Summary
Este protocolo tenta estabelecer um protocolo repetível para neurônios primários e isolamento de glia da bexiga de rato para novos experimentos celulares.
Abstract
O trato urinário inferior tem duas funções principais: armazenamento periódico de urina e micturição; essas funções são mediadas através da neuroregulação central e periférica. Embora tenham sido realizadas extensas pesquisas sobre o sistema nervoso do trato urinário inferior, a maioria dos estudos tem se concentrado na cultura primária. Este protocolo introduz um método para o isolamento e cultura dos neurônios da bexiga e da glia dos ratos de Sprague-Dawley. Neste método, os neurônios e a glia foram incubados em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 5-7 dias. Como resultado, eles cresceram em formas maduras adequadas para experimentos de imunofluorescência subsequentes relacionados. As células foram observadas morfologicamente usando um microscópio óptico. Neurônios, vesículas sinápticas e glia foram identificados por β-III-tubulina e MAP-2, Sinapsin-1 e GFAP, respectivamente. Enquanto isso, a imunocitoquímica foi realizada em várias proteínas relacionadas ao neurotransmissor, como acetiltransferase de colina, DYNLL2 e SLC17A9.
Introduction
O trato urinário inferior tem duas funções principais: armazenamento periódico de urina e micturição1. O sistema nervoso do trato urinário inferior (LUTNS) controla essas funções e é delicado e suscetível a muitas neuropatias, que podem ser inatas (porfiria), adquiridas (doença de Lyme), secundárias aos estados da doença (cistopatia diabética), induzida por drogas (cistite hemorrágica), cirurgia causada (ressecção abdominoperineal) ou lesão causada (lesão medular traumática)2,3,4,5,6,7. Em estudos fisiológicos/patológicos, experimentos in vivo e in vitro são igualmente importantes. Enquanto a pesquisa in vivo em LUTNS tem sido conduzida em níveis de órgãos, celulares e moleculares há algum tempo, a pesquisa in vitro sobre neurônios primários da bexiga urinária é quase inexistente8,9. Embora o presente estudo seja limitado, esperamos ser pioneiros em pesquisas nessa área para que outros pesquisadores possam melhorá-la. Dessa forma, essa cocultura pode levar a uma compreensão celular da disfunção fisiológica em fenótipos, como a disfunção do neurônio da bexiga.
Em contraste com os músculos entéricos com uma direcionalidade clara das células musculares em camadas discretas, os músculos da bexiga são desorganizados10. Portanto, em vez de descascar a camada externa da bexiga, este método propõe digerir toda a bexiga para reduzir a dificuldade de operação e encurtar o tempo de pré-processamento para uma alta taxa de sobrevivência celular.
Seguindo este método, podemos obter uma cultura mista de neurônios e outras células. As outras células são indispensáveis porque sua presença imita um ambiente in vivo11. Além disso, essas células fornecem as substâncias que não estão disponíveis no meio.
Este método envolve dois passos para a digestão. Primeiro, a colagem tipo II é usada para hidrolisar colágeno, seguido de trippsina, para dissociar o tecido nas células10. Dessa forma, os tecidos da bexiga são dispersos em células únicas e, em seguida, crescem relativamente independentes. Quando a cultura dos neurônios amadurece, os neurônios podem ser usados para imagens ou ensaios funcionais.
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Protocol
Todos os protocolos experimentais e procedimentos animais cumpriram as diretrizes do princípio ético do Conselho Nacional de Pesquisa.
1. Preparação de materiais
- Esterilize todos os instrumentos e ddH2O usando uma autoclave antes de realizar o experimento. Os instrumentos incluem, mas não se limitam a tesouras cirúrgicas, tesoura oftálmica, fórceps, divisor de núcleos de colheres, pratos de vidro (60-100 mm de diâmetro) e quebra-vidros.
- Prepare a solução Krebs da seguinte forma(Tabela 1): Dissolva todos os produtos químicos juntamente com ddH2O antes de usar. Dissolva o CaCI2 separadamente e adicione lentamente na solução mista enquanto mexe para evitar sedimentos.
- Prepare a mídia Rinse, que consiste em mídia F12 com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% antibiótico/antimíctico (100x). Adicione 5 mL de FBS e 0,5 mL de antibiótico/antimíctico a 44,5 mL de mídia F12.
- Prepare a mídia de neurônioS A, que compreende a mídia neurobásica A com 2% B-27, 1% FBS, 1% L-glutamina, 1% antibiótico/antimíctico (100x) e fator neurotrófico derivado de glia de 0,1% (GDNF). Adicione 200 μL de B-27, 100 μL de FBS, 100 μL de L-glutamina, 100 μL de antibiótico/antimíctico (100x) e 10 μL de GDNF (10 μg/mL) a 9,5 mL de mídia neurobásal A.
NOTA: Prepare a mídia de neurônios A dentro de uma semana de uso para garantir o frescor de B-27, L-glutamina e GDNF. - Prepare a mídia de neurônio B usando o mesmo procedimento que a preparação da mídia de neurônios A, mas sem adicionar FBS.
- Prepare a solução de digestão 1 dissolvendo 20 mg de colagenase tipo II, 6 mg de albumina de soro bovino e 200 μL de antibiótico/antimíctico (100x) em 10 mL de solução krebs estável em oxigênio.
- Prepare a solução de digestão 2 diluindo 1 mL de 0,25% de trippsina com 4 mL da solução de sal balanceada da Hank.
- Prepare um prato com tampas revestidas.
- Use fórceps em um banco de fluxo laminar ao colocar tampas de vidro em uma placa de cultura de 48 poços.
- Diluir a poli-D-lysina com ddH2O a uma concentração de 0,1 mg/mL como estoque de poli-D-lysina. Armazene o estoque a -20 °C e descongele antes de usar.
- Adicione 40 μL de material de poli-D-lisina em cima de cada deslizamento de cobertura, e incubar a solução em temperatura ambiente por 10 minutos.
NOTA: Para diferentes placas com diferentes áreas basais, ajuste a concentração para 4 μg/cm2. Por exemplo, se a área basal de um poço de uma placa de 24 poços é de 2 cm2,então devemos transferir 80 μL de estoque de poli-D-lysina em um poço. Cada cm2 conteria 4 μg de poli-D-lysine. - Remova a poli-d-lisina na placa de 48 poços e enxágue os deslizamentos com ddH2O três vezes.
- Seque a placa em um capô de fluxo laminar por pelo menos 30 minutos para garantir que a placa esteja anidro.
- Armazene a placa a 4 °C antes do revestimento de laminina durante no máximo 1 dia. Armazenar a placa a −20 °C é preferível para armazenamento a longo prazo.
- Descongele laminina a 4 °C. Diluir laminina com ddH2O a uma concentração de 50 μg/mL como estoque de laminina. Armazene o estoque a -20 °C e descongele a 4 °C antes de usar.
- Use uma pipeta para transferir 100 μL de laminina diluída para o topo de cada deslizamento de cobertura e incubar laminina a 4 °C por 1h.
NOTA: Para diferentes placas com diferentes áreas basais, ajuste a concentração para 5 μg/cm2. Por exemplo, se a área basal de um poço de uma placa de 24 poços for de 2 cm2, então transfira 200 μL de laminina diluída em um poço. Cada cm2 conteria 5 μg de laminina. - Remova a solução de laminina e enxágue as tampas com ddH2O uma vez. Realize esta operação na borda do deslizamento para evitar raspagem.
NOTA: As tampas revestidas podem ser armazenadas a 4 °C durante 2 semanas no máximo.
2. Colheita da bexiga
- Obter ratos Sprague-Dawley de cinco semanas de idade.
- Infundir carbogen (95% oxigênio, 5% CO2) na solução Krebs por pelo menos 30 minutos em um banho de gelo para atingir um estado estável de oxigênio e nível de pH.
- Após a eutanásia por deslocamento cervical, mergulhe os ratos em 75% de etanol para 30 s para esterilização.
- Coloque ratos em uma toalha cirúrgica esterilizada e exponha seu abdômen. Abra a cavidade abdominal e revele a bexiga com um conjunto de tesouras e fórceps.
- Levante a bexiga suavemente e corte a bexiga do pescoço da bexiga com outro conjunto de tesouras e fórceps para evitar contaminação cruzada. Coloque a bexiga rapidamente em solução krebs estável em oxigênio frio para melhorar a sobrevivência celular.
NOTA: Uma vez que a bexiga é removida, realize as seguintes operações rapidamente para melhorar a perspectiva de sobrevivência dos neurônios. - Adicione a solução Krebs em três pratos de vidro e quebra-vidros.
- Prepare pratos de vidro e quebra-vidros com solução Krebs em um banho de gelo para pré-fabricação.
- Marque esses recipientes com números 1-3 correspondentemente para evitar confusão.
- Emparelhe cada prato de vidro com fórceps e um divisor de núcleos colheres.
- No prato de vidro 1, abra a bexiga com uma tesoura oftálmica, e desdobre-a com fórceps e um divisor de núcleos de colheres.
- Enxágüe a bexiga no quebra-vidro 1 e coloque-a no prato de vidro 2.
- Elimine a gordura aderente na superfície do tecido usando as fórceps e a tesoura oftálmica no prato de vidro 2.
- Enxágüe a bexiga no quebra-vidro 2 e coloque-a no prato de vidro 3.
- Raspe suavemente a bexiga usando as fórceps e o divisor do núcleo das colheres no prato de vidro 3 para remover os acessórios exógenos.
- Enxágüe a bexiga no disjuntor de vidro 3, transfira a bexiga para um tubo de centrífugas de 15 mL com 14 mL de solução krebs fria, e gire a amostra por 1 min a 356 x g e 4 °C.
- Repita a etapa anterior duas vezes em dois outros tubos com solução Krebs para reduzir a contaminação.
3. Digestão da bexiga de dois passos
- Transfira a bexiga do tubo centrífuga para um frasco de 2 mL contendo 1 mL de solução de digestão 1. Use uma tesoura oftálmica para cortar a bexiga em pequenos pedaços (menores que 1 mm) na solução.
- Misture a solução da bexiga com 9 mL de solução de digestão 1 em um prato de cultura celular estéril (100 mm de diâmetro). Realize a digestão passo 1 em uma incubadora de agitação por 1h abaixo de 5% de CO2, 37 °C e 200 rpm.
- Após a digestão do passo 1, centrifugar a solução a 356 x g a 4 °C por 8 min.
- Coloque a solução de digestão 2 em um banho de água de 37 °C para pré-aquecimento.
- Após a centrifugação, remova o sobrenante que contém a solução de digestão 1, e colmeia o sedimento celular. Algum líquido restante é permitido. A remoção completa da solução pode promover a perda celular.
- Misture sedimentos celulares com solução de digestão quente 2 em um tubo de centrífugas de 15 mL e agite a mistura enquanto digere em um banho de água de 37 °C por 5 min. Não exceda 7 minutos de digestão do passo 2 ou os neurônios perecerão.
- Após a digestão, desative imediatamente a trippsina na mistura com 10 mL de mídia de lavagem a frio.
NOTA: Realize as seguintes etapas em 0 °C–4 °C. Um banho de gelo poderia fornecer tal condição. - Colher o sedimento celular após centrifugação a 356 x g a 4 °C por 8 min. Remova o máximo de mídia possível porque a trippsina restante é prejudicial ao crescimento celular.
- Sedimento resuspend com 3 mL de mídia de neurônios suavemente. Certifique-se de que as bolhas de ar não sejam geradas na solução que contém células para uma alta taxa de sobrevivência.
- Filtre a mídia da mistura através de um coador de células de 70 μm em um tubo centrífuga de 50 mL.
- Mantenha o filtrado em um shaker a 30 rpm em um banho de gelo por 30 minutos. Esta etapa não é necessária, mas recomendada.
- Coletar células por centrifugação a 356 x g a 4 °C por 8 min, e resuspensar suavemente as pelotas celulares em 1 mL de mídia neurônio A.
- Adicione 500 μL de mistura celular em cada poço da placa de 48 poços preparada.
- Células de cultura em uma incubadora a 37 °C e 5% DE CO2.
- Substitua toda a mídia por mídia de neurônios B em 1h para fornecer uma cultura livre de soro.
- Troque metade da mídia de neurônios B a cada 3 dias.
NOTA: Os neurônios estão prontos para experimentos imunocitômicos após 5-7 dias de cultura.
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Representative Results
No processo de cultura celular primária, as células adquiridas eram redondas com limites brilhantes e claros antes do estado anexo. À medida que os neurônios cresciam, dendritos e axônios começaram a ser distintos. Após 5 a 7 dias de cultura, os neurônios atingiram uma forma madura com projeções longas, que eram ideais para estudos de imagem ou função. Embora a maioria das impurezas e detritos celulares pudessem ser removidos devido à mudança de mídia, certos resíduos ligados ao revestimento de poli-D-lysina e laminina eram visíveis(Figura 1).
Após a cultura adequada, os neurônios poderiam ser identificados através de imunossulinas típicas β-III e IMUNOstaining MAP-210,12. Além disso, glia foi especificamente identificada via GFAP imunostaining10. Os neurônios maduros desenvolveram espinhas sinápticas, próximas às especializações pré-sinápticas identificadas pela imunossínia do fabricante de proteína sináptica, sinapsina-1 (Figura 2)12. Esses resultados indicaram que células maduras com sinapses bem desenvolvidas foram obtidas através deste método. Esse resultado sugere seu importante papel em estudos de funções futuras.
Enquanto isso, vários subtipos de neurônios foram reconhecidos por meio de experimentos imunocitoquímicos(Figura 3). Os neurônios peptidericos, que contêm vários neuropeptídeos, estavam imunossutos com a substância P13. Neurônios purinérgicos com transportadores de nucleotídeos vesiculares expressos foram identificados via mancha SLC17A914. Os neurônios nitrérgicos foram visualizados com DYNLL-2, que conecta nNOS com proteínas motoras em neurônios15. Os neurônios colinérgicos eram imunoretivos com acetiltransferase de colina16.
Figura 1. Imagens de contraste de fase de células primárias isoladas da cultura da bexiga de rato tiradas em 1, 3 e 7 dias após o revestimento (A, B, C, respectivamente). Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagens de imunofluorescência de células primárias isoladas da bexiga do rato. A análise da microscopia confocal mostrou a coloração da proteína do citoesqueleto neurônio (β-III-tubulina, RRID: AB_2827688, 1:200) em neurônios de cultura primária(A) e em toda a preparação da bexiga de montagem(B). Nos neurônios da cultura primária, também foi visualizado o imunostaining de fosfoproteína neuronal (MAP 2, RRID:AB_2827689, 1:200)(C). Glia foram identificadas por meio de coloração de proteína ácida fibrilar glial (D; RRID: AB_627673, 13h50). As sinápsias foram visualizadas através da coloração da proteína sináptina (Synapsin-1, RRID: AB_2798146, 1:200) nos níveis celular (E) e tecido (F). Os anticorpos secundários utilizados foram os seguintes: Alexa Fluor 488 (verde, anti-coelho de cabra lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (vermelho, anti-rato de cabra lgG, 1:200). O núcleo foi visualizado utilizando Hoechst 33342 (A, C, D, E; azul, 1 μg/mL). Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Imagens de imunofluorescência de vários subtipos de neurônios primários. Os neurônios peptidericos foram imunossutives com substância P (A; RRID: AB_785913, 13h50). Os neurônios purinérgicos foram identificados via coloração SLC17A9 (B; RRID: AB_10597575, 13h200). Os neurônios nitrérgicos foram visualizados através da coloração DYNLL-2 (C; RRID: AB_654147, 13h50). Os neurônios colinérgicos eram imunoretivos com acetiltransferase de colina (D; RRID: AB_2244867, 13h100). Os anticorpos secundários utilizados foram os seguintes: Alexa Fluor 488 (verde, anti-coelho de cabra lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (vermelho, anti-rato de cabra lgG, 1:200). O núcleo foi visualizado utilizando Hoechst 33342 (A, B, C, D, azul, 1 μg/mL). Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ingredientes | Molaridade (mM) |
| NaCI | 120 |
| Kci | 5.9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| glicose | 11.5 |
Mesa 1. Composição da solução Krebs
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Discussion
Preparação da placa
O uso de tampas de vidro em placas de cultura de 6, 12 ou 48 poços para experimentos de imagens imunofluorescentes ou de cálcio é uma operação econômica e poupadora de amostras. As células crescem bem em placas sem tampas durante a preparação das culturas celulares primárias. Portanto, as tampas são dispensáveis em experimentos, como a mancha ocidental ou a reação em cadeia de polimerase. Além disso, o revestimento é um passo necessário antes de emplacamento de células, com ou sem tampas. Laminina e poli-D-lisina são escolhas comuns em neurônios de revestimento, particularmente laminina, que é essencial para o crescimento de neurônios17.
Preparação de mídia
Após a primeira substituição média, o isolamento celular requer mídia sem soro porque o soro estimula a divisão celular e leva a um espaço limitado de crescimento de neurônios18. Assim, os fatores de crescimento dos neurônios são cruciais. A qualidade de B27 e GDNF pode variar em grande parte de diferentes lotes e causar grandes efeitos no crescimento dos neurônios19. Portanto, verificar o número de lotes da mídia é recomendado quando o rendimento dos neurônios é ruim. Enquanto isso, o estoque de mídia fresco é crucial; o valor necessário deve ser calculado e preparado com antecedência a cada vez antes da substituição da mídia.
Animais
Ratos sprague-dawley são usados neste método. Os camundongos C57BL/6 também são aceitáveis neste experimento. Portanto, outras cepas de ratos ou camundongos também podem ser adotadas para este método, apesar de algumas variações na morfologia e circuitos neuronais. Em termos de diferentes modelos animais, os pesquisadores devem desenvolver um protocolo otimizado e direcionado. Além disso, os animais jovens devem ser sempre considerados antes da aplicação deste método.
Tratamento de tecidos
Durante os experimentos, com exceção do processo digestivo, manter os tecidos a uma temperatura baixa é essencial para aumentar a viabilidade celular, o que pode reduzir o metabolismo celular e evitar o déficit energético. Níveis de oxigênio, nutrição e pH também podem afetar o rendimento celular11. Além disso, para outros tecidos, sugerimos que os pesquisadores realizem esse método com condição de digestão ajustada.
Cultura Celular
Uma característica notável dos neurônios quando inoculados é sua rápida adesão às placas revestidas20. Neste caso, a mudança de mídia após 1h de cultura é recomendada para ganhar uma alta proporção de neurônios. Além disso, quando a maioria das células começa a crescer pseudopodium, a frequência de mudança de mídia pode ser reduzida adequadamente dependendo da cor da mídia e do estado celular. A cultura celular primária em um bom estado exibe soma negra com uma borda brilhante.
A maioria das células nervosas isoladas da bexiga são gânglios intramuros da bexiga, que consistem em inervações eferentes aferentes e autônomas da bexiga13. Além disso, não há gânglios pélvicos importantes presentes no tecido colhido. Ele distribui abaixo do pescoço da bexiga21.
limitação
Esta é uma pesquisa preliminar para isolar e cultivar neurônios e glia. Muitas tentativas foram feitas, como tratamento de cytarabina ou centrifugação gradiente de densidade. No entanto, a proporção de células desejadas ainda não era ideal, e ainda mais perda celular apareceu. Além disso, as condições digestivas tradicionais neste protocolo, como 37 °C, são susceptíveis de eliminar alguns tipos sensíveis de neurônios, e causar potenciais artefatos de expressão genética22.
Em conclusão, este protocolo oferece um método para cultivar neurônios e glia da bexiga de rato. O isolamento é fácil de repetir, eficiente no tempo e envolve contaminação microbiana mínima. Embora a melhoria evocando a pureza dos neurônios seja necessária, esperamos que este método contribua para a pesquisa lutns.
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Disclosures
Os autores não declaram nenhum grande conflito de interesses.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant nº 81673676) e pelo Dongguan Science and Technology Bureau (Grant nº 2019622101002). Os autores agradecem à Dra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
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