Summary
Этот протокол пытается установить повторяемый протокол для первичных нейронов и глиа изоляции от крысиного пузыря для дальнейших клеточных экспериментов.
Abstract
Нижний мочевыводящих путей имеет две основные функции, а именно, периодическое хранение мочи и micturition; эти функции опосредовано через центральную и периферическую нейрорегуляцию. Хотя обширные исследования на нижней мочевыводящих путей нервной системы была проведена, большинство исследований были сосредоточены на первичной культуры. Этот протокол вводит метод изоляции и культуры нейронов мочевого пузыря и глии от крыс Спраг-Доули. В этом методе, нейроны и глии были инкубированы в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 инкубатор в течение 5-7 дней. В результате они переросли в зрелые формы, пригодные для последующих экспериментов по иммунофлюоресценции. Клетки морфологически наблюдались с помощью оптического микроскопа. Нейроны, синаптические пузырьки и глиа были выявлены β-III-тубулином и MAP-2, Синапсин-1 и GFAP окрашивание, соответственно. Между тем, иммуноцитохимия была выполнена на нескольких нейромедиатора связанных белков, таких как холин ацетилтрансферазы, DYNLL2, и SLC17A9.
Introduction
Нижний мочевыводящих путей имеет две основные функции: периодическое хранение мочи и micturition1. Нижняя мочевыводящих путей нервной системы (LUTNS) контролирует эти функции и деликатный и восприимчивы ко многим невропатии, которые могут быть врожденными (порфирия), приобретенные (болезнь Лайма), вторичные состояния болезни (диабетическая цистопатия), препарат индуцированной (геморрагический цистит), вызванные (абдоминоперинальной ресекции),илитравмы,вызванные (травматическая травма спинного мозга)2, 3 , 5 , 5,5. В физиологических/патологических исследованиях не менее важны эксперименты in vivo и in vitro. В то время как in vivo исследования lutNS были проведены на уровне органов, клеток и молекулярных в течение некоторого времени, в пробирке исследования первичных нейронов из мочевогопузыря почти не существует 8,9. Хотя настоящее исследование ограничено, мы надеемся, что пионер исследований в этой области, с тем чтобы другие исследователи могли улучшить его. Таким образом, эта ко-культура может привести к клеточному пониманию физиологической дисфункции в фенотипах, таких как дисфункция нейронов мочевого пузыря.
В отличие от энтерических мышц с четкой направленностью мышечных клеток в дискретные слои, мышцы мочевого пузыря неорганизованы10. Поэтому вместо того, чтобы отслаиваться от внешнего слоя мочевого пузыря, этот метод предлагает переваривать весь мочевой пузырь, чтобы уменьшить сложность работы и сократить время предварительной обработки для высокой выживаемости клеток.
Следуя этому методу, мы можем получить смешанную культуру нейронов и других клеток. Другие клетки незаменимы, потому что их присутствие имитирует среду in vivo11. Кроме того, такие клетки обеспечивают вещества, которые отсутствуют в среде.
Этот метод включает в себя два шага для пищеварения. Во-первых, коллагеназа типа II используется для гидролизового коллагена, а затем трипсина, чтобы разобщить ткани в клетки10. Таким образом, ткани мочевого пузыря рассредоточены по одиночным клеткам, а затем становятся относительно независимыми. Когда культура нейронов созревает, нейроны могут быть использованы для визуализации или функциональных анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные протоколы и процедуры для животных соответствовали этическим принципам Национального исследовательского совета.
1. Подготовка материалов
- Стерилизовать все инструменты и ddH2O с помощью автоклава перед выполнением эксперимента. Инструменты включают, но не ограничиваются хирургическими ножницами, офтальмологическими ножницами, типсами, ложками жерла, стеклянной посудой (60-100 мм в диаметре) и стеклянными выключателями.
- Подготовка решения Кребса следующим образом (Таблица 1): Растворите все химические вещества вместе с ddH2O перед использованием. Растворите CaCI2 отдельно и медленно добавьте в смешанный раствор, помешивая, чтобы избежать осадков.
- Подготовьте средства для полоскания, которые состоят из средств массовой информации F12 с 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% антибиотика/антимикотических (100x). Добавьте 5 мл FBS и 0,5 мл антибиотика/антимикотика в 44,5 мл средств массовой информации F12.
- Подготовка нейронных средств массовой информации, которая включает в себя невробазные средства массовой информации с 2% B-27, 1% FBS, 1% L-глутамин, 1% антибиотик / антимикотический (100x), и 0,1% глии полученных нейротрофический фактор (GDNF). Добавьте 200 л B-27, 100 л FBS, 100 л L-гламина, 100 л антибиотика/антимикотика (100x) и 10 л GDNF (10 мкг/мл) до 9,5 мл невробазных средств массовой информации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка нейронных средств массовой информации в течение одной недели использования для обеспечения свежести B-27, L-глутамин и GDNF. - Подготовка нейронов СМИ B с использованием той же процедуры, как подготовка нейронов СМИ, но без добавления FBS.
- Приготовьте раствор пищеварения 1 путем растворения 20 мг коллагеназы II типа, 6 мг альбумин сыворотки крупного рогатого скота и 200 мл антибиотика/антимикотического (100x) в 10 мл кислородно-стабильного раствора Кребса.
- Приготовьте раствор пищеварения 2, разбавляя 1 мл 0,25% трипсина 4 мл сбалансированного соленого раствора Хэнка.
- Подготовь тарелку с крышками с покрытием.
- Используйте типсы в ламинарный поток скамейке при размещении стеклянных coverslips в 48-ну культуры пластины.
- Разбавить поли-Д-лизинддХ 2O до концентрации 0,1 мг/мл в виде поли-Д-лизина. Храните запас при -20 градусов по Цельсию, и оттепель перед использованием.
- Добавьте 40 МКЛ поли-D-лизина на верхней части каждого крышки, и инкубировать раствор при комнатной температуре в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для различных пластин с различными базальными областями, отрегулируйте концентрацию до 4 мкг/см2. Например, если базальная площадь одной колодец из 24-хорошо пластины составляет2 см 2,то мы должны передать 80 мкл поли-D-лизина в колодец. Каждыйсм 2 будет содержать 4 мкг поли-D-лизина. - Удалите поли-D-лизин в 48-хорошо пластины, и промыть coverslips с ddH2O трижды.
- Высушите пластину в капюшоне ламинарного потока, по крайней мере 30 минут, чтобы убедиться, что пластина является ангидроусом.
- Храните тарелку при 4 градусах Цельсия до ламинин покрытия в течение 1 дня не более. Хранение пластины при 20 градусах Цельсия предпочтительнее для длительного хранения.
- Оттепель ламинина при 4 градусах Цельсия. Разбавить ламинин ddH2O до концентрации 50 мкг/мл в виде ламинина. Храните бульон при -20 градусов по Цельсию, и оттепель при 4 градусов по Цельсию перед использованием.
- Используйте пипетку для передачи 100 л разбавленного ламинина в верхней части каждой крышки и инкубировать ламинин при 4 градусах по Цельсию в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для различных пластин с различными базальными областями, отрегулируйте концентрацию до 5 мкг/см2. Например, если базальная область одной колодец из 24-хорошо пластины составляет 2см 2,то перенесите 200 л разбавленного ламинина в колодец. Каждыйсм 2 будет содержать 5 мкг ламинина. - Удалите раствор ламинина, и промыть coverslips с ddH2O один раз. Выполните эту операцию на краю крышки, чтобы избежать соскабливания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытые крышки могут храниться при 4 кк в течение 2 недель не более.
2. Урожай мочевого пузыря
- Получите пятинедельных крыс Спраг-Доули.
- Настоять карбоген (95% кислорода, 5% CO2) в раствор Кребса, по крайней мере 30 минут в ледяной ванне, чтобы достичь стабильного состояния кислорода и уровня рН.
- После эвтаназии с помощью вывиха шейки матки, замочить крыс в 75% этанола в течение 30 с для стерилизации.
- Поместите крыс на стерилизованное хирургическое полотенце и разоблачить их живот. Откройте брюшную полость, и выявить мочевого пузыря с набором ножниц и типсов.
- Поднимите мочевой пузырь осторожно и вырезать мочевой пузырь из мочевого пузыря шеи с другим набором ножниц и типсов, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Поместите мочевой пузырь быстро в холодный кислород-стабильный раствор Кребса, чтобы улучшить выживание клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только мочевой пузырь удаляется, выполнять следующие операции быстро, чтобы улучшить перспективу выживания нейронов. - Добавьте раствор Krebs в три стеклянные блюда и стеклянные выключатели.
- Приготовьте стеклянную посуду и стеклянные выключатели с раствором Кребса в ледяной ванне для переохлаждения.
- Отметь эти контейнеры с номерами 1-3 соответственно, чтобы предотвратить путаницу.
- Соедините каждую стеклянную тарелку с типсами и ложкой диверайера ядра.
- В стеклянной тарелке 1, разрезать мочевой пузырь с офтальмологическими ножницами, и развернуть его с типсами и ложки ядра разделитель.
- Промыть мочевой пузырь в стеклянный выключатель 1, и поместить его в стеклянное блюдо 2.
- Устраните адепт жира на поверхности ткани с помощью типсов и офтальмологических ножниц в стеклянной тарелке 2.
- Промыть мочевой пузырь в стеклянный выключатель 2, и поместить его в стеклянное блюдо 3.
- Аккуратно соскребать мочевой пузырь с помощью типсов и ложки ядра разделитель на стеклянную тарелку 3, чтобы удалить экзогенные вложения.
- Промыть мочевой пузырь в стеклянном выключателе 3, перенести мочевой пузырь в 15 мл центрифуги трубки с 14 мл холодного раствора Кребса, и спина образца в течение 1 мин при 356 х г и 4 градусов по Цельсию.
- Повторите предыдущий шаг дважды в двух других трубках с раствором Кребса, чтобы уменьшить загрязнение.
3. Двухстухончатое пищеварение мочевого пузыря
- Перенесите мочевой пузырь из центрифуги в флакон 2 мл, содержащий 1 мл раствора пищеварения 1. Используйте офтальмологические ножницы, чтобы разрезать мочевой пузырь на мелкие кусочки (меньше 1 мм) в растворе.
- Смешайте раствор мочевого пузыря с 9 мл раствора пищеварения 1 в стерильной клеточной культуре (100 мм в диаметре). Выполните шаг 1 пищеварения в трясущимся инкубаторе в течение 1 ч под 5% CO2, 37 КК и 200 об/мин.
- После шага 1 пищеварения, центрифуга раствор при 356 х г при 4 градусов по Цельсию в течение 8 мин.
- Поместите раствор пищеварения 2 в водяную ванну при 37 градусов по Цельсию для подогрева.
- После центрифугации удалите супернатант, содержащий раствор пищеварения 1, и собирай клеточный осадок. Некоторая оставшаяся жидкость допускается. Полное удаление раствора может способствовать потере клеток.
- Смешайте клеточный осадок с теплым раствором пищеварения 2 в 15 мл центрифуги трубки, и встряхните смесь во время переваривания в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Не превышать 7 мин шага 2 пищеварения или нейроны погибнут.
- После пищеварения немедленно деактивировать трипсин в смеси с 10 мл холодного полоскания средств массовой информации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги при 0 градусов по Цельсию. Ледяная ванна может обеспечить такое состояние. - Урожай отложений клеток после центрифугации при 356 x g при 4 градусах Цельсия в течение 8 мин. Удалите как можно больше средств массовой информации, поскольку оставшийся трипсин вреден для роста клеток.
- Resuspend осадок с 3 мл нейронов средств массовой информации мягко. Убедитесь, что пузырьки воздуха не генерируются в растворе, содержащем клетки для высокой выживаемости.
- Фильтр смеси средств массовой информации через 70 мкм ячейки ситечко в 50 мл центрифуги трубки.
- Держите фильтрат на шейкере при 30 об/мин в ледяной ванне в течение 30 минут. Этот шаг не является необходимым, но рекомендуется.
- Соберите клетки путем центрифугации при 356 x g при 4 градусах Цельсия в течение 8 минут, и аккуратно повторно потейте клеточные гранулы в 1 мл нейронной массы А.
- Добавьте 500 МКЛ клеточной смеси в каждый колодец подготовленной пластины из 48 колодец.
- Культурные клетки в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
- Замените все средства массовой информации нейронами В в 1 ч, чтобы обеспечить культуру, свободную от сыворотки.
- Изменение половины нейронов В каждые 3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нейроны готовы к иммуноцитохимическим экспериментам после 5-7 дней культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В процессе первичной клеточной культуры приобретенные клетки были круглыми с яркими и четкими границами перед прикрепленным состоянием. По мере роста нейронов дендриты и аксоны стали отчетливыми. После 5-7 дней культуры, нейроны достигли зрелой форме с длинными проекциями, которые были идеальными для изображений или функциональных исследований. Хотя большинство примесей и клеточного мусора могут быть удалены из-за изменения средств массовой информации, некоторые остатки, прикрепленные к поли-D-лизин и ламинин покрытие были видны(рисунок 1).
После правильной культуры, нейроны могут быть идентифицированы с помощью β-III-тубулина иMAP-2 иммуностимения 10,12. Кроме того, глия была специально определена с помощью иммуностимулятора GFAP10. Зрелые нейроны разработали синаптические шипы, которые были близки к пресинаптическим специализациям, выявленным иммуностепенингом производителя синаптических белков, синапсина-1 (рисунок 2)12. Эти результаты показали, что зрелые клетки с хорошо развитыми синапсами были получены с помощью этого метода. Этот результат свидетельствует о его важной роли в будущих исследованиях функций.
Между тем, несколько подтипов нейронов были признаны с помощью иммуноцитохимии экспериментов(рисунок 3). Пептидргические нейроны, которые содержат различные нейропептиды, были иммунотеплиенты веществом P13. Пуринергические нейроны с выраженными везикулярными нуклеотидными транспортерами были идентифицированы с помощью Окрашивания SLC17A914. Нитриргические нейроны были визуализированы с DYNLL-2, который соединяет nNOS с моторными белками в нейронах15. Холинергические нейроны были иммунореактивны с холином ацетилтрансферазы16.
Рисунок 1. Фазо-контрастные изображения первичных клеток, изолированных от культуры крысиного пузыря, сделанные через 1, 3 и 7 дней после покрытия (A, B, C, соответственно). Шкала бар: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Иммунофторесценция изображения первичных клеток, изолированных от крысиного пузыря. Анализ конфокальной микроскопии показал окрашивание белка цитоскелета нейронов (β-III-тубулин, RRID: AB_2827688, 1:200) в первичных нейронах культуры(A)и в препарате всего мочевого пузыря(B). В первичных нейронов культуры, нейрональных фосфопротеин иммуностеин (MAP 2, RRID:AB_2827689, 1:200) такжевизуализированы( C ). Glia были определены с помощью глиальных фибриллярных кислых белков окрашивания(D; РРИД: AB_627673, 1:50). Синапсины визуализировались с помощью окрашивания белка синапсина (Synapsin-1, RRID: AB_2798146, 1:200) в клеточном(E)и тканевом(F)уровнях. Вторичные антитела были использованы следующим образом: Alexa Fluor 488 (зеленый, коза анти-кролик lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (красный, коза анти-мышь lgG, 1:200). Ядро визуализировано с помощью Hoechst 33342(A, C, D, E; синий,1 мкг/мл). Шкала бар: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Иммунофлюоресценция изображения нескольких нейронов подтипов первичных нейронов. Пептидергические нейроны были иммунотелены веществом P (A; РРИД: AB_785913, 1:50). Пуринергические нейроны были идентифицированы с помощью Окрашивания SLC17A9(B; РРИД: AB_10597575, 1:200). Нитриргические нейроны были визуализированы с помощью Окрашивания DYNLL-2(C; РРИД: AB_654147, 1:50). Холинергические нейроны были иммунореактивны с холином ацетилтрансферазы(D; РРИД: AB_2244867, 1:100). Вторичные антитела были использованы следующим образом: Alexa Fluor 488 (зеленый, коза анти-кролик lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (красный, коза анти-мышь lgG, 1:200). Ядро было визуализировано с помощью Hoechst 33342(A, B, C, D, синий, 1 мкг/мл). Шкала бар: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Ингредиенты | Моларность (mM) |
| NaCI | 120 |
| KCI | 5.9 |
| НаХКО3 | 25 |
| Na2HPO412H2O | 1.2 |
| MgCI2No6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| глюкоза | 11.5 |
Таблица 1. Композиция решения Krebs
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Подготовка плиты
Использование стеклянных крышки в 6-, 12-, или 48-хорошо культуры пластин для иммунофлуоресцентных или кальция изображений экспериментов является экономичным и образца щадящей операции. Клетки хорошо растут в пластинах без крышки во время подготовки первичных клеточных культур. Таким образом, coverslips являются необязательными в экспериментах, таких как западные пятно или полимеразы цепной реакции. Кроме того, покрытие является необходимым шагом перед покрытием клеток, с или без coverslips. Ламинин и поли-D-лизин являются общим выбором в покрытии нейронов, особенно ламинина, который имеет важное значение для ростанейронов 17.
Подготовка средств массовой информации
После первой средней замены изоляция клеток требует мультимедиа без сыворотки, потому что сыворотка стимулирует деление клеток и приводит к ограниченному пространствудля выращивания нейронов 18. Таким образом, факторы роста нейронов имеют решающее значение. Качество B27 и GDNF может варьироваться в значительной степени от различных партий и вызвать серьезные последствия для роста нейронов19. Таким образом, проверка количества лота средств массовой информации рекомендуется, когда выход нейронов является плохим. Между тем, свежие средства массовой информации имеют решающее значение; требуемая сумма должна быть рассчитана и подготовлена заранее каждый раз, прежде чем средства массовой информации будут заменены.
животные
Sprague-Dawley крысы используются в этом методе. C57BL/6 мышей также приемлемы в этом эксперименте. Таким образом, другие штаммы крыс или мышей также могут быть приняты для этого метода, несмотря на несколько вариаций в морфологии и нейрональной схемы. С точки зрения различных моделей животных, исследователи должны разработать оптимизированный и целенаправленный протокол. Кроме того, молодые животные всегда должны быть рассмотрены до применения этого метода.
Лечение тканей
Во время экспериментов, за исключением пищеварительного процесса, поддержание тканей при низкой температуре имеет важное значение для повышения жизнеспособности клеток, которые могут уменьшить метаболизм клеток и избежать дефицита энергии. Уровни кислорода, питания и рН также могут повлиять на выходклеток 11. Кроме того, для других тканей, мы предлагаем, чтобы исследователи выполняют этот метод с регулируемым состоянием пищеварения.
Культура клеток
Одной из замечательных характеристик нейронов при прививке является их быстрое присоединение к покрытым пластинам20. В этом случае, изменение средств массовой информации после 1 ч культуры рекомендуется получить высокую долю нейронов. Кроме того, когда большинство клеток начинают расти псевдоподиумия, частота изменения средств массовой информации может быть сокращена надлежащим образом в зависимости от цвета средств массовой информации и клеточного состояния. Первичная культура клеток в хорошем состоянии отображает черную сому с яркой границей.
Большинство нервных клеток, изолированных от мочевого пузыря являются мочевого пузыря интрамуральных ганглиев, которые состоят из афферентных и вегетативных иннервациимочевого пузыря 13. Кроме того, в собранных тканях нет крупных тазовых ганглиев. Он распределяет ниже шеи мочевого пузыря21.
ограничение
Это предварительное исследование, чтобы изолировать и культуры нейронов и глии. Было предпринято много попыток, таких как лечение цитарабином или градиентная центрифугация плотности. Тем не менее, доля желаемых клеток по-прежнему не является идеальным, и еще больше потери клеток появились. Кроме того, традиционные пищеварительные условия в этом протоколе, такие как 37 градусов по Цельсию, скорее всего, убить некоторые чувствительные типы нейронов, и вызвать потенциальныеартефакты экспрессии генов 22.
В заключение, этот протокол предлагает метод культуры нейронов и глии из крысиного пузыря. Изоляция легко повторяется, время эффективно, и включает в себя минимальное микробное загрязнение. Хотя улучшение вызывая чистоту нейронов необходимо, мы надеемся, что этот метод способствует исследованию LUTNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о серьезном конфликте интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (Grant No 81673676) и Бюро науки и технологий Дунгуаня (Grant No 201962101002). Авторы благодарят доктора Мэрироуз Салливан (помощник профессора хирургии Гарвардской медицинской школы) за техническое консультирование.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Golbidi, S., Laher, I.
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, Pt 9 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants - A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G.
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
