Summary
Um protocolo para bloquear o fluxo linfático por sutura cirúrgica de vasos linfáticos diferentes é apresentado.
Abstract
Os vasos linfáticos são fundamentais na manutenção do equilíbrio dos fluidos teciduais e na otimização da proteção imunológica, transportando antígenos, citocinas e células para drenar linfonodos (LNs). A interrupção do fluxo linfático é um método importante ao estudar a função dos vasos linfáticos. Os diferentes vasos linfáticos do footpad murine aos linfonodos popliteis (pLNs) são bem definidos como as únicas rotas para drenagem linfática para as pLNs. Suturar esses vasos linfáticos diferentes pode impedir seletivamente o fluxo linfático para as PLNs. Este método permite a interferência no fluxo linfático com danos mínimos às células linfáticas do endotelial linfático no pLN drenante, os vasos linfáticos aferentes, bem como outros vasos linfáticos ao redor da área. Este método tem sido usado para estudar como a linfática impacta as venules endoteliais altas (HEV) e a expressão da quimioterapia na LN, e como o linfático flui através do tecido adiposo ao redor da LN na ausência de vasos linfáticos funcionais. Com o reconhecimento crescente da importância da função linfática, este método terá aplicações mais amplas para desvendar ainda mais a função dos vasos linfáticos na regulação do microambiente LN e respostas imunológicas.
Introduction
A organização espacial do sistema linfático fornece suporte estrutural e funcional para remover eficientemente o fluido extracelular e transportar antígenos e células que apresentam antígenos (APCs) para as LNs drenantes. Os vasos linfáticos iniciais (também chamados de capilares linfáticos) são altamente permeáveis devido às suas junções intercelulares descontínuas, que facilitam a coleta efetiva de fluidos, células e outros materiais dos espaços extracelulares circundantes1. Os vasos linfáticos iniciais se fundem na coleta de vasos linfáticos, que possuem junções intercelulares apertadas, uma membrana contínua do porão e cobertura muscular linfática. Os vasos linfáticos de coleta são responsáveis pelo transporte de linfáticos coletados para as LNs drenantes e, eventualmente, o retorno da linfática à circulação2,3. Os vasos linfáticos coletores que impulsionam linfáticos para a LN drenante são os vasos linfáticos diferentes4,5,6,7. A obstrução de vasos linfáticos diferentes pode bloquear o fluxo linfático para as LNs, que é uma técnica útil ao estudar a função do fluxo linfático.
Estudos anteriores mostraram que o fluxo linfático desempenha um papel significativo no transporte de antígenos e APCs, bem como na manutenção da homeostase da LN. É bem compreendido que os APCs derivados do tecido, tipicamente ativados células dendríticas migratórias (DCs), viajam através dos vasos linfáticos a diferentes para a LN para ativar as células T8. A ideia de que antígenos de forma livre, como micróbios ou antígenos solúveis, fluem passivamente com linfáticos para a LN para ativar APCs residentes em LN vem ganhando aceitação na última década9,10,11,12. Antígenos de forma livre que viajam com linfático levam minutos após a infecção para viajar para a LN, e a ativação celular residente em LN pode ocorrer dentro de 20 minutos após a estimulação. Isso é muito mais rápido do que a ativação de DCs migratórios, que leva mais de 8h para entrar na drenagem LN9. Além de transportar antígenos para iniciar a proteção imunológica, o linfo também transporta citocinas e DCs para a LN para manter seu microambiente, e para suportar a homeostase das células imunes13,14. Anteriormente, o bloqueio do fluxo linfático suturando os diferentes vasos linfáticos demonstrou que a linfática é necessária para manter o fenótipo HEV necessário para suportar a célula T homeostática e a célula B para a LN15,16,17. CCL21 é uma quimiocina crítica que direciona o posicionamento de células DC e T na LN8,18. O bloqueio do fluxo linfático interrompe a expressão CCL21 na LN e potencialmente interrompe o posicionamento da célula DC e T e/ou a interação na LN19. Assim, o bloqueio do fluxo linfático pode revogar direta ou indiretamente o acesso de antígeno/DC à LN drenante, interrompendo o microambiente LN que regula as respostas imunes na LN. Para melhor investigar a função do fluxo linfático, é apresentado um protocolo experimental(Figura 1) para bloquear o fluxo linfático em camundongos, suturando os vasos linfáticos a diferentes do bloco de pé para o pLN. Este método pode ser uma técnica importante para estudos futuros sobre a função linfática em condições saudáveis e doentes.
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Protocol
Todo o trabalho animal precisa ser aprovado pela comissão de ética institucional e governamental e manejo de animais. Esta é uma cirurgia de não sobrevivência.
1. Preparação de materiais
- Prepare 100 mL de 70% de etanol misturando 70 mL de 100% de etanol com 30 mL de água estéril. Autoclave todas as ferramentas cirúrgicas antes da cirurgia e mantenha as ferramentas em 70% de etanol antes e durante a cirurgia para manter a esterilização.
- Prepare um aparelho de injeção.
- Corte ~30 cm de tubos de polietileno (0,28 mm de diâmetro). Conecte a ponta de uma agulha de 30 G x 1/2 (agulha A) a uma extremidade do tubo de polietileno. Desaloja cuidadosamente outra agulha de 30 G x 1/2 (agulha B) e conecte o lado quebrado à outra extremidade do tubo de polietileno.
- Conecte a agulha A a uma seringa tuberculina de 1 mL.
NOTA: Para este tubo de polietileno, 1,6 cm de fluido na tubulação corresponde a 1 μL20.
- Prepare uma mistura de cetamina/xilazina 10:1 (10 mg/mL cetamina e 1 mg/mL de xilazina) em soro fisiológico (bacteriostático 0,9% [w/v] cloreto de sódio). Prepare a solução recentemente antes do uso.
2. Preparação do animal para cirurgia
NOTA: Use camundongos de 6 a 10 semanas. Tanto camundongos fêmeas quanto machos podem ser usados. Neste estudo, foram utilizados camundongos C57BL/6 de 6 a 10 semanas de idade. Este método pode ser adaptado para outras cepas de camundongos.
- Anestesiar o mouse injetando 250 μL da mistura cetamina/xilazina intraperitoneally. Espere até o rato dormir completamente. Certifique-se de que o mouse não reaja a uma pitada de dedo do dedo do dedo para detectar anestesia completa.
- Raspe a pele ao redor das pernas com cortadores de cabelo.
- Aplique o creme depilatório ao redor da perna e espere por 5 minutos. Limpe a pele residual e o creme depilatório usando um tecido úmido e limpe a perna com água estéril. Pulverizar 70% de etanol ao redor da perna para esterilizar a área de operação. O etanol está restrito ao local da incisão.
3. Sutura cirúrgica de vasos linfáticos a diferentes
NOTA: A perna direita é suturada, e a perna esquerda é usada como controle falso. O protocolo de sutura linfática (etapas 3.1-3.8) leva de 20 a 30 min.
- Mantenha o mouse em uma posição propensa e fixe-o com fita cirúrgica para expor a área de operação na perna direita.
- Indeje intradermicamente 5 μL de 1% de corante azul Evans ou 9 cm do fluido do aparelho de injeção tubo no footpad. Massageie suavemente o footpad para ajudar Evans azul a entrar nos vasos linfáticos.
NOTA: A seringa de insulina não é fácil de controlar para injeção de pequeno volume. O volume pode ser controlado com mais precisão usando o aparelho de injeção. Os vasos linfáticos são visualizados por corante azul sob a pele. Com treinamento extensivo, ambos os vasos linfáticos diferentes podem ser vistos a olho nu como vasos transparentes no tecido adiposo, paralelo à artéria Saphenous. Com treinamento extensivo, é possível suturar os vasos sem injetar corante Evans Blue nos casos em que há preocupações de possíveis distúrbios do corante. - Sob um microscópio dissecando, escolha um local de incisão 5 mm da borda inferior da fossa popliteal. Faça uma pequena incisão (~5 mm) na pele com uma tesoura. Utilizando fórceps de operação fina, estique a incisão e exponha os vasos linfáticos coletados(Figura 1A).
NOTA: Se necessário, um pequeno fragmento de pele pode ser removido para expor os vasos linfáticos. - Identifique tanto os vasos linfáticos diferentes que levam às pLNs sob o microscópio de dissecção(Figura 1B).
NOTA: Existem dois vasos linfáticos diferentes do bloco de rodas até o pLN. Ambos precisam ser suturados para bloquear completamente o fluxo linfático. - Utilizando um suporte de agulha, insira cautelosamente a agulha de sutura (0,7 métrica ou menor) entre o vaso linfático diferente e a artéria saphenous e puxe a agulha suavemente ao redor do vaso linfático diferente. Puxe suavemente a corda de sutura e deixe cerca de 2 cm da corda de sutura para trás. Use o suporte de agulha para ajudar a amarrar a corda firmemente para suturar um vaso linfático com o nó de um cirurgião(Figura 1C).
NOTA: O tecido sob a incisão pode secar com exposição prolongada ao ar. Tornar a incisão o menor possível e realizar a sutura rapidamente (ou seja, dentro de 5 minutos) impedirá que o tecido seque. Mantenha a umidade do tecido aplicando um pequeno volume de soro fisiológico com um cotonete. - Massageie suavemente o footpad para garantir que nenhum corante Evans Blue passe pelo local da sutura e, em seguida, corte o excesso de corda com uma tesoura.
- Realize as mesmas etapas de sutura (ou seja, etapas 3.5 e 3.6) no outro vaso linfático diferente(Figura 1D). Feche a incisão da pele com a mesma sutura utilizada para suturar os vasos na etapa 3.5(Figura 1E).
- Para o controle falso, injete intradermicamente 5 μL de 1% de corante azul Evans no footpad esquerdo e massageie o footpad para visualizar os vasos linfáticos. Abra a pele com uma excisão e feche a ferida sem suturar o vaso(Figura 1F).
- Opcionalmente, monitore os ratos operados por 2-4 h. O lado da sutura da perna deve mostrar edema com Evans Blue espalhado para a coxa, enquanto a perna de controle mostrará corante azul Evans restrito no footpad. Se os ratos acordarem, uma mistura adicional de cetamina/xilazina será injetada para manter anestesiada até a eutanásia.
4. Rastreamento do fluxo linfático
- Imediatamente após a cirurgia, injete intradermicamente 10 μL de isothiocianato de fluoresceína (FITC) no footpad tanto do controle quanto da perna linfática suturada.
- Eutanize os camundongos com 400 μL de mistura de cetamina/xilazina e realize a luxação cervical quando os camundongos estiverem totalmente anestesiados.
- Coletar pLNs da fossa popliteal e remover cuidadosamente o tecido adiposo perinodal ao redor das pLNs sob o microscópio de dissecção em 2, 6 e 12 h após a injeção FITC.
- Incorpore as pLNs com a área do seio medular voltada para o lado do criomold no composto de temperatura de corte ideal (OCT)(Figura 1G,H).
- Prepare seções congeladas de 20 μm usando um criotome.
- Imagem das crioseções sob um microscópio confocal para determinar a distribuição FITC.
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Representative Results
A sutura do vaso linfático tem sido usada em estudos anteriores15,16,17,19, onde serviu como uma importante ferramenta para estudar a função do fluxo linfático antes que a biologia molecular dos vasos linfáticos fosse melhor compreendida. O bloqueio do fluxo linfático interrompe a homeostase LN, o que leva os HEVs a perder a expressão genética crítica necessária para o melhor linfócito para a LN15,16,17. Desde então, levou mais duas décadas para demonstrar que os DCs que viajam com linfáticos são cruciais na manutenção do perfil de expressão genética hev e linfócitos que se aproximam da LN13. O estresse de cisalhamento proporcionado pelo fluxo linfático é fundamental para estimular a expressão de quimioterapia na LN. O bloqueio do fluxo linfático interrompe a expressão quimiocina CCL21 na LN19, que é fundamental na direção do posicionamento da célula DC e T na LN. Portanto, o fluxo interrompido pode comprometer o posicionamento das células DC e T na LN8,18.
Imediatamente após a cirurgia, um pequeno rastreador fluorescente de peso molecular, FITC, foi usado para rastrear o fluxo linfático. FITC (10 μL de 2% FITC) foi injetado intradermicamente no footpad do controle falso e na perna linfática sutured. As pLNs drenantes foram coletadas 2, 6 e 12 h depois. As pLNs de drenagem foram incorporadas em OUTUBRO, e 20 μm de seções congeladas foram preparadas. As imagens confocal mostraram um acúmulo FITC substancialmente reduzido nas pLNs após a sutura. O FITC residual nas pLNs foi preferencialmente acumulado nos seios LN(Figura 2).
Como o linfático flui através do tecido adiposo ao redor da LN foi investigado usando sutura linfática. Os diferentes vasos linfáticos que levam às PLNs foram suturados para bloquear o fluxo linfático, e foi determinado que o tecido adiposo perinodal poderia suportar uma pequena quantidade de fluxo linfático quando os vasos linfáticos foram bloqueados21. O fluxo linfático através do tecido adiposo até a cápsula da LN foi mapeado; ele parecia alimentar-se dos seios LN. Pequenas quantidades de linfático podem ter fluído para os seios LN ao longo do tempo(Figura 3).
Figura 1: Passos de LN popliteal (pLN) a diferente sutura do vaso linfático. Resumidamente, depois que os ratos foram anestesiados com uma mistura de cetamina e xilazina, suas pernas foram raspadas, e a pele residual foi removida por um creme depilatório. A perna direita foi usada para sutura e a perna esquerda era o controle falso. O lado direito do footpad foi injetado intradermicamente com 5 μL de 1% de corante Evans Blue preparado na PBS. (A) Massageando suavemente o footpad, o corante Evans Blue encheu os vasos linfáticos a diferentes. (B) Um pequeno corte de pele foi realizado a 5 mm de distância do pLN para expor os vasos linfáticos, que são indicados pelas duas setas brancas. (C,D) Ambos os vasos linfáticos diferentes foram suturados. (E) A excisão da pele foi fechada por suturas. (F) A perna de controle recebeu injeção azul evans, excisão de pele e fechamento de sutura sem suturar os vasos linfáticos. (G) O sucesso do bloqueio de fluxo linfático foi indicado pelo corante azul evans, que entrou no pLN da perna de controle, mas não na perna suturada. (H,I) As pLNs coletadas foram incorporadas em composto OCT com sinuso subcapsular (SCS) e seios medulares (MS) de frente para o lado do criomold antes do congelamento de snap em nitrogênio líquido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Distribuição FITC nas pLNs drenantes da perna falsa ou suturada. Imagens confocais de pLNs coletadas 2, 6 e 12 h após a injeção fitc mostraram acúmulo FITC substancialmente reduzido nas pLNs após a sutura. O FITC residual nas pLNs foi preferencialmente encontrado nos seios LN. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Distribuição FITC no tecido adiposo perinodal (PAT), em torno das pLNs drenantes da perna sham ou suturada. Imagens confocais do PAT e da LN mostraram que o FITC entra no PAT e nos seios LN, mas não foi efetivamente distribuído por toda a LN quando os vasos linfáticos foram bloqueados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O bloqueio do fluxo linfático terá amplas aplicações na manipulação do fornecimento de antígenos ao LN em condições saudáveis e doentes. É possível usar este método para controlar o tempo de entrega de antígenos, a fim de estudar como o fluxo linfático contínuo regula a resposta imune na drenagem de LNs. Este método de interrupção do fluxo linfático também pode ser usado para estudar como a linfática impacta a compartimentação celular, ativação celular, migração celular e interações célula-célula no LN.
Camundongos que expressam especificamente o receptor de toxina difteria humana (DTR) em suas células endoteliais linfáticas(Flt4-cre-dtr) foram desenvolvidos; estes podem ser usados especificamente para esgotar especificamente vasos linfáticos para estudar a função linfática22. A administração do DT mata células endoteliais linfáticas ao longo dos vasos linfáticos e na LN. O esgotamento das células linfáticas do endotelial pode revogar completamente o fluxo linfático regionalmente ou sistematicamente para estudar a função linfática. Este método causa acúmulo significativo de fluidos no tecido e serve como um ótimo modelo para estudar linfedema e função linfática.
Comparado ao modelo de expressão DTR específico para células linfáticas, a vantagem do método de sutura linfática é que ele interrompe o fluxo linfático com danos mínimos às células endoteliais linfáticas ou a qualquer outro vaso linfático ao redor da área. A intervenção não afeta diretamente as células na LN drenante, de modo que o impacto resultante no microambiente LN ou na comunicação de células imunes é uma consequência do bloqueio de fluxo linfático em vez de morte celular potencial induzida pelo DT. Outro benefício deste método é que o fluxo linfático é imediatamente bloqueado após a cirurgia, de modo que o tempo do bloqueio de fluxo linfático pode ser melhor controlado.
A limitação deste método é que ele só pode ser usado para estudar a intervenção regional do fluxo linfático em vasos linfáticos diferentes do footpad para o pLN. Este método precisa ser identificado da localização exata dos vasos linfáticos coletados. A coleta de vasos linfáticos é difícil de identificar em alguns locais anatômicos e, portanto, essa técnica requer um extenso treinamento anatômico e cirúrgico antes da identificação bem sucedida de vasos linfáticos diferentes para bloquear o fluxo linfático. Outra limitação é que este método não pode bloquear diretamente linfáticos que entram nos vasos linfáticos iniciais. Após a sutura, o fluxo linfático bloqueado pode aumentar a pressão do fluido intersticial e alterar a direção do fluxo linfático nos vasos linfáticos iniciais. Assim, os vasos linfáticos intactos ao redor da área podem compensar a função dos vasos linfáticos interrompidos e alterar a direção do fluxo linfático.
Além disso, a injeção de corante Evans Blue aumenta a pressão do fluido intersticial, que pode interferir com o rastreador subsequente ou injeção de antígeno. A autofluorescência do corante Evans Blue pode interferir com outros rastreadores fluorescentes ou outros fluoroforos usados para coloração imunofluorescente. Para evitar qualquer interação entre o corante Evans Blue e potenciais antígenos, outros rastreadores ou potenciais mecanismos moleculares de regulação da função linfática, é possível identificar os vasos linfáticos coletados sem corante Evans Blue a olho nu. Isso pode ser alcançado com extenso treinamento para identificar os vasos. Outros corantes, como o corante azul isosulfan também podem ser usados para substituir o corante Evans Blue.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Ava Zardynezhad pela revisão do manuscrito. Este trabalho é apoiado pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR, PJT-156035), e pela Fundação Canadense de Inovação para AFIN (32930), e pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China para Yujia Lin (81901576).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W.
- Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
- Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
- Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
- Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
- Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
- Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
- Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
- Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
- Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
- Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
- Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
- Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
- Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).
- Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).
