Summary
Se presenta un protocolo para bloquear el flujo linfático mediante la sutura quirúrgica de los vasos linfáticos aferentes.
Abstract
Los vasos linfáticos son fundamentales para mantener el equilibrio de líquidos tisulares y optimizar la protección inmune mediante el transporte de antígenos, citoquinas y células a los ganglios linfáticos de drenaje (LN). La interrupción del flujo linfático es un método importante al estudiar la función de los vasos linfáticos. Los vasos linfáticos aferentes desde la almohadilla murina hasta los ganglios linfáticos popliteales (pNN) están bien definidos como las únicas rutas para el drenaje linfático en los pNN. Suturar estos vasos linfáticos aferentes puede prevenir selectivamente el flujo linfático a los pNN. Este método permite la interferencia en el flujo linfático con un daño mínimo a las células endoteliales linfáticas en el pLN drenante, los vasos linfáticos aferentes, así como otros vasos linfáticos alrededor de la zona. Este método se ha utilizado para estudiar cómo afecta la linfa los altos veules endoteliales (HEV) y la expresión de quimiocina en el LN, y cómo la linfa fluye a través del tejido adiposo que rodea el LN en ausencia de vasos linfáticos funcionales. Con el creciente reconocimiento de la importancia de la función linfática, este método tendrá aplicaciones más amplias para desentrañar aún más la función de los vasos linfáticos en la regulación del microambiente LN y las respuestas inmunitarias.
Introduction
La organización espacial del sistema linfático proporciona soporte estructural y funcional para eliminar eficientemente el líquido extracelular y transportar antígenos y células que presentan antígenos (APC) a los LN drenantes. Los vasos linfáticos iniciales (también llamados capilares linfáticos) son altamente permeables debido a sus uniones intercelulares discontinuas, que facilitan la recolección efectiva de líquidos, células y otros materiales de los espacios extracelulares circundantes1. Los vasos linfáticos iniciales se funden en vasos linfáticos recolectan, que tienen uniones intercelulares estrechas, una membrana sótano continua y cobertura muscular linfática. La recolección de los vasos linfáticos son responsables de transportar la linfa recogida a los LN drenantes y eventualmente devolver la linfa a la circulación2,3. Los vasos linfáticos recolectantes que introducen la linfa en el LN drenante son los vasos linfáticos aferentes4,5,6,7. La obstrucción de los vasos linfáticos aferentes puede bloquear el flujo linfático hacia los LN, que es una técnica útil al estudiar la función del flujo linfático.
Estudios anteriores han demostrado que el flujo linfático juega un papel importante en el transporte de antígenos y APC, así como el mantenimiento de la homeostasis LN. Se entiende bien que los APC derivados del tejido, típicamente activados células dendríticas migratorias (DC), viajan a través de los vasos linfáticos aferentes a la LN para activar las células T8. La idea de que los antígenos de forma libre, como microbios o antígenos solubles, fluyen pasivamente con linfa a la LN para activar los APC residentes en LN ha ido ganando aceptación en la última década9,10,11,12. Los antígenos de forma libre que viajan con la linfa tardan minutos después de la infección para viajar al LN, y la activación de la célula residente en LN puede ocurrir dentro de los 20 minutos después de la estimulación. Esto es mucho más rápido que la activación de controladores de dominio de migración, que tarda más de 8 h en entrar en el LN9de drenaje. Además de transportar antígenos para iniciar la protección inmunitaria, la linfa también lleva citoquinas y DC a la LN para mantener su microambiente, y para apoyar la homeostasis de células inmunitarias13,14. Anteriormente, el bloqueo del flujo linfático suturando los vasos linfáticos aferentes demostró que la linfa es necesaria para mantener el fenotipo HEV necesario para apoyar la célula T homeostática y la localización de células B a la LN15,16,17. CCL21 es una quimiocina crítica que dirige el posicionamiento de células DC y T en el LN8,18. El bloqueo del flujo linfático interrumpe la expresión CCL21 en el LN y puede interrumpir el posicionamiento y/o la interacción de los células DC y T en el LN19. Por lo tanto, el bloqueo del flujo linfático puede abrogar directa o indirectamente el acceso de antígeno/CC al LN drenante interrumpiendo el microambiente LN que regula las respuestas inmunitarias en el LN. Para investigar mejor la función del flujo linfático, se presenta un protocolo experimental (Figura 1) para bloquear el flujo linfático en ratones suturando los vasos linfáticos aferentes desde la almohadilla hasta el pLN. Este método puede ser una técnica importante para futuros estudios sobre la función linfática en condiciones saludables y enfermas.
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Protocol
Todo el trabajo animal debe ser aprobado por el comité institucional y gubernamental de ética y manejo de animales. Esta es una cirugía de no supervivencia.
1. Preparación de materiales
- Preparar 100 ml de etanol al 70% mezclando 70 ml de etanol 100% con 30 ml de agua estéril. Autoclave todas las herramientas quirúrgicas antes de la cirugía y mantener las herramientas en 70% etanol antes y durante la cirugía para mantener la esterilización.
- Prepare un aparato de inyección.
- Corte de 30 cm de tubo de polietileno (0,28 mm de diámetro). Conecte la punta de una aguja de 30 G x 1/2 (aguja A) a un extremo del tubo de polietileno. Desaloje cuidadosamente otra aguja de 30 G x 1/2 (aguja B) y conecte el lado roto al otro extremo del tubo de polietileno.
- Coloque la aguja A en una jeringa de tuberculina de 1 ml.
NOTA: Para este tubo de polietileno, 1,6 cm de líquido en el tubo corresponde a 1 l20.
- Preparar una mezcla de 10:1 ketamina/xiazina (10 mg/ml de ketamina y 1 mg/ml de xilazina) en solución salina (cloruro de sodio bacteriostático 0,9% [p/v]). Prepare la solución recién antes de su uso.
2. Preparación del animal para la cirugía
NOTA: Utilice ratones de 6 a 10 semanas. Se pueden utilizar ratones hembra y macho. En este estudio, se utilizaron ratones hembra de 6 a 10 semanas de edad, C57BL/6. Este método se puede adaptar para otras cepas de ratones.
- Anestesiar el ratón inyectando 250 l de la mezcla de ketamina/xylazina intraperitonealmente. Espere hasta que el ratón esté completamente dormido. Asegúrese de que el ratón no reacciona a un pellizco del dedo del dedo para detectar la anestesia completa.
- Afeitar el pelaje alrededor de las piernas con cortapelos.
- Aplicar la crema depilatoria alrededor de la pierna y esperar 5 min. Limpie el pelaje residual y la crema depilatoria usando un tejido húmedo y limpie la pierna con agua estéril. Rocíe 70% de etanol alrededor de la pierna para esterilizar el área de operación. El etanol está restringido al sitio de la incisión.
3. Sutura quirúrgica de vasos linfáticos aferentes
NOTA: La pierna derecha se sutura, y la pierna izquierda se utiliza como el control falso. El protocolo de sutura linfática (pasos 3.1-3.8) toma 20-30 min.
- Mantenga el ratón en una posición propensa y fíjelo con cinta quirúrgica para exponer el área de operación en la pierna derecha.
- Inyecte por vía intradérgica 5 ml de 1% de tinte azul Evans o 9 cm del líquido del tubo del aparato de inyección en la almohadilla. Masajea suavemente el reposapiés para ayudar a Evans a entrar en el azul de los vasos linfáticos.
NOTA: La jeringa de insulina no es fácil de controlar para la inyección de pequeño volumen. El volumen se puede controlar con mayor precisión utilizando el aparato de inyección. Los vasos linfáticos se visualizan con tinte azul debajo de la piel. Con un entrenamiento extenso, ambos vasos linfáticos aferentes se pueden ver a simple vista como vasos transparentes en el tejido adiposo, paralelos a la arteria safenosa. Con un entrenamiento extenso, es posible suturar los vasos sin inyectar tinte Evans Blue en los casos en que hay preocupaciones de posibles alteraciones del tinte. - Bajo un microscopio diseccionado, elija un sitio de incisión a 5 mm del borde inferior de la fosa popliteal. Haga una pequeña incisión (5 mm) en la piel con tijeras. Usando fórceps de operación fina, estire la incisión y exponga los vasos linfáticos recolectan (Figura 1A).
NOTA: Si es necesario, se puede extraer un pequeño fragmento de piel para exponer los vasos linfáticos. - Identificar ambos vasos linfáticos aferentes que conducen a los pLN bajo el microscopio diseccionante (Figura 1B).
NOTA: Hay dos vasos linfáticos aferentes desde la almohadilla hasta el pLN. Ambos necesitan ser suturados para bloquear completamente el flujo linfático. - Con un soporte para agujas, inserte con precaución la aguja de sutura (0,7 métrica o menor) entre el vaso linfático aferente y la arteria Safenous y tire de la aguja suavemente alrededor del vaso linfático aferente. Tire suavemente de la cuerda de sutura y deje unos 2 cm de la cuerda de sutura detrás. Utilice el soporte de la aguja para ayudar a atar la cuerda firmemente para suturar un vaso linfático con un nudo del cirujano (Figura 1C).
NOTA: El tejido debajo de la incisión puede secarse con una exposición prolongada al aire. Hacer la incisión lo más pequeña posible y realizar la sutura rápidamente (es decir, dentro de 5 min) evitará que el tejido se seque. Mantener la humedad del tejido mediante la aplicación de un pequeño volumen de solución salina con un hisopo de algodón. - Masajee suavemente la almohadilla para asegurarse de que ningún tinte Evans Blue pase el sitio de la sutura y luego corte el exceso de cuerda con tijeras.
- Realice los mismos pasos de sutura (es decir, los pasos 3.5 y 3.6) en el otro vaso linfático aferente (Figura 1D). Cierre la incisión cutánea con la misma sutura que se utilizó para suturar los vasos en el paso 3.5 (Figura 1E).
- Para el control falso, inyectar indérgicamente 5 l de 1% de colorante azul Evans en el teclado izquierdo y masajear el reposapiés para visualizar los vasos linfáticos. Abra la piel con una escisión y luego cierre la herida sin suturar el vaso (Figura 1F).
- Opcionalmente, monitoree los ratones operados durante 2 x 4 h. El lado de la sutura de la pierna debe mostrar edema con Evans Blue extendido al muslo, mientras que la pierna de control mostrará un tinte azul Evans restringido en el reposapiés. Si los ratones despiertan, se inyectará una mezcla adicional de ketamina/xiazina para mantenerse anestesia hasta la eutanasia.
4. Seguimiento del flujo linfático
- Inmediatamente después de la cirugía, inyectar indesablemente 10 ml de isotiocianato de fluoresceína al 2% (FITC) en el reposapiés tanto del control como de la pierna suturida linfática.
- Eutanasiar a los ratones con 400 l de mezcla de ketamina/xilazina y realizar la luxación cervical cuando los ratones están completamente anestesiados.
- Recoger los pNS de la fosa popliteal y retirar cuidadosamente el tejido adiposo perinodal alrededor de los pLN bajo el microscopio de disección a las 2, 6 y 12 h después de la inyección de FITC.
- Incrustar los pLN con el área medular del seno mirando hacia el lado del criomold en el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) (Figura 1G,H).
- Preparar secciones congeladas de 20 m con un criotomo.
- Imagen de las criocciones bajo un microscopio confocal para determinar la distribución de FITC.
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Representative Results
La sutura de vasos linfáticos se ha utilizado en estudios anteriores15,16,17,19, donde sirvió como una herramienta importante para estudiar la función del flujo linfático antes de que se entendiera mejor la biología molecular de los vasos linfáticos. El bloqueo del flujo linfático interrumpe la homeostasis LN, lo que lleva a que los HEVs pierdan la expresión génica crítica necesaria para la localización óptima de linfocitos a la LN15,16,17. Desde entonces, se necesitaron otras dos décadas para demostrar que los DC que viajan con la linfa son cruciales para mantener el perfil de expresión del gen HEV y los linfocitos que se dedican a la LN13. El estrés de cizallamiento proporcionado por el flujo linfático es crítico para estimular la expresión de quimiocina en el LN. El bloqueo del flujo linfático interrumpe la expresión de chemokina CCL21 en el LN19,que es fundamental para dirigir el posicionamiento de células DC y T en el LN. Por lo tanto, el flujo interrumpido puede comprometer el posicionamiento de los DC y de las células T en el LN8,18.
Inmediatamente después de la cirugía, se utilizó un pequeño marcador fluorescente de peso molecular, FITC, para rastrear el flujo linfático. FitC (10 l de 2% FITC) se inyectó por vía intradértica en la almohadilla del control falso y en la pierna suturada linfática. Los pNN drenantes se recogieron 2, 6 y 12 h más tarde. Los pLN drenantes se incrustaron en oct, y se prepararon secciones congeladas de 20 m. Las imágenes confocales mostraron una acumulación de FITC sustancialmente reducida en los pLN después de la sutura. El FITC residual en los pLN se acumuló preferentemente en los senos paranasales LN (Figura 2).
La forma en que la linfa fluye a través del tejido adiposo que rodea el LN se investigó utilizando sutura linfática. Los vasos linfáticos aferentes que conducen a los pLN fueron suturados para bloquear el flujo linfático, y se determinó que el tejido adiposo perinodal podía soportar una pequeña cantidad de flujo linfático cuando los vasos linfáticos estaban bloqueados21. Se cartografió el flujo linfático a través del tejido adiposo a la cápsula del LN; parecía alimentarse en los senos paranasales del LN. Pequeñas cantidades de linfa pueden haber fluyedo hacia los senos paranasales LN con el tiempo (Figura 3).
Figura 1: Pasos de la sutura de vasos linfáticos aferentes LN popliteal LN (pLN). Brevemente, después de que los ratones fueron anestesiados con una mezcla de ketamina y xilazina, sus piernas fueron afeitadas, y el pelaje residual fue eliminado por una crema depilatoria. La pierna derecha se utilizó para sutura y la pierna izquierda era el control falso. El lado derecho de la almohadilla se inyectó por vía intradérgica con 5 l de 1% de colorante azul Evans preparado en PBS. (A) Al masajear suavemente la almohadilla, el tinte Evans Blue llenó los vasos linfáticos aferentes. (B) Se realizó un pequeño corte cut a 5 mm de distancia del pLN para exponer los vasos linfáticos, que están indicados por las dos flechas blancas. (C,D) Ambos vasos linfáticos aferentes fueron suturados. (E) La escisión cutánea se cerró con suturas. (F) La pierna de control recibió inyección azul Evans, escisión cutánea y cierre de sutura sin suturar los vasos linfáticos. (G) El éxito de la obstrucción del flujo linfático fue indicado por el tinte azul Evans, que entró en el pLN de la pierna de control, pero no la pierna suturada. (H,I) Los pLN recogidos se incrustaron en el compuesto OCT con seno subcapsular (SCS) y seno medular (MS) frente al lado de la lloldada antes de congelarse en nitrógeno líquido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Distribución FITC en los pNN de drenaje de la pata falsa o suturada. Las imágenes confocales de pLNs recogidos 2, 6 y 12 h después de la inyección de FITC mostraron una acumulación de FITC sustancialmente reducida en los pLN después de la sutura. El FITC residual en los pLN se encontró preferentemente en los senos paranasales LN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Distribución fitC en el tejido adiposo perinodal (PAT), alrededor de los pLN drenantes de la pata falsa o suturada. Las imágenes confocales de la PAT y la LN mostraron que fitC entra en la PAT y los senos paranasales del LN, pero no se distribuyó efectivamente por todo el LN cuando los vasos linfáticos fueron bloqueados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El bloqueo del flujo linfático tendrá amplias aplicaciones en la manipulación del suministro de antígenos al LN en condiciones saludables y enfermas. Es posible utilizar este método para controlar el momento de la administración de antígenos con el fin de estudiar cómo el flujo linfático continuo regula la respuesta inmune en el drenaje de LNs. Este método de interrupción del flujo linfático también se puede utilizar para estudiar cómo afecta la linfa a la compartimentación celular, la activación celular, la migración celular y las interacciones de células celulares en el LN.
Se han desarrollado ratones que expresan específicamente el receptor de toxinas de la difteria humana (DTR) en sus células endoteliales linfáticas (Flt4-cre-dtr); estos se pueden utilizar para agotar específicamente los vasos linfáticos para estudiar la función linfática22. La administración de DT mata las células endoteliales linfáticas a lo largo de los vasos linfáticos y en el LN. El agotamiento de las células endoteliales linfáticas puede abrogar completamente el flujo linfático regional o sistémicamente para estudiar la función linfática. Este método causa una acumulación significativa de líquido en el tejido y sirve como un gran modelo para estudiar el linfedema y la función linfática.
En comparación con el modelo de expresión DTR endotelial endotelial linfático, la ventaja del método de sutura linfática es que interrumpe el flujo linfático con un daño mínimo a las células endoteliales linfáticas o a cualquier otro vaso linfático alrededor de la zona. La intervención no afecta directamente a las células en el LN drenante, por lo que el impacto resultante en el microambiente LN o la comunicación de células inmunitarias es una consecuencia del bloqueo del flujo linfático en lugar de la muerte celular potencial inducida por DT. Otro beneficio de este método es que el flujo linfático se bloquea instantáneamente después de la cirugía, por lo que el tiempo del bloqueo del flujo linfático puede ser mejor controlado.
La limitación de este método es que sólo se puede utilizar para estudiar la intervención regional del flujo linfático en los vasos linfáticos aferentes desde la almohadilla hasta el pLN. Este método necesita la identificación de la ubicación exacta de los vasos linfáticos de recolección. La recolección de vasos linfáticos es difícil de identificar en algunos lugares anatómicos, y por lo tanto esta técnica requiere un amplio entrenamiento anatómico y quirúrgico antes de la identificación exitosa de vasos linfáticos aferentes para bloquear el flujo linfático. Otra limitación es que este método no puede bloquear directamente la linfa que entra en los vasos linfáticos iniciales. Después de la sutura, el flujo linfático bloqueado puede aumentar la presión del líquido intersticial y cambiar la dirección del flujo linfático en los vasos linfáticos iniciales. Por lo tanto, los vasos linfáticos intactos alrededor de la zona pueden compensar la función de los vasos linfáticos interrumpidos y cambiar la dirección del flujo linfático.
Además, la inyección de tinte Evans Blue aumenta la presión del líquido intersticial, que puede interferir con el posterior marcador o inyección de antígeno. La autofluorescencia del tinte Evans Blue puede interferir con otros trazadores fluorescentes u otros fluoróforos utilizados para la tinción inmunofluorescente. Para evitar cualquier interacción entre el tinte Evans Blue y los antígenos potenciales, otros trazadores o los posibles mecanismos moleculares de la regulación de la función linfática, es posible identificar los vasos linfáticos de recolección sin tinte Evans Blue a simple vista. Esto se puede lograr con una amplia formación para identificar los vasos. Otros tintes, como el tinte azul isosulfano también se pueden utilizar para reemplazar el tinte Evans Blue.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Ava Zardynezhad por la corrección del manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo del Instituto Canadiense de Investigación Sanitaria (CIHR, PJT-156035) y la Fundación Canadiense para la Innovación para SL (32930), y por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China para Yujia Linjia (81901576).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
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