Summary
Ein Protokoll zur Blockierung des Lymphflusses durch chirurgische Saat ierung von afferent lymphatischen Gefäßen wird vorgestellt.
Abstract
Lymphgefäße sind entscheidend für die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts der Gewebeflüssigkeit und die Optimierung des Immunschutzes durch den Transport von Antigenen, Zytokinen und Zellen zu entwässernden Lymphknoten (LNs). Unterbrechung des Lymphflusses ist eine wichtige Methode bei der Untersuchung der Funktion von Lymphgefäßen. Die affeken Lymphgefäße vom murinen Fußpolster bis zu den poplitealen Lymphknoten (pLNs) sind als die einzigen Wege für die Lymphdrainage in die pLNs klar definiert. Das Abtinnen dieser affemenden Lymphgefäße kann selektiv den Lymphfluss zu den pLNs verhindern. Diese Methode ermöglicht Störungen des Lymphflusses mit minimalen Schäden an den lymphatischen Endothelzellen in den entwässernden pLN, den affepfen den Lymphgefäßen sowie anderen Lymphgefäßen in der Umgebung. Diese Methode wurde verwendet, um zu untersuchen, wie Lymphe hohe endotheliale Venule (HEV) und Chemokinexpression in der LN beeinflusst und wie Lymphe durch das Fettgewebe fließt, das die LN umgibt, wenn es keine funktionellen Lymphgefäße gibt. Mit der zunehmenden Anerkennung der Bedeutung der lymphatischen Funktion wird diese Methode breitere Anwendungen haben, um die Funktion von Lymphgefäßen bei der Regulierung der LN-Mikroumgebung und der Immunantworten weiter zu entwirren.
Introduction
Die räumliche Organisation des Lymphsystems bietet strukturelle und funktionelle Unterstützung, um extrazelluläre Flüssigkeit effizient zu entfernen und Antigene und Antigen-präsentierende Zellen (APCs) zu den entwässernden LNs zu transportieren. Die ersten lymphatischen Gefäße (auch Lymphkapillaren genannt) sind aufgrund ihrer diskontinuierlichen interzellulären Verbindungen, die die effektive Sammlung von Flüssigkeiten, Zellen und anderen Materialien aus den umliegenden extrazellulärenRäumen1 erleichtern, sehr durchlässig. Die ersten lymphatischen Gefäße verschmelzen zu sammelnden Lymphgefäßen, die enge interzelluläre Verbindungen, eine kontinuierliche Kellermembran und lymphatische Muskelabdeckung haben. Das Sammeln von Lymphgefäßen ist verantwortlich für den Transport der gesammelten Lymphe zu den entwässernden LNs und schließlich die Rückkehr der Lymphe in den Kreislauf2,3. Die sammelnden Lymphgefäße, die Lymphe in die entwässernden LN treiben, sind die afferent lymphatischen Gefäße4,5,6,7. Die Behinderung der affektiven Lymphgefäße kann den Lymphfluss in die LNs blockieren, was eine nützliche Technik bei der Untersuchung der Funktion des Lymphflusses ist.
Frühere Studien haben gezeigt, dass Lymphfluss eine wichtige Rolle beim Transport von Antigenen und APCs spielt, sowie bei der Aufrechterhaltung der LN-Homöostase. Es ist allgemein bekannt, dass gewebeabgeleitete APCs, typischerweise aktivierte migrierende dendritische Zellen (DCs), durch die affemenden Lymphgefäße zu den LN reisen, um T-Zellen zu aktivieren8. Die Idee, dass Freiform-Antigene, wie Mikroben oder lösliche Antigene, passiv mit Lymphe zu den LN fließen, um LN-residente APCs zu aktivieren, hat sich in den letzten zehn Jahrendurchgesetzt 9,10,11,12. Freiform-Antigene, die mit Lymphe reisen, dauern Minuten nach der Infektion, um zu den LN zu gelangen, und die LN-Resident-Zellaktivierung kann innerhalb von 20 min nach der Stimulation auftreten. Dies ist viel schneller als die Aktivierung von migrierenden DCs, die mehr als 8 h benötigt, um in die entwässernde LN9einzusteigen. Neben dem Transport von Antigenen zur Einleitung des Immunschutzes trägt die Lymphe auch Zytokine und DCs zu den LN, um ihre Mikroumgebung zu erhalten und die Immunzellhomöostase13,14zu unterstützen. Zuvor zeigte die Blockierung des Lymphflusses durch Das Aifaktum der affepfenden Lymphgefäße, dass Lymphe erforderlich ist, um den HEV-Phänotyp aufrechtzuerhalten, der zur Unterstützung der homöostatischen T-Zelle und der B-Zelle erforderlich ist, die bis zum LN15,16,17. CCL21 ist ein kritisches Chemokin, das die Dc- und T-Zellenpositionierung im LN8,18leitet. Die Blockierung des Lymphflusses unterbricht die CCL21-Expression im LN und unterbricht möglicherweise die Positionierung und/oder Interaktion von DC- und T-Zellen im LN19. So kann die Blockierung des Lymphflusses den Antigen-/DC-Zugang zu den entwässernden LN direkt oder indirekt abschaffen, indem die LN-Mikroumgebung gestört wird, die die Immunantworten in der LN reguliert. Um die Funktion des Lymphflusses besser untersuchen zu können, wird ein experimentelles Protokoll vorgestellt (Abbildung 1), um den Lymphfluss bei Mäusen zu blockieren, indem die affemenden Lymphgefäße vom Fußpad zum pLN durchnäht werden. Diese Methode kann eine wichtige Technik für zukünftige Studien über die lymphatische Funktion bei gesunden und kranken Bedingungen sein.
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Protocol
Alle Tierarbeit muss vom Institutionellen und staatlichen Ethik- und Tierschutzausschuss genehmigt werden. Dies ist eine Nicht-Überlebens-Operation.
1. Herstellung von Materialien
- Bereiten Sie 100 ml 70% Ethanol vor, indem Sie 70 ml 100% Ethanol mit 30 ml sterilem Wasser mischen. Autoclave alle chirurgischen Werkzeuge vor der Operation und halten Sie die Werkzeuge in 70% Ethanol vor und während der Operation, um die Sterilisation aufrechtzuerhalten.
- Bereiten Sie ein Injektionsgerät vor.
- Schneiden Sie 30 cm Polyethylenschläuche (0,28 mm Durchmesser) ab. Schließen Sie die Spitze einer 30 G x 1/2 Nadel (Nadel A) an ein Ende der Polyethylenschläuche an. Lösen Sie vorsichtig eine weitere 30 G x 1/2 Nadel (Nadel B) und verbinden Sie die gebrochene Seite mit dem anderen Ende der Polyethylenschläuche.
- Nadel A an einer 1 ml Tuberkulinspritze befestigen.
HINWEIS: Für diese Polyethylenschläuche entspricht 1,6 cm Flüssigkeit in den Schläuchen 1 l20.
- Bereiten Sie ein 10:1 Ketamin/Xylazin-Gemisch (10 mg/ml Ketamin und 1 mg/ml Xylazin) in Saline (bakteriostatisch 0,9% [w/v] Natriumchlorid) vor. Bereiten Sie die Lösung vor Gebrauch frisch vor.
2. Vorbereitung des Tieres auf die Operation
HINWEIS: Verwenden Sie Mäuse im Alter von 6 bis 10 Wochen. Sowohl weibliche als auch männliche Mäuse können verwendet werden. In dieser Studie wurden 6-10 Wochen alte, C57BL/6 weibliche Mäuse verwendet. Diese Methode kann für andere Mäusestämme angepasst werden.
- Anästhesisieren Sie die Maus, indem Sie 250 l des Ketamin/Xylazin-Gemischs intraperitoneal injizieren. Warten Sie, bis die Maus vollständig eingeschlafen ist. Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht auf eine Zehenklemme reagiert, um die vollständige Anästhesisierung zu erkennen.
- Rasieren Sie Fell um die Beine mit Haarschneidern.
- Tragen Sie die Enthaarungscreme um das Bein auf und warten Sie 5 min. Das Restfell und die Enthaarungscreme mit einem feuchten Gewebe abwischen und das Bein mit sterilem Wasser reinigen. Sprühen Sie 70% Ethanol um das Bein, um den Operationsbereich zu sterilisieren. Das Ethanol ist auf die Einschnittstelle beschränkt.
3. Chirurgische Naht von afferenten Lymphgefäßen
HINWEIS: Das rechte Bein ist vernärmt, und das linke Bein wird als Scheinkontrolle verwendet. Das lymphatische Nahtprotokoll (Schritte 3.1-3.8) dauert 20 bis 30 min.
- Halten Sie die Maus an einer anfälligen Position und fixieren Sie sie mit chirurgischem Klebeband, um den Operationsbereich am rechten Bein freizulegen.
- Intradermally injizieren 5 l von 1% Evans blauer Farbstoff oder 9 cm der Flüssigkeit des Injektionsgeräts Schläuche in das Fußpolster. Massieren Sie das Fußpolster sanft, um Evans blau in die Lymphgefäße einzudringen.
HINWEIS: Die Insulinspritze ist für die Injektion kleiner Volumen nicht einfach zu kontrollieren. Das Volumen kann mit dem Injektionsgerät genauer gesteuert werden. Lymphgefäße werden durch blauen Farbstoff unter der Haut visualisiert. Mit umfangreichem Training können beide afferenten Lymphgefäße mit bloßem Auge als transparente Gefäße im Fettgewebe gesehen werden, parallel zur Arterie Saphenous. Mit umfangreicher Schulung ist es möglich, die Gefäße zu befestigen, ohne Evans Blue Farbstoff zu injizieren, wenn es Bedenken hinsichtlich möglicher Störungen durch den Farbstoff gibt. - Wählen Sie unter einem Sezieren des Mikroskops eine Schnittstelle 5 mm vom unteren Rand der poplitealen Fossa aus. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 5 mm) in der Haut mit einer Schere. Dehnen Sie den Einschnitt mit feinen Operationszangen und setzen Sie die sammelnden Lymphgefäße aus (Abbildung 1A).
HINWEIS: Bei Bedarf kann ein kleines Hautfragment entfernt werden, um die Lymphgefäße freizulegen. - Identifizieren Sie beide affekenden Lymphgefäße, die zu den pLNs unter dem Sezieren des Mikroskops führen (Abbildung 1B).
HINWEIS: Es gibt zwei afferent lymphatische Gefäße vom Fußpolster bis zum pLN. Beide müssen vernässt werden, um den Lymphfluss vollständig zu blockieren. - Mit einem Nadelhalter die Nahtnadel (0,7 metrisch oder kleiner) vorsichtig zwischen das affetische Lymphgefäß und die Arterie Saphenous einlegen und die Nadel vorsichtig um das afferent Lymphgefäß herausziehen. Ziehen Sie die Nahtschnur vorsichtig und lassen Sie ca. 2 cm der Nahtschnur zurück. Verwenden Sie den Nadelhalter, um die Schnur fest zu binden, um ein Lymphgefäß mit einem Chirurgenknoten zu verbinden (Abbildung 1C).
HINWEIS: Das Gewebe unter dem Schnitt kann bei längerer Lufteinwirkung austrocknen. Wenn der Schnitt so klein wie möglich gemacht wird und die Naht schnell (d.h. innerhalb von 5 min) durchgeführt wird, wird verhindert, dass das Gewebe austrocknet. Bewahren Sie die Gewebefeuchtigkeit, indem Sie ein kleines Volumen von Saline mit einem Wattestäbchen auftragen. - Massieren Sie das Fußpolster vorsichtig, um sicherzustellen, dass kein Evans Blue Farbstoff die Nahtstelle passiert und dann die überschüssige Schnur mit der Schere schneidet.
- Führen Sie die gleichen Nahtschritte (d. h. die Schritte 3.5 und 3.6) auf dem anderen affetienten Lymphgefäß aus (Abbildung 1D). Schließen Sie den Hautschnitt mit der gleichen Naht, die verwendet wurde, um die Gefäße in Schritt 3.5 zu nähen (Abbildung 1E).
- Für die Scheinkontrolle, intradermally injizieren 5 l von 1% Evans blauen Farbstoff am linken Fußpad und massieren das Fußpolster, um die Lymphgefäße zu visualisieren. Öffnen Sie die Haut mit einer Exzision und schließen Sie dann die Wunde, ohne das Gefäß zu nähen (Abbildung 1F).
- Optional die betätigten Mäuse für 2 x 4 h überwachen. Die Nahtseite des Beins sollte Ödeme mit Evans Blue zeigen, die auf den Oberschenkel ausgebreitet sind, während das Kontrollbein einen eingeschränkten Evans-Blaufarbstoff im Fußpolster zeigt. Wenn Mäuse erwachen, wird eine zusätzliche Ketamin/Xylazin-Mischung injiziert, um die Anästhesie bis zur Euthanasie zu erhalten.
4. Verfolgung des Lymphflusses
- Unmittelbar nach der Operation injizieren Sie intradermally 10 l von 2% Fluorescein isothiocyanat (FITC) im Fußpolster sowohl der Kontrolle als auch des lymphatischen genähten Beins.
- Euthanisieren Sie die Mäuse mit 400 L Ketamin/Xylazin-Mischung und führen Sie zervikale Dislokation durch, wenn die Mäuse vollständig anästhesisiert sind.
- Sammeln Sie pLNs aus der poplitealen Fossa und entfernen Sie vorsichtig das perinodale Fettgewebe um die pLNs unter dem Dissektionsmikroskop bei 2, 6 und 12 h nach der FITC-Injektion.
- Die pLNs mit der medullären Sinusfläche zur Seite des Kryomolds in optimaler Schnitttemperatur (OCT) Verbindung einbetten (Abbildung 1G,H).
- Bereiten Sie 20 m gefrorene Abschnitte mit einem Kryotom vor.
- Stellen Sie die Kryosektionen unter einem konfokalen Mikroskop ab, um die FITC-Verteilung zu bestimmen.
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Representative Results
Lymphgefäßnaht wurde in früheren Studien15,16,17,19verwendet, wo es als wichtiges Werkzeug diente, um die Funktion des Lymphflusses zu untersuchen, bevor die Molekularbiologie der Lymphgefäße besser verstanden wurde. Die Blockierung des Lymphflusses unterbricht die LN-Homöostase, was dazu führt, dass HEVs die kritische Genexpression verlieren, die für eine optimale Lymphozytenhoming an die LN15,16,17benötigt wird. Seitdem hat es weitere zwei Jahrzehnte gedauert, um zu zeigen, dass DCs, die mit Lymphe reisen, entscheidend für die Aufrechterhaltung des HEV-Genexpressionsprofils und der Lymphozyten sind, die auf die LN13angehören. Die Scherspannung durch den Lymphfluss ist entscheidend, um die Chemokinexpression in der LN zu stimulieren. Die Blockierung des Lymphflusses unterbricht die Chemokin-CCL21-Expression in der LN19, die bei der Steuerung der DC- und T-Zellpositionierung in der LN von entscheidender Bedeutung ist. Daher kann ein unterbrochener Fluss die Positionierung von DCs und T-Zellen in der LN8,18beeinträchtigen.
Unmittelbar nach der Operation wurde ein kleiner fluoreszierender Tracer mit kleinem Molekulargewicht, FITC, verwendet, um den Lymphfluss zu verfolgen. FITC (10 l von 2% FITC) wurde intradermally in das Fußpolster der Scheinkontrolle und das lymphatische Nähte beinjiziert. Die Entwässerungs-pLNs wurden 2, 6 und 12 h später gesammelt. Die entwässernden pLNs wurden in OCT eingebettet, und 20 m gefrorene Abschnitte wurden vorbereitet. Konfokale Bilder zeigten eine erheblich reduzierte FITC-Akkumulation in den pLNs nach der Naht. Der Rest-FITC in den pLNs wurde bevorzugt in den LN-Sinus angesammelt (Abbildung 2).
Wie die Lymphe durch das Fettgewebe um die LN fließt, wurde mit lymphatischer Naht untersucht. Die afferenten Lymphgefäße, die zu den pLNs führten, wurden vernäht, um den Lymphfluss zu blockieren, und es wurde festgestellt, dass das perinodale Fettgewebe eine kleine Menge Lymphfluss unterstützen konnte, wenn Lymphgefäße blockiert wurden21. Der Lymphfluss durch das Fettgewebe zur Kapsel der LN wurde kartiert; es schien in die LN-Nebenhöhlen einzufließen. Im Laufe der Zeit können kleine Mengen Lymphe in die LN-Sinus geflossen sein (Abbildung 3).
Abbildung 1: Schritte der poplitealen LN (pLN) afferent lymphatischen Gefäßnaht. Kurz nachdem Mäuse mit einer Ketamin- und Xylazin-Mischung befeuchtet wurden, wurden ihre Beine rasiert und das Restfell durch eine Enthaarungscreme entfernt. Das rechte Bein wurde für Diebe verwendet und das linke Bein war die Scheinkontrolle. Die rechte Seite des Fußpolsters wurde intradermally injiziert mit 5 l von 1% Evans Blue Farbstoff in PBS hergestellt. (A) Durch sanfte Smassierung des Fußpolsters füllte Evans Blue Farbstoff die affemenden Lymphgefäße. (B) Ein kleiner Hautschnitt wurde 5 mm von der pLN entfernt durchgeführt, um die Lymphgefäße freizulegen, die durch die beiden weißen Pfeile angezeigt werden. (C,D) Beide afferenten Lymphgefäße wurden vernässt. (E) Die Hautexzision wurde durch Nähte geschlossen. (F) Das Kontrollbein erhielt Evans blaue Injektion, Hautexzision und Nahtverschluss, ohne die Lymphgefäße zu nähren. (G) Der Erfolg der Lymphflussblockade wurde durch Evans blauer Farbstoff angezeigt, der in die pLN des Kontrollbeins, aber nicht in das genähte Bein eintrat. (H,I) Die gesammelten pLNs wurden in OCT-Verbindung mit subkapsulärem Sinus (SCS) und medullärem Sinus (MS) zur Seite des Kryomolds vor dem Einfrieren von flüssigem Stickstoff eingebettet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: FITC-Verteilung in den entleerenden pLNs des Schein- oder Beins. Konfokale Bilder von pLNs, die 2, 6 und 12 h nach der FITC-Injektion gesammelt wurden, zeigten eine erheblich reduzierte FITC-Akkumulation in den pLNs nach der Naht. Der Rest-FITC in den pLNs wurde bevorzugt in den LN-Sinus gefunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: FITC-Verteilung im perinodalen Fettgewebe (PAT), um die entwässernden pLNs des Schein- oder Santenbeins. Konfokale Bilder der PAT und der LN zeigten, dass FITC in die PAT- und LN-Nebenhöhlen eindringt, aber nicht effektiv über die LN verteilt wurde, als Lymphgefäße blockiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Blockierung des Lymphflusses wird breite Anwendungen bei der Manipulation der Antigenabgabe an die LN unter gesunden und kranken Bedingungen haben. Es ist möglich, diese Methode zu verwenden, um den Zeitpunkt der Antigenabgabe zu kontrollieren, um zu untersuchen, wie der kontinuierliche Lymphfluss die Immunantwort bei entleerenden LNs reguliert. Diese Methode der Lymphflussunterbrechung kann auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie Lymphauswirkungen Zellkompartalisation, Zellaktivierung, Zellmigration und Zell-Zell-Interaktionen in der LN.
Mäuse, die speziell den menschlichen Diphtherietoxinrezeptor (DTR) in ihren lymphatischen Endothelzellen (Flt4-cre-dtr) exemiten, wurden entwickelt; Diese können verwendet werden, um lymphatische Gefäße gezielt zu erschöpfen, um die lymphatische Funktion zu untersuchen22. Die Verabreichung von DT tötet lymphatische Endothelzellen entlang der Lymphgefäße und in den LN. Die Erschöpfung der lymphatischen Endothelzellen kann den Lymphfluss regional oder systemisch vollständig abschalten, um die lymphatische Funktion zu untersuchen. Diese Methode verursacht eine signifikante Flüssigkeitsansammlung im Gewebe und dient als großartiges Modell zur Untersuchung von Lymphödem und Lymphfunktion.
Im Vergleich zum lymphatischen Endothelzell-spezifischen DTR-Expressionsmodell besteht der Vorteil der lymphatischen Nahtmethode darin, dass sie den Lymphfluss mit minimalen Schäden an lymphatischen Endothelzellen oder anderen lymphatischen Gefäßen in der Umgebung unterbricht. Die Intervention wirkt sich nicht direkt auf Zellen in der entwässernden LN aus, so dass die daraus resultierenden Auswirkungen auf die LN-Mikroumgebung oder die Kommunikation von Immunzellen eher eine Folge der Lymphflussblockade als des potenziellen Zelltodes sind, der durch DT induziert wird. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist, dass der Lymphfluss nach der Operation sofort blockiert wird, so dass das Timing der Lymphflussblockade besser kontrolliert werden kann.
Die Einschränkung dieser Methode ist, dass sie nur verwendet werden kann, um regionale Interventionen des Lymphflusses in afferen Lymphgefäßen vom Fußpad zum pLN zu untersuchen. Diese Methode muss die genaue Position der sammelnden Lymphgefäße identifiziert werden. Das Sammeln von Lymphgefäßen ist an einigen anatomischen Stellen schwer zu identifizieren, und daher erfordert diese Technik umfangreiches anatomisches und chirurgisches Training, bevor eine erfolgreiche Identifizierung von affemittenten Lymphgefäßen zur Blockierung des Lymphflusses erforderlich ist. Eine weitere Einschränkung ist, dass diese Methode die Lymphe nicht direkt blockieren kann, die in die anfänglichen Lymphgefäße gelangen. Nach der Naht kann der blockierte Lymphfluss den interstitiellen Flüssigkeitsdruck erhöhen und die Lymphflussrichtung in den ersten Lymphgefäßen verändern. So können die intakten Lymphgefäße um den Bereich die Funktion der unterbrochenen Lymphgefäße kompensieren und die Richtung des Lymphflusses ändern.
Darüber hinaus erhöht die Injektion von Evans Blue Farbstoff den interstitiellen Flüssigkeitsdruck, der die nachfolgende Tracer- oder Antigeninjektion stören kann. Die Autofluoreszenz von Evans Blue Farbstoff kann andere fluoreszierende Tracer oder andere Fluorophore stören, die für immunfluoreszierende Färbungen verwendet werden. Um jegliche Wechselwirkung zwischen Evans Blue Farbstoff und potenziellen Antigenen, anderen Tracern oder potenziellen molekularen Mechanismen der lymphatischen Funktionsregulation zu vermeiden, ist es möglich, die sammelnden Lymphgefäße ohne Evans Blue Farbstoff mit bloßem Auge zu identifizieren. Dies kann mit einer umfangreichen Schulung zur Identifizierung der Schiffe erreicht werden. Andere Farbstoffe, wie Zwiesulfanblaufarbstoff können auch verwendet werden, um den Evans Blue Farbstoff zu ersetzen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Ava Zardynezhad für das Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Arbeit wird vom Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035) und der Canada Foundation for Innovation for SL (32930) und der National Natural Science Foundation of China für Yujia Lin (81901576) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
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