Summary
尿管性リンパ管の外科的縫合によってリンパの流れを遮断するプロトコルが提示される。
Abstract
リンパ管は、組織液バランスを維持し、抗原、サイトカイン、細胞をリンパ節(LNs)に輸送することで免疫保護を最適化する上で重要です。リンパ管の機能を研究する際のリンパ流の中断は重要な方法である。マウスフットパッドからポピトリリンパ節(pRN)までの不浸透性リンパ管は、リンパがpRNに排出される唯一の経路として明確に定義されている。これらの不透過性リンパ管を縫合すると、リンパのリンパ流を選択的に防ぐことができます。この方法は、排水pLN、気泡性リンパ管、ならびに領域の周りの他のリンパ管におけるリンパ内皮細胞への損傷を最小限に抑えてリンパ流の干渉を可能にする。この方法は、LNにおける高内皮小胞(HEV)およびケモカイン発現にリンパ管がどのように影響し、機能的なリンパ管がない場合にLNを取り巻く脂肪組織をリンパがどのように流れるかを研究するために使用されてきた。リンパ機能の重要性の認識が高まる中、この方法は、LN微小環境および免疫応答を調節するリンパ管の機能をさらに解明するためのより広範な応用を有するであろう。
Introduction
リンパ系の空間組織は、細胞外液を効率的に除去し、抗原および抗原提示細胞(APC)を排出するLNsに輸送するための構造的および機能的なサポートを提供する。初期リンパ管(リンパ管管とも呼ばれる)は、細胞間の不連続な接合により透過性が高く、周囲の細胞外空間から液体、細胞、および他の物質を効果的に収集しやすくする1。最初のリンパ管は、細胞間の接合が緊密で、連続的な基盤膜、リンパ筋のカバレッジを有するリンパ管を採取する。リンパ管の採取は、採取したリンパを排水中のLUNに輸送し、最終的にリンパを循環2,3に戻す役割を担う。リンパを排水LNに推進する集水性リンパ管は、不発泡リンパ管4、5、6、7である。発泡性リンパ管の閉塞は、リンパ流の機能を研究する際に有用な技術であるLNsへのリンパ流を遮断する可能性がある。
これまでの研究では、リンパ流は抗原およびAPCを輸送するだけでなく、LN恒常性を維持する上で重要な役割を果たしていることを示している。組織由来のAPCは、典型的には活性化された回遊樹状細胞(DC)が、不透過性リンパ管を通過してLNに移動し、T細胞8を活性化することがよく理解されている。微生物や可溶性抗原などの自由形抗原が、LNにリンパを持って受動的に流れ、LN居住APcを活性化するという考え方は、過去10年間で9、10、11、12で受け入れられています。リンパを伴って移動する自由形抗原は、感染後数分でLNに移動し、LN常駐細胞活性化は刺激後20分以内に起こり得る。これは、ドレイン LN9に入るのに 8 時間以上かかる DC の移行のアクティブ化よりもはるかに高速です。免疫保護を開始するために抗原を輸送することに加えて、リンパはまた、その微小環境を維持するためにサイトカインおよびDCをLNに運び、免疫細胞恒常性13、14をサポートする。以前は、アフェレントリンパ管を縫合することによりリンパ流を遮断し、LN15、16、17にホメオスタティックT細胞およびB細胞ホーミングをサポートするために必要なHEV表現型を維持するために必要なリンパが必要であることを実証した。CCL21は、LN8、18におけるDCおよびT細胞の位置を指示する重要なケモカインである。リンパ流を遮断すると、LNにおけるCCL21発現が中断し、LN19におけるDCおよびT細胞の位置決めおよび/または相互作用を中断する可能性がある。したがって、リンパ流を遮断すると、LN内の免疫応答を調節するLN微小環境を破壊することによって、抗原/DCのドレインLNへの直接または間接的なアクセスを遮断することができる。リンパ流の機能をより的調するために、フットパッドからpLNに対して、マウスのリンパ流を遮断する実験プロトコル(図1)を提示する。この方法は、健康で病気の状態でリンパ機能に関する将来の研究のための重要な技術となり得る。
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Protocol
すべての動物の仕事は、制度的および政府の倫理と動物の取り扱い委員会によって承認される必要があります。 これは非生存手術です。
1. 材料の準備
- 70mLのエタノール70mLを30mLの無菌水と混合して、70%エタノールの100mLを調製します。手術前にすべての手術ツールをオートクレーブし、殺菌を維持するために手術前と手術中に70%エタノールでツールを維持します。
- 注射装置を準備します。
- ポリエチレンチューブ(直径0.28mm)を30cmカット。30 G x 1/2 針の先端 (針 A) をポリエチレンチューブの一端に接続します。慎重に別の30 G x 1/2針(針B)を取り外し、壊れた側をポリエチレンチューブのもう一方の端に接続します。
- 1 mL 結核シリンに針Aを取り付けます。
注:このポリエチレンチューブの場合、チューブ内の1.6 cmの流体は1 μL20に相当します。
- 10:1ケタミン/キシラジン混合物(10 mg/mLケタミンと1mg/mLキシラジン)を塩分(静菌0.9%[w/v]塩化ナトリウム)で調製します。使用前にソリューションを新たに準備してください。
2. 手術のための動物の準備
注:6-10週齢のマウスを使用してください。雌マウスと雄マウスの両方を使用できます。本研究では、生後6−10週齢のC57BL/6雌マウスを使用した。この方法は、他のマウス株に適合させることができる。
- 腹腔内に250μLのケタミン/キシラジン混合物を注入してマウスを麻酔します。マウスが完全に眠るまで待ちます。マウスがつま先のピンチに反応せず、完全な麻酔を検出しないようにします。
- 髪の毛のバリカンで脚の周りに毛皮を剃ります。
- 脚の周りに脱毛クリームを塗布し、5分待ちます。湿った組織を使用して残留ファーと脱毛クリームを拭き取り、滅菌水で脚をきれいにします。脚の周りに70%エタノールをスプレーして、手術領域を殺菌します。エタノールは、切開部位に制限されています.
3. 不発性リンパ管の外科的縫合
注: 右脚が縫合され、左脚がシャムコントロールとして使用されます。リンパ縫合プロトコル(ステップ3.1-3.8)は20〜30分かかります。
- マウスを起こしやすい位置に保ち、外科用テープで固定して右足の手術領域を露出させます。
- イント皮下にフットパッドにチューブ注入装置の1%エバンスブルー染料または9cmの流体の5μLを注入します。静かにエバンスブルーがリンパ管に入るのを助けるためにフットパッドをマッサージします。
注:インスリン注射器は、少量注入のために制御することは容易ではありません。この容積は、注入装置を用いてより正確に制御することができる。リンパ管は皮膚下の青色染料によって可視化される。広範な訓練により、両方の眼下リンパ管は、サペヌス動脈と平行な脂肪組織の透明な血管として肉眼で見ることができる。広範な訓練によって、染料からの潜在的な妨害の懸念がある場合にエバンスブルー染料を注入せずに容器を縫合することが可能である。 - 解剖顕微鏡下で、卵子の下端から5mmの切開部位を選択します。皮膚に小さな切開(約5mm)をはさみで作ります。微細な操作鉗子を用いて、切開を伸ばし、採取したリンパ管を露出させる(図1A)。
注:必要に応じて、小さな皮膚断片を取り除き、リンパ管を露出させることができます。 - pRNに至る両方の異性リンパ管を解剖顕微鏡で同定する(図1B)。
注:フットパッドからpLNまで、2つの感性リンパ管があります。両方ともリンパの流れを完全に遮断するために縫合される必要がある。 - 針ホルダーを使用して、眼下リンパ管とサフェヌス動脈の間に縫合針(0.7メートル以下)を慎重に挿入し、眼球リンパ管の周りに針をそっと引き出す。縫合糸ストリングをそっと引っ張り、縫合糸の約2cmを後ろに残します。針ホルダーを使用して、ひもをしっかりと縫合して、外科医の結び目を持つ1つのリンパ節を縫合するのに役立ちます(図1C)。
注:切開部の下の組織は、空気への長時間の暴露で乾燥する可能性があります。切開をできるだけ小さくし、縫合を速やかに行う(すなわち5分以内)組織が乾燥するのを防ぎます。綿棒で少量の生理食水を塗布することで、組織の水分を維持します。 - フットパッドを穏やかにマッサージして、エバンスブルー染料が縫合部位を通過しないようにしてから、余分なひもをはさみで切ります。
- 他の不感なリンパ血管に同じ縫合ステップ(すなわち、ステップ3.5および3.6)を行う(図1D)。ステップ3.5で血管を縫合するために使用したのと同じ縫合糸で皮膚切開を閉じる(図1E)。
- シャムコントロールのために、皮内に左フットパッドに1%のエバンスブルー染料の5μLを注入し、リンパ管を視覚化するためにフットパッドをマッサージする。切除で皮膚を開き、血管を縫合せずに傷口を閉じる(図1F)。
- 必要に応じて、操作されたマウスを2-4時間監視します。脚の縫合線側は、エバンスブルーが太ももに広がった浮腫を示し、コントロールレッグはフットパッドに制限されたエバンスブルー染料を示すはずです。マウスが目覚めた場合、追加のケタミン/キシラジンミックスが注入され、安楽死するまで麻酔を維持する。
4. リンパ流の追跡
- 手術直後、皮内に2%フルオレセインイソチオシアネート(FITC)の10μLをコントロールとリンパ球縫合脚の両方のフットパッドに注入する。
- ケタミン/キシラジン混合物の400 μLでマウスを安楽死させ、マウスを完全に麻酔をしたとき、子宮頸部転位を行います。
- POPLITEフォッサからpRNを収集し、FITC注入後2、6、12時間で解剖顕微鏡の下でpRNの周りのペリノダル脂肪組織を慎重に除去します。
- 最適な切断温度(OCT)化合物で、クリオブオールの側面に向いた髄質洞領域をpRNに埋め込む(図1G,H)。
- 凍結煙を使用して20μmの凍結セクションを準備します。
- 共焦点顕微鏡の下でクライオセクションを画像化してFITC分布を決定します。
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Representative Results
リンパ管縫合は、リンパ管の分子生物学が理解される前にリンパ流の機能を研究する重要なツールとして役立った以前の研究15、16、17、19で使用されてきた。リンパ流を遮断するとLN恒常性が遮断され、これは、LN15、16、17への最適なリンパ球ホーミングに必要な臨界遺伝子発現を失うことにつながる。それ以来、リンパを持って移動するDCがLN13にホーミングHEV遺伝子発現プロファイルおよびリンパ球を維持する上で重要であることを実証するのにさらに20年かかりました。リンパ流によって提供されるせん断応力は、LNにおけるケモカイン発現を刺激するために重要である。リンパ流を遮断すると、LN19におけるケモカインCCL21発現が遮断され、これはLNにおけるDCおよびT細胞の位置を指示する上で重要である。したがって、中断されたフローは、LN8、18に位置する DCとT セルを危険にさらす可能性があります。
手術直後、小さな分子量蛍光トレーサーFITCをリンパ流を追跡するために使用した。FITC(2%FITCの10 μL)は、恥のコントロールおよびリンパ球縫合脚のフットパッドに皮内注射した。排水pRNを2、6、および12時間後に回収した。排水pRNはOCTに埋め込まれ、20μmの凍結セクションが用意されました。共焦点画像は、縫合後のpRNにおけるFITC蓄積を大幅に減少させた。pRN中の残留FITCはLN副鼻腔に優先的に蓄積された(図2)。
LNを取り巻く脂肪組織をリンパがどのように流れるかをリンパ縫合糸を用いて調べた。pRNに至る気泡性リンパ管をリンパ流を遮断するために縫合し、リンパ管が閉塞した場合には、過次脂肪組織が少量のリンパ流を支えることができると判断した。LNのカプセルへの脂肪組織を通るリンパ流はマッピングされた;それはLN副鼻腔に供給するように見えた。少量のリンパが時間の経過とともにLN副鼻腔に流入した可能性がある(図3)。
図1:ポピタルLN(pLN)のアフェレントリンパ管縫合のステップ。簡単に言えば、マウスをケタミンとキシラジン混合物で麻酔した後、それらの足を剃り、残りの毛皮を脱毛クリームによって除去した。右足は縫合糸に使用され、左足はシャムコントロールでした。フットパッドの右側は、PBSで調製された1%のエバンスブルー染料の5μLを皮内に注入した。(A)フットパッドを軽くマッサージすることで、エバンスブルー染料は、不用なリンパ管を満たした。(B) 2本の白い矢印で示されるリンパ管を露出させるためにpLNから5mm離れた小さな皮膚切除を行った。(C,D)両方の異性リンパ管が縫合された。(E)皮膚切除は縫合によって閉じられた。(F)コントロールレッグは、リンパ管を縫合することなく、エバンスブルー注射、皮膚切除、縫合閉鎖を受けた。(G)リンパ流閉塞の成功は、コントロールレッグのpLNに入ったが、縫合脚には入らなかったエバンスブルー染料によって示された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:シャムまたは縫合脚の排水中のPRNにおけるFITC分布。FITC注射後2、6、および12時間収集されたpRNの共焦点像は、縫合後のpRNにおけるFITC蓄積を大幅に減少させた。pRN中の残留FITCはLN副鼻腔に優先的に見られた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:周回脂肪組織(PAT)におけるFITC分布は、恥または縫合脚の排水pRNの周りである。PATとLNの共焦点画像は、FITCがPATおよびLN副鼻腔に入るが、リンパ管が閉塞したときにLN全体に効果的に分布していないことを示した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
リンパ流を遮断することは、健康で病気の状態でLNへの抗原送達を操作する広範な用途を有するであろう。この方法を用い、連続リンパ流がリンゲンの流出における免疫応答を調節する方法を研究するために、抗原送達のタイミングを制御することができる。リンパ流中断のこの方法は、リンパがLNにおける細胞区画化、細胞活性化、細胞移動、および細胞間相互作用に与える影響を研究するためにも使用することができる。
ヒトジフテリア毒素受容体(DTR)をリンパ管内皮細胞(Flt4-cre-dtr)で特異的に発現するマウスが開発されている。これらは、リンパ管を特異的に枯渇させるためにリンパ管を枯渇させるためにリンパ管機能22を研究するために使用することができる。DTの投与は、リンパ管に沿って、LNでリンパ内皮細胞を殺す。リンパ性内皮細胞の枯渇は、リンパ機能を研究するために、局所的または全身的にリンパ流を完全に消耗させることができる。この方法は、組織に重要な流体蓄積を引き起こし、リンパ浮腫およびリンパ機能を研究するための素晴らしいモデルとして機能します。
リンパ管内皮細胞特異的DTR発現モデルと比較すると、リンパ系縫合法の利点は、リンパ管内皮細胞または他のリンパ管の周囲の損傷を最小限に抑え、リンパ流を遮断する点である。この介入は、ドレインLN内の細胞に直接影響を与えないので、LN微小環境または免疫細胞通信への影響は、DTによって誘発される潜在的な細胞死ではなく、リンパ流遮断の結果である。この方法のもう一つの利点は、リンパ流が手術後に即座に遮断されるため、リンパ流遮断のタイミングをより良く制御できることである。
この方法の制限は、フットパッドからpLNへの不フェレンスリンパ管内のリンパ流の局所的介入を研究するためにのみ使用できることである。この方法は、収集するリンパ管の正確な位置を特定する必要があります。リンパ管の採取は、いくつかの解剖学的場所で識別することは困難であり、したがって、この技術は、リンパの流れを遮断するために、発泡性リンパ管の同定に成功する前に、広範な解剖学的および外科的訓練を必要とする。もう一つの制限は、この方法は、最初のリンパ管に入るリンパを直接遮断できないことです。縫合後、閉塞したリンパ流は間質液圧を増加させ、最初のリンパ管のリンパ流方向を変化させる。したがって、領域の周りの無傷のリンパ管は、中断されたリンパ管の機能を補い、リンパ流の方向を変え得る。
さらに、エバンスブルー色素の注入は、間質液圧を増加させ、その後のトレーサーまたは抗原注入を妨げる可能性がある。エバンスブルー色素の自己蛍光は、他の蛍光トレーサーや免疫蛍光染色に使用される他の蛍光性蛍光体と干渉する可能性があります。エバンスブルー染料と潜在的抗原、他のトレーサー、またはリンパ機能調節の潜在的な分子機構との間の相互作用を避けるために、エバンスブルー染料なしで採取したリンパ管を肉眼で同定することができる。これは、船舶を識別するための広範な訓練で達成することができます。イスルファンブルー染料などの他の染料も、エバンスブルー染料を交換するために使用することができる。
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Disclosures
著者らは開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、原稿の校正をアヴァ・ザルディネズハドに感謝する。この研究は、カナダ保健研究所(CIHR、PJT-156035)、カナダSLイノベーション財団(32930)、中国国立自然科学財団(81901576)によって支援されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
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