Summary
En protokol til at blokere lymfeflow ved kirurgisk sutur af afferent lymfekar præsenteres.
Abstract
Lymfekar er afgørende for at opretholde vævsvæskebalancen og optimere immunbeskyttelsen ved at transportere antigener, cytokiner og celler til dræning af lymfeknuder (LNs). Afbrydelse af lymfeflow er en vigtig metode, når man studerer funktionen af lymfekar. De afferente lymfekar fra murine footpad til popliteal lymfeknuder (pLNs) er veldefineret som de eneste ruter for lymfedrænage i pLNs. Suturing disse afferente lymfekar kan selektivt forhindre lymfeknuder flow til pLNs. Denne metode giver mulighed for interferens i lymfeknuder flow med minimal skade på lymfe endotelceller i dræning pLN, den afferente lymfekar, samt andre lymfekar omkring området. Denne metode er blevet brugt til at undersøge, hvordan lymfeknuder påvirker høje endotel venler (HEV) og chemokine udtryk i LN, og hvordan lymfe strømmer gennem fedtvæv omkring LN i mangel af funktionelle lymfekar. Med den voksende anerkendelse af betydningen af lymfefunktion, vil denne metode har bredere anvendelser for yderligere at optrævle funktionen af lymfekar i reguleringen af LN mikromiljø og immunrespons.
Introduction
Den rumlige organisering af lymfesystemet giver strukturel og funktionel støtte til effektivt at fjerne ekstracellulær væske og transportere antigener og antigen-præsenterende celler (APC'er) til de drænende LN'er. De første lymfekar (også kaldet lymfekapiller) er meget gennemtrængelige på grund af deres diskontinuerlige intercellulære vejkryds, som letter den effektive indsamling af væsker, celler og andre materialer fra omkringliggende ekstracellulære rum1. De første lymfekar fusionere i indsamling lymfekar, som har stramme intercellulære kryds, en kontinuerlig kælder membran, og lymfemuskel dækning. Indsamling lymfekar er ansvarlige for transport af indsamlede lymfeknuder til drænende LNs og i sidste ende vender tilbagelymfeknuder til omsætning 2,3. Indsamling lymfekar, der driver lymfeknuder ind i dræning LN er afferent lymfekar4,5,6,7. Obstruktion af afferente lymfekar kan blokere lymfestrømmen ind i LNs, hvilket er en nyttig teknik, når man studerer funktionen af lymfeknuder flow.
Tidligere undersøgelser har vist, at lymfeknuder flow spiller en væsentlig rolle i transport af antigener og APC'er, samt opretholde LN homøostase. Det er velkendt, at vævsbaserede APC'er, typisk aktiverede migrerende dendritiske celler (DCs), rejser gennem de affebende lymfekar til LN for at aktivere T-celler8. Tanken om, at frit-form antigener, såsom mikrober eller opløselige antigener, passivt flow med lymfeknuder til LN at aktivere LN-hjemmehørende APC'er har vundet accept i det seneste årti9,10,11,12. Free-form antigener rejser med lymfeknuder tage minutter efter infektionen til at rejse til LN, og LN-hjemmehørende celle aktivering kan forekomme inden for 20 min efter stimulation. Dette er meget hurtigere end aktivering af migrerende DC'er, som tager mere end 8 timer at komme ind i dræning LN9. Ud over at transportere antigener til at indlede immunbeskyttelse, lymfeknuder også bærer cytokiner og DC'er til LN at opretholde sin mikromiljø, og til at støtte immuncelle homøostase13,14. Tidligere viste blokering af lymfeknuder ved at suturere de afferente lymfekar, at lymfeknuder er nødvendige for at opretholde den HEV-fænotype, der kræves til støtte for homøostatisk T-celle og B-celle, derhovertil LN 15,16,17. CCL21 er en kritisk chemokine, der dirigerer DC og T celle positionering i LN8,18. Blokering af lymfeflow afbryder CCL21-udtrykket i LN og afbryder potentielt placeringen af DC- og T-celler og/eller interaktionen i LN19. Således, blokering lymfeknuder flow kan direkte eller indirekte ophæve antigen / DC adgang til dræning LN ved at forstyrre LN mikromiljø, der regulerer immunrespons i LN. For bedre at undersøge funktionen af lymfeflow præsenteres en eksperimentel protokol (Figur 1) for at blokere lymfestrømmen hos mus ved at suturere de afferente lymfekar fra fodpladen til pLN. Denne metode kan være en vigtig teknik til fremtidige undersøgelser af lymfefunktion i sunde og syge tilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt dyrearbejde skal godkendes af den institutionelle og statslige etiske komité og dyrenes håndtering. Dette er en ikke-overlevelse kirurgi.
1. Fremstilling af materialer
- Der tilberedes 100 ml 70 % ethanol ved at blande 70 ml 100 % ethanol med 30 ml sterilt vand. Autoklave alle kirurgiske værktøjer før operationen og holde værktøjerne i 70% ethanol før og under operationen for at opretholde sterilisation.
- Gør et injektionsapparat klar.
- Skær ~ 30 cm polyethylenrør (0,28 mm i diameter). Tilslut spidsen af en 30 G x 1/2 nål (nål A) til den ene ende af polyethylenslanger. Forsigtigt løsne en anden 30 G x 1/2 nål (nål B) og forbinde den knækkede side til den anden ende af polyethylen slanger.
- Fastgør kanylen A til en 1 ml tuberkulinsprøjte.
BEMÆRK: For denne polyethylenslange svarer 1,6 cm væske i slangen til 1 μL20.
- Der tilberedes en 10:1 ketamin/xylazinblanding (10 mg/ml ketamin og 1 mg/ml xylazin) i saltvand (bakterinstatisk 0,9% [w/v] natriumchlorid). Forbered opløsningen frisk før brug.
2. Forberedelse af dyret til operation
BEMÆRK: Brug mus i alderen 6−10 uger. Både hun- og hanmus kan anvendes. I denne undersøgelse blev der anvendt 6−10 uger gamle C57BL/6 hunmus. Denne metode kan tilpasses til andre stammer af mus.
- Bedøve musen ved at injicere 250 μL af ketamin/xylazin blandingen intraperitoneally. Vent, indtil musen er helt i søvn. Sørg for, at musen ikke reagerer på en tåknæker for at registrere fuld bedøvelse.
- Barber pels omkring benene med hårklippere.
- Påfør depilatoriske creme omkring benet og vent i 5 min. Tør den resterende pels og hårfjerfarvet creme af med et fugtigt væv og rengør benet med sterilt vand. Spray 70% ethanol omkring benet for at sterilisere arbejdsområdet. Ethanolen er begrænset til indsnitsstedet.
3. Kirurgisk sutur af affæstet lymfekar
BEMÆRK: Højre ben er sutureret, og venstre ben bruges som fingeret kontrol. Lymfesuturprotokollen (trin 3.1−3.8) tager 20−30 min.
- Hold musen i en udsat position og fastgør den med kirurgisk tape for at eksponere operationsområdet på højre ben.
- Intradermalt injicere 5 μL af 1% Evans blå farvestof eller 9 cm af væsken i injektion apparatet slanger ind i footpad. Masser forsigtigt fodpladen for at hjælpe Evans blå ind i lymfekar.
BEMÆRK: Insulinsprøjten er ikke nem at styre ved injektion af små mængder. Volumenet kan styres mere præcist ved hjælp af injektionsapparatet. Lymfekar visualiseres af blåt farvestof under huden. Med omfattende uddannelse, både afferente lymfekar kan ses med det blotte øje som gennemsigtige fartøjer i fedtvæv, parallelt med Saphenous arterie. Med omfattende uddannelse er det muligt at suturere karrene uden at injicere Evans Blue farvestof i tilfælde, hvor der er bekymring for potentielle forstyrrelser fra farvestoffet. - Under et dissekerende mikroskop skal du vælge et indsnitssted 5 mm fra den nederste kant af poplitealfossa. Lav et lille snit (~ 5 mm) i huden med en saks. Brug fine operation snæv, strække snittet, og udsætte indsamling lymfekar (Figur 1A).
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, kan et lille hudfragment fjernes for at eksponere lymfekar. - Identificer begge afferente lymfekar, der fører til pLN'er under det dissekerende mikroskop (Figur 1B).
BEMÆRK: Der er to afferente lymfekar fra fodpladen til pLN. Begge skal sutureret at blokere lymfeflow helt. - Ved hjælp af en nåleholder skal suturnålen (0,7 metrisk eller mindre) indsættes forsigtigt mellem den afferente lymfebeholder og Saphenous arterien, og nålen trækkes forsigtigt ud omkring den afferente lymfebeholder. Træk forsigtigt i suturstrengen og lad ca. 2 cm af suturstrengen være bagved. Brug kanyleholderen til at binde strengen tæt for at suturere en lymfebeholder med en kirurgs knude (Figur 1C).
BEMÆRK: Vævet under snittet kan tørre ud med langvarig udsættelse for luft. Ved at gøre snittet så lille som muligt og udføre suturen hurtigt (dvs. inden for 5 min.) vil det forhindre vævet i at tørre ud. Opretholde væv fugt ved at anvende en lille mængde saltvand med en vatpind. - Masser forsigtigt fodpladen for at sikre, at ingen Evans Blue farvestof passerer suturstedet og derefter skære den overskydende streng med en saks.
- De samme suturtrin (dvs. trin 3.5 og 3.6) udføres på den anden afferente lymfebeholder (Figur 1D). Hudsnit lukkes med samme sutur, som blev brugt til at suturere karrene i trin 3.5 (Figur 1E).
- For fingeret kontrol, intradermally injicere 5 μL af 1% Evans blå farvestof på venstre footpad og massere fodpladen til at visualisere lymfekar. Åbn huden med en excision og luk derefter såret uden at suturering fartøjet (Figur 1F).
- Du kan eventuelt overvåge de opererede mus i 2-4 timer. Sutursiden af benet skal vise ødem med Evans Blue spredt til låret, mens kontrolbenet vil vise begrænset Evans blå farvestof i footpad. Hvis mus vågner, vil en ekstra ketamin/xylazine blanding blive injiceret for at holde bedøvet indtil dødshjælp.
4. Sporing af lymfeflowet
- Umiddelbart efter operationen injiceres intradermalt 10 μL af 2% fluorescein isothiocyanat (FITC) i fodpladen af både kontrol og lymfesyben.
- Aflive musene med 400 μL ketamin/xylazin blanding og udføre cervikal dislokation, når musene er fuldt bedøvet.
- Opsaml pLN'er fra poplitealfossaen, og fjern forsigtigt perinodal fedtvævet omkring pLN'erne under dissektionsmikroskopet ved 2, 6 og 12 timer efter INJEKTION AF FITC.
- Integrer pLN'erne med medullær sinusområdet, der vender mod siden af kryosolen i optimal skæretemperatur (OCT) forbindelse (Figur 1G, H).
- Der tilberedes 20 μm frosne sektioner ved hjælp af en kryotomi.
- Billede cryosections under en konfokal mikroskop til at bestemme FITC distribution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lymfekar sutur har været anvendt i tidligereundersøgelser 15,16,17,19, hvor det tjente som et vigtigt redskab til at studere funktionen af lymfeflow før molekylærbiologi af lymfekar var bedre forstået. Blokering lymfeknuder flow afbryder LN homøostase, hvilket fører til HEVs miste den kritiske genekspression er nødvendig for optimal lymfocyt homing til LN15,16,17. Siden da, det tog yderligere to årtier at påvise, at DC'er rejser med lymfeknuder er afgørende for at opretholde HEV genekspression profil og lymfocytter homing til LN13. Den forskydning stress, som lymfeknuder flow er afgørende for at stimulere chemokine udtryk i LN. Blokering lymfeflow afbryder chemokine CCL21 udtryk i LN19, som er kritisk i at lede DC og T celle positionering i LN. Derfor kan afbrudt flow kompromittere DCs og T-celler positionering i LN8,18.
Umiddelbart efter operationen, en lille molekylvægt fluorescerende sporstof, FITC, blev brugt til at spore lymfeknuder flow. FITC (10 μL af 2% FITC) blev intradermalt injiceret i fodpladen på fingeret kontrol og lymfe suturerede ben. De drænende pLN'er blev indsamlet 2, 6 og 12 timer senere. De drænende pLN'er blev indlejret i OLT, og der blev forberedt 20 μm frosne sektioner. Konfokale billeder viste væsentligt reduceret FITC-akkumulering i pLN'erne efter sutur. Rest-FITC i pLN'erne blev fortrinsvis akkumuleret i LN bihulerne (figur 2).
Hvordan lymfeknuder strømmer gennem fedtvævet omkring LN blev undersøgt ved hjælp af lymfesutur. De afferente lymfekar, der fører til pLN'erne, blev sutureret for at blokere lymfeknuder, og det blev fastslået, at perinodal fedtvævet kunne understøtte en lille mængde lymfeknuder, når lymfekar blevblokeret 21. Lymfeknuder flow gennem fedtvæv til kapslen af LN blev kortlagt; det syntes at indgå i LN bihuler. Små mængder lymfeknuder kan være strømmet ind i LN bihuler over tid (Figur 3).
Figur 1: Trin af popliteal LN (pLN) afferent lymfekarsutur. Kort efter mus blev bedøvet med en ketamin og xylazine blanding, deres ben blev barberet, og den resterende pels blev fjernet af en depilatory creme. Det højre ben blev brugt til sutur og venstre ben var fingeret kontrol. Højre side af footpad'en blev intradermalt injiceret med 5 μL af 1% Evans Blue farvestof fremstillet i PBS. (A) Ved forsigtigt at massere fodpladen, Fyldte Evans Blue farvestoffet afferent lymfekar. (B) Der blev udført et lille huds snit 5 mm fra pLN for at eksponere lymfekar, som er angivet med de to hvide pile. (C,D) Begge afferente lymfekar blev sutureret. (E) Huden excision blev lukket af suturer. (F)Kontrolbenet fik Evans blå injektion, hududsugning og suturlukning uden at suturere lymfekar. (G)Succesen af lymfeflowblokering blev indikeret af Evans blå farvestof, som kom ind i pLN af kontrolbenet, men ikke det suturerede ben. (H,I) De opsamlede pLN'er blev indlejret i OLT sammensatte med subcapsular sinus (SCS) og medullry sinus (MS) vender på siden af cryomold før snap frysning i flydende nitrogen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: FITC-fordeling i de drænende pLN'er på det fingerede eller suturerede ben. Konfokale billeder af pLN indsamlet 2, 6 og 12 timer efter FITC injektion viste væsentligt reduceret FITC akkumulering i pLNs efter sutur. Den resterende FITC i pLNs blev fortrinsvis fundet i LN bihuler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: FITC-fordeling i perinodal fedtvæv (PAT) omkring de drænende pLN'er i det fingerede eller suturerede ben. Konfokale billeder af PAT og LN viste, at FITC kommer ind i PAT og LN bihuler, men blev ikke effektivt fordelt i hele LN, når lymfekar blev blokeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Blokering lymfeknuder flow vil have brede anvendelser i at manipulere antigen levering til LN i sunde og syge betingelser. Det er muligt at bruge denne metode til at kontrollere timingen af antigen levering for at undersøge, hvordan kontinuerlig lymfeknuder flow regulerer immunrespons i dræning LNs. Denne metode til afbrydelse af lymfeflowet kan også bruges til at undersøge, hvordan lymfeknuder påvirker celleopdeling, celleaktivering, cellemigration og cellecelleinteraktioner i LN.
Mus, der specifikt udtrykker human difteri toksin receptor (DTR) i deres lymfe endotelceller (Flt4-cre-dtr) er blevet udviklet; disse kan anvendes til specifikt at nedbryde lymfekar til at studere lymfefunktion22. Administration af DT dræber lymfe endotelceller langs lymfekar og i LN. Udtømningen af lymfe endotelceller kan helt ophæve lymfeknuder flow regionalt eller systemisk at studere lymfefunktion. Denne metode forårsager betydelig væskeophobning i væv og tjener som en stor model til at studere Lymphedema og lymfefunktion.
Sammenlignet med lymfecelle-specifikke DTR udtryk model, fordelen ved lymfesutur metode er, at det afbryder lymfeknuder flow med minimal skade på lymfe endotelceller eller andre lymfekar omkring området. Interventionen påvirker ikke direkte celler i det drænende LN, så den deraf følgende indvirkning på LN mikromiljø eller immuncellekommunikation er en konsekvens af lymfeflowblokaden snarere end potentiel celledød forårsaget af DT. En anden fordel ved denne metode er, at lymfeflowet øjeblikkeligt blokeres efter operationen, så timingen af lymfeflowblokaden kan styres bedre.
Begrænsningen af denne metode er, at det kun kan bruges til at studere regional intervention af lymfeflow i afferent lymfekar fra footpad til pLN. Denne metode skal identificere den nøjagtige placering af indsamling lymfekar. Indsamling lymfekar er vanskelige at identificere i nogle anatomiske steder, og dermed denne teknik kræver omfattende anatomisk og kirurgisk uddannelse før en vellykket identifikation af afferente lymfekar til at blokere lymfeflow. En anden begrænsning er, at denne metode ikke direkte kan blokere lymfeknuder ind i den oprindelige lymfekar. Efter suturen kan den blokerede lymfeknuderstrøm øge det interstitielle væsketryk og ændre lymfeflowretningen i de oprindelige lymfekar. Således kan de intakte lymfekar omkring området kompensere for funktionen af de afbrudte lymfekar og ændre retningen af lymfeknuder flow.
Desuden øger injektionen af Evans Blue farvestof det interstitielle væsketryk, som kan forstyrre den efterfølgende trace eller antigeninjektion. Autofluorescensen af Evans Blue farvestof kan forstyrre andre fluorescerende sporstoffer eller andre fluorofores, der anvendes til immunfluorescerende farvning. For at undgå interaktion mellem Evans Blue farvestof og potentielle antigener, andre sporstoffer, eller potentielle molekylære mekanismer lymfefunktion regulering, er det muligt at identificere indsamling lymfekar uden Evans Blue farvestof med det blotte øje. Dette kan opnås med omfattende uddannelse til at identificere fartøjerne. Andre farvestoffer, såsom isosulfan blå farvestof kan også bruges til at erstatte Evans Blue farvestof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ava Zardynez for korrekturlæsning af manuskriptet. Dette arbejde støttes af Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035) og Canada Foundation for Innovation for SL (32930) og af National Natural Science Foundation of China for Yujia Lin (81901576).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W.
- Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
- Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
- Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
- Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
- Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
- Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
- Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
- Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
- Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
- Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
- Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
- Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
- Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).
- Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).
