darüber hinaus, wenn die meisten Zellen beginnen, Pseudopodium zu wachsen, kann die Häufigkeit der wechselnden Medien entsprechend abhängig von der Farbe der Medien und dem zellulären Zustand reduziert werden. Primäre Zellkultur in einem guten Zustand zeigt schwarzes Soma mit einem hellen Rahmen.
Die meisten Nervenzellen, die von der Blase isoliert sind, sind blasenintramurale Ganglien, die aus afferenden und autonomen efferenten Innervationen der Blase13bestehen. Darüber hinaus sind keine größeren Beckenganglien im geernteten Gewebe vorhanden. Es verteilt sich unter dem Blasenhals21.
Einschränkung
Dies ist eine vorläufige Forschung zu isolieren und Kultur Neuronen und Glia. Es wurden viele Versuche unternommen, wie z. B. die Cytarabin-Behandlung oder die Zentrifugation des Dichtegradienten. Allerdings war der Anteil der gewünschten Zellen immer noch nicht ideal, und noch mehr Zellverlust erschien. Darüber hinaus sind traditionelle Verdauungsbedingungen in diesem Protokoll, wie 37 °C, wahrscheinlich einige empfindliche Neuronentypen abtöten und potenzielle Genexpressionsartefakte verursachen22.
Abschließend bietet dieses Protokoll eine Methode zur Kultur von Neuronen und Glia aus Rattenblase. Die Isolierung ist leicht zu wiederholen, zeitsparend und beinhaltet minimale mikrobielle Kontamination. Obwohl eine Verbesserung, die die Reinheit der Neuronen heraufbeschwört, notwendig ist, hoffen wir, dass diese Methode zur LUTNS-Forschung beiträgt.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen größeren Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nr. 81673676) und dem Dongguan Science and Technology Bureau (Grant-Nr. 2019622101002) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Maryrose Sullivan (Assistant Professor in Surgery, Harvard Medical School) für die technische Beratung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
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