Summary
このプロトコルは、一次ニューロンとラット膀胱からのグリア分離のための反復可能なプロトコルを確立し、さらなる細胞実験を試みる。
Abstract
下部尿路は、2つの主要な機能、すなわち、定期的な尿貯蔵およびミチュリションを有する。これらの機能は、中央および末梢神経調節を介して仲介されます。低尿路神経系に関する広範な研究が行われているが、ほとんどの研究は、原発性文化に焦点を当ててきた。このプロトコルは、スプレイグ-ドーリーラットからの膀胱ニューロンとグリアの分離と培養のための方法を導入します。この方法では、ニューロンおよびグリアを37°C、5%CO2インキュベーターで5〜7日間インキュベーターでインキュベートした。その結果、それらは関連する後続の免疫蛍光実験に適した成熟した形状に成長した。細胞は光学顕微鏡を用いて形態学的に観察した。ニューロン、シナプス小胞、およびグリアは、それぞれβ-III-管状およびMAP-2、シナプシン-1、およびGFAP染色によって同定された。一方、免疫細胞化学は、コリンアセチルトランスビセラーゼ、DYNLL2、SLC17A9などのいくつかの神経伝達物質関連タンパク質に対して行われました。
Introduction
下部尿路には、尿の定期的な保存と、1のミチュリンの2 つの機能があります。下部尿路神経系(LUTNS)はこれらの機能を制御し、繊細で多くの神経障害の影響を受けやすく、先天性(ポルフィリン症)、後発性疾患状態(糖尿病性膀胱障害)、薬物誘発(出血性膀胱炎)、または外傷(脊髄損傷)2,3,4,6,7, 7, 7, 7, 7, 7, 7,7, 7.生理学的/病理学的研究では、生体内およびインビトロ実験も同様に重要である。LUTNSに関するインビボ研究は、しばらくの間、臓器、細胞、および分子レベルで行われてきたが、尿膀胱からの一次ニューロンに関するインビトロ研究はほとんど存在しない8,9である。今回の研究は限られていますが、他の研究者が改善できるように、この分野の研究を開拓したいと考えています。このようにして、この共培養は、膀胱ニューロン機能不全などの表現型における生理学的機能不全の細胞的理解につながる可能性がある。
離散層への筋肉細胞の明確な方向性を持つ腸筋とは対照的に、膀胱の筋肉は組織化されていない10である。したがって、膀胱の外層を剥離する代わりに、この方法は、手術困難を低減し、高い細胞生存率のための前処理時間を短縮するために膀胱全体を消化することを提案する。
この方法に従って、ニューロンと他の細胞の混合培養を得ることができる。その存在は生体内環境11を模倣するので、他の細胞は不可欠である。また、このような細胞は、培地で利用できない物質を提供する。
この方法は、消化のための2つのステップを伴う。まず、コラゲザーゼII型は、コラーゲンを加水分解するために使用され、続いてトリプシンが、組織を細胞10に解化する。このようにして、膀胱組織は単一細胞に分散され、その後比較的独立して成長する。ニューロンの培養が成熟すると、ニューロンは、イメージングまたは機能的アッセイに使用することができます。
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Protocol
すべての実験プロトコルと動物の手順は、国家研究評議会の倫理原則ガイドラインに準拠しています。
1. 材料の準備
- 実験を行う前に、オートクレーブを使用してすべての機器とddH2Oを殺菌します。器械は外科用はさみ、眼科用はさみ、鉗子、スプーン核の分け器、ガラス皿(直径60-100 mm)、およびガラスブレーカに限定されない。
- 以下のようにクレブス溶液を調製する(表1):使用前にddH2Oと一緒にすべての化学物質を溶解します。CaCI2 を別々に溶解し、沈み込みを避けるために攪拌しながら混合溶液にゆっくりと加えます。
- 10%の牛血清(FBS)と1%の抗生物質/抗ミコティック(100x)でF12培地で構成されるリンス培地を準備します。F12培地44.5mLにFBS5 mLと抗生物質/抗菌薬0.5mLを加えます。
- 2%B-27、1%FBS、1%L-グルタミン、1%抗生物質/抗ミキ酢(100x)、および0.1%グリア由来神経栄養因子(GDNF)を有する神経基底A培地を調製する。B-27の200 μL、FBSの100 μL、L-グルタミンの100 μL、抗生物質/抗抗抗ミキティックの100 μL(100x)、および9.5mLのGDNF(10 μg/mL)の10 μLを神経基底A培地に加える。
注:B-27、L-グルタミンおよびGDNFの鮮度を確保するために使用の1週間以内にニューロンメディアAを準備してください。 - ニューロンメディアAの調製と同じ手順を用いてニューロンメディアBを準備するが、FBSを加えることなく。
- 20mgのコラゲナーゼII型、6mgの牛血清アルブミン、200μLの抗生物質/抗ミキサン(100x)を酸素安定クレブス溶液10mLに溶解して消化液1を調製した。
- 0.25%トリプシンの1 mLをハンクのバランスの取れた塩溶液の4 mLで希釈して消化液2を調製する。
- コーティングされたカバーリップでプレートを準備します。
- ガラスカバーリップを48ウェルの培養プレートに入れる場合は、層流のベンチで鉗子を使用します。
- ポリD-リジンストックとして0.1 mg/mLの濃度にddH2OでポリD-リジンを希釈します。在庫を–20°Cで保管し、使用前に解凍してください。
- 各カバースリップの上にポリD-リジンストック40 μLを加え、室温で10分間インキュベートします。
注:異なる基底領域を持つ別のプレートの場合は、4 μg/cm2に濃度を調整します。たとえば、24ウェルプレートからの1ウェルの基底面積が2cm2の場合、80μLのポリD-リジンストックをウェルに移す必要があります。各cm2 は4μgのポリD-リジンを含んでいる。 - 48ウェルプレートでポリD-リジンを取り除き、ddH2O thriceでカバーリップをすすいでください。
- プレートが無水であることを確認するために、少なくとも30分間ラミナーフローフードでプレートを乾燥させます。
- ラミニンコーティングの前に4°Cでプレートを保管してください。プレートを−20°Cで保管することは、長期保存に適しています。
- ラミニンを4°Cで解凍する。 ラミニンを薄い50 μg/mLの濃度にddH2Oで希釈します。在庫を-20°Cで保管し、使用前に4°Cで解凍してください。
- ピペットを使用して、希釈したラミニンを各カバースリップの上部に100 μL、4°Cで1時間インキュベートラミニンを1時間移動します。
注:異なる基底領域を持つ別のプレートの場合は、5 μg/cm2に濃度を調整します。例えば、24ウェルプレートからの1ウェルの基底面積が2cm2の場合、希釈したラミニンを200μLのウェルに移します。各cm2 は5μgのラミニンを含んでいる。 - ラミニン溶液を取り出し、ddH2Oでカバーリップを一度すすい取ります。スクレイピングを避けるために、カバースリップの端にこの操作を実行します。
注:コーティングされたカバーリップは、せいぜい2週間4°Cで保管することができます。
2. 膀胱の収穫
- 5週齢のスプレイグ-ドーリーラットを入手する。
- 安定した酸素状態とpHレベルに到達するために、氷浴中の少なくとも30分間、クレブス溶液にカルボゲン(95%酸素、5%CO2)を注入します。
- 頸椎脱臼による安楽死後、ラットを殺菌のために30sの75%エタノールに浸す。
- 殺菌した外科用タオルの上にラットを置き、彼らの腹部を露出させる。腹腔を開き、はさみと鉗子のセットで膀胱を明らかにする。
- 膀胱をそっと持ち上げ、膀胱頸部から膀胱を別のハサミと鉗子で切り取り、クロスコンタミネーションを避けます。細胞の生存率を向上させるために、冷たい酸素安定クレブス溶液に膀胱を迅速に置きます。
注:膀胱を取り除いたら、ニューロン生存の見通しを改善するために、次の操作を迅速に行います。 - 3つのガラス皿とガラスブレーカにクレブス溶液を加えます。
- ガラス皿とガラスブレーカを氷浴でクレブス溶液で準備して、予冷します。
- これらのコンテナに 1 ~ 3 の番号を付けて、混乱を防ぎます。
- 各ガラス皿を鉗子とスプーン核仕切りと組み合わせる。
- ガラス皿1では、眼科用はさみで膀胱を切り開き、鉗子とスプーン核仕切りで開きます。
- ガラスブレーカ1で膀胱をすすいで、ガラス皿2に入れる。
- ガラス皿2の鉗子および眼科用はさみを使用してティッシュ表面の付着脂肪を除去する。
- ガラスブレーカ2で膀胱をすすい、ガラス皿3に入れる。
- 鉗子とスプーン核仕切り器をガラス皿3に使用して膀胱を静かにこすり、外因性の付着物を取り除く。
- ガラスブレーカ3で膀胱をすすい、14 mLの冷たいクレブス溶液を用いた15mL遠心管に膀胱を移し、356 x g および4°Cで1分間サンプルを回す。
- 上記の手順を、他の 2 つのチューブで 2 回、他の 2 つのチューブで 2 回繰り返して、汚染を減らします。
3. 二段階膀胱消化
- 1 mLの消化液1を含む2mLバイアルに遠心管から膀胱を移す。眼科用はさみを使用して、膀胱を溶液中の小片(1mm未満)に切ります。
- 膀胱溶液を9 mLの消化液1と滅菌細胞培養皿(直径100mm)で混合する。5%CO2、37°C、および200rpm下で1時間の振盪インキュベーターでステップ1消化を行います。
- ステップ1の消化後、溶液を4°Cで356xgで8分間遠心分離する。
- 消化液2を予熱用の37°C水浴に入れる。
- 遠心分離後、消化液1を含む上清を除去し、細胞沈降物を収穫する。残りの液体の一部は許可されています。溶液の完全な除去は、細胞の損失を促進する可能性があります。
- 細胞沈積物と温かい消化液2を15 mL遠心分離管に混ぜ、37°Cの水浴で5分間消化しながら混合物を振る。ステップ2消化またはニューロンの7分を超えないで滅びる。
- 消化後、10 mLのコールドリンス培地を混合したトリプシンを直ちに非アクティブ化する。
メモ:0°C~4°Cで以下の手順を実行します。 氷浴はそのような状態を提供することができます。 - 遠心分離後の細胞沈込を4°Cで4°Cで8分間収穫します。残りのトリプシンは細胞増殖に有害であるため、できるだけ多くの培地を取り除きます。
- 3 mLのニューロン培地で沈澱を緩やかに中断する。高い生存率のために細胞を含む溶液中に気泡が生成されないようにしてください。
- 70 μmのセルストレーナーを介して、50 mL遠心分離チューブに混合培地をフィルターします。
- 30rpmのシェーカーで30分間氷浴に入れ、濾過液を保管します。この手順は必須ではありませんが、推奨されます。
- 4°Cで356xgで8分間遠心分離して細胞を採取し、ニューロン培地Aの1mLで細胞ペレットを静かに再懸濁する。
- 調製した48ウェルプレートの各ウェルに500μLの細胞混合物を加えます。
- 培養細胞は、37°Cおよび5%CO2で培養器中に含まれる。
- すべての培地を1時間でニューロン培地Bに交換し、無血清培養を行う。
- ニューロン培地Bの半分を3日ごとに変更します。
注意:ニューロンは、培養5~7日後に免疫細胞化学実験を行う準備ができています。
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Representative Results
一次細胞培養の過程で、獲得した細胞は、付着状態の前に明るく明確な境界で丸くした。ニューロンが成長するにつれて、樹状突起と軸索は明確になり始めました。5~7日間培養した後、ニューロンは長い投影で成熟した形に達し、イメージングや機能研究に最適でした。不純物および細胞デブリの大部分は、メディアの変化により除去することができたが、ポリD-リジンおよびラミニンコーティングに付着した特定の残差が目に見えた(図1)。
適切な培養後、ニューロンは典型的なβ-III-管状およびMAP-2免疫染色10,12を介して同定することができた。また、グリアはGFAP免疫染色10を介して特異的に同定された。成熟したニューロンはシナプス棘を発症し、シナプスタンパク質メーカーの免疫染色によって同定されたシナプス前専門性に近かった、シナプシン-1(図2)12。これらの結果は、この方法を通じてよく発達したシナプスを有する成熟細胞が得られたことを示した。この結果は、将来の機能研究におけるその重要な役割を示唆している。
一方、いくつかのニューロンサブタイプは、免疫細胞化学実験を通じて認識された(図3)。ペプチド作動性ニューロンは、種々の神経ペプチドを含み、物質P13で免疫染色した。発現したベシカルヌクレオチドトランスポーターを有するピューリネ性ニューロンは、SLC17A9染色14を介して同定された。NITRERGICニューロンは、nNOSとニューロン15の運動タンパク質を結ぶDYNLL-2で視覚化された。コリン作動性ニューロンは、コリンアセチルトランスファーゼ16で免疫反応性を有した。
図 1.めっき後1、3、7日目に採取したラット膀胱培養から単離された初等細胞の位相コントラスト画像(それぞれA、B、C)。スケールバー:50 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.ラット膀胱から単離された初等細胞の免疫蛍光画像。 共焦点顕微鏡分析は、ニューロン細胞骨格タンパク質染色(β-III-管状、RRID:AB_2827688、1:200)を示し、一次培養ニューロン(A)および全体のマウント膀胱調製物(B)で。一次培養ニューロンでは、神経細胞リンフォ蛋白質免疫染色(MAP 2,RRID:AB_2827689,1:200)も可視化された(C)。グリア線維性酸性タンパク質染色を介してグリアを同定した (D;RRID: AB_627673、 1:50)。シナプシンはシナプシンタンパク質染色(シナプシン-1、RRID:AB_2798146、1:200)を細胞(E)および組織(F)レベルで可視化した。使用される二次抗体は次のとおりです: Alexa Fluor 488 (緑, ヤギ抗ウサギ lgG, 1:200), アレクサ Fluor 555 (赤, ヤギ抗マウス lgG, 1:200).この核は、Hoechst33342(A、C、D、E;青、1 μg/mL)を用いて可視化した。スケールバー:50 μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.一次ニューロンのいくつかのニューロンサブタイプの免疫蛍光画像。 ペプチド作動性ニューロンは、物質P(A;)で免疫染色された。RRID: AB_785913, 1:50)。細胞形成ニューロンはSLC17A9染色によって同定された (B;RRID: AB_10597575, 1:200)。DYNLL-2染色法(C)を介してニトレル作動性ニューロンを可視化RRID:AB_654147、1:50)。コリン作動性ニューロンは、コリンアセチルトランスファーゼで免疫反応性を有していた (D;RRID: AB_2244867, 1:100)。使用される二次抗体は次のとおりです: Alexa Fluor 488 (緑, ヤギ抗ウサギ lgG, 1:200), アレクサ Fluor 555 (赤, ヤギ抗マウス lgG, 1:200).この核を、Hoechst33342(A、B、C、D、青、1 μg/mL)を用いて可視化した。スケールバー:50 μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ざいりょう | モルリティ (mM) |
| ナシ | 120 |
| KCI | 5.9 |
| ナフコ3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| グルコース | 11.5 |
表 1.クレブス溶液組成物
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Discussion
プレートの準備
免疫蛍光またはカルシウムイメージング実験用の6-、12、または48ウェル培養プレートでのガラスカバーリップの使用は、経済的でサンプル節約的な操作です。細胞は、一次細胞培養の調製中にカバースリップのないプレートでよく成長する。そのため、カバーリップは、ウェスタンブロットまたはポリメラーゼ連鎖反応などの実験で欠かせない。さらに、コーティングは、細胞をめっきする前に、カバースリップの有無にかかわらず必要なステップである。ラミニンとポリ-D-リジンは、コーティングニューロン、特にラミニンで一般的な選択肢であり、ニューロンの成長に不可欠な17である。
メディアの準備
最初の培地置換後、血清は細胞分裂を刺激し、限られたニューロン成長空間18に導くため、細胞分離は血清を含まない培地を必要とする。したがって、ニューロンの成長因子は非常に重要です。B27 と GDNF の品質は、大きく異なるバッチから、ニューロンの成長に大きな影響を引き起こす19.したがって、ニューロンの収率が悪い場合は、メディアのロット数を確認することをお勧めします。一方、新鮮なメディアストックは非常に重要です。メディアを交換する前に、毎回必要な量を計算し、事前に準備する必要があります。
動物
この方法では、スプレイグラット-ドーリーラットが使用されます。C57BL/6マウスもこの実験で許容される。したがって、他のラットまたはマウス株も、形態および神経回路に少しのばらつきがあるにもかかわらず、この方法に採用され得る。異なる動物モデルの面では、研究者は最適化されたターゲットを絞ったプロトコルを開発する必要があります。さらに、若い動物は、この方法の適用前に常に考慮されるべきです。
組織治療
実験中は、消化プロセスを除き、細胞の生存率を高めるために組織を低温に保つことが不可欠であり、細胞代謝を低下させ、エネルギー不足を回避することができます。酸素レベル、栄養、およびpHはまた、細胞の収量11に影響を与えることができます。また、他の組織については、研究者が消化状態を調整してこの方法を実行することを提案します。
細胞培養
接種時のニューロンの顕著な特徴の1つは、コーティングされたプレート20への迅速な付着である。この場合、培養の1時間後に培地を変えることは、ニューロンの高い割合を得ることを推奨する。また、ほとんどの細胞が擬ポポイドを成長し始めると、メディアの色や細胞の状態に応じて、メディアの変化頻度を適宜低減することができる。良好な状態の一次細胞培養は、明るい境界線を持つ黒色ソーマを表示します。
膀胱から分離されたほとんどの神経細胞は、膀胱内神経節であり、膀胱13の排便および自律神経性の内インレーションからなる。さらに、採取した組織には主要な骨盤神経膠組織は存在しない。膀胱頸部21の下に分布する。
制約
これは、ニューロンとグリアを分離し、培養するための予備的な研究です。.シタラビン治療や密度勾配遠心分離など、多くの試みが行われていた。しかし、所望の細胞の割合はまだ理想的ではなく、さらに多くの細胞損失が現れた。また、37°Cのようなこのプロトコルにおける伝統的な消化条件は、いくつかの敏感なニューロンタイプを殺し、潜在的な遺伝子発現アーティファクト22を引き起こす可能性がある。
結論として、このプロトコルはラット膀胱からニューロンおよびグリアを培養する方法を提供する。分離は反復し易く、時間効率が良く、最低の微生物汚染を伴う。ニューロンの純度を呼び起こす改善が必要ですが、この方法がLUTNSの研究に貢献することを願っています。
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Disclosures
著者らは、大きな利益相反を宣言していない。
Acknowledgments
本研究は中国国立自然科学財団(グラント81673676)と東莞科学技術局(グラント2019622101002)によって支援されました。著者らは、メアリーローズ・サリバン博士(ハーバード大学医学部外科助教授)に技術コンサルティングをしてくれたことに感謝している。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
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