Summary
热极限可以预测生物体所容忍的环境，这是面对快速气候变化的宝贵信息。此处描述的高通量协议用于评估昆虫的关键热最小和热敲取时间。两种协议都最大限度地提高了吞吐量，并最大限度地降低测定的成本。
Abstract
植物和动物的上下热限是预测其性能、生存和地理分布的重要指标，对于预测对气候变化的反应至关重要。这项工作描述了测量昆虫热极限的两种高通量协议：一种用于评估临界热最小值（CTmin），另一种用于评估热敲落时间（KDT）以响应静态热能器。在 CTmin 测定中，个体被放置在丙烯酸套柱中，受到温度下降的斜坡的影响，并使用红外传感器从栖息体上下降时进行计数。在热 KDT 测定中，个体被包含在 96 井板中，放置在培养箱中，温度压力大，并录制视频，以确定他们不能再直立和移动的时间。与常用技术相比，这些协议具有优势。这两种检测成本都很低，可以较快完成（+2小时）。CT最小 测定可减少实验者误差，并可同时测量大量个体。热 KDT 协议生成每个检测的视频记录，从而消除实验者偏差和实时持续监控个体的需要。
Introduction
昆虫的热极限
环境条件的变化，包括温度，是影响生物体1，2的性能，健身，生存和地理分布的主要因素2。上部和下热限决定了生物体能够容忍的环境的理论范围，因此，这些限制是植物和动物分布的重要预测因素，特别是在气候变化面前。,4因此，精确测量热极限的协议是生态学家、生理学家、进化生物学家和保护生物学家等的重要工具。
昆虫作为最丰富、最多样化的陆地动物，经常用于测量热极限。临界热最大值（CT最大值）和临界热最小值（CTmin）通常用于评估热公差,5、6、7,6中特异性和特异性变化。虽然CT最大值和CT最小值可以测量多种表型，包括生长，生殖输出和行为，它们最常应用于运动功能5，6，7。,6,7因此，CT最大值（也称为热敲降温度）和CTmin通常被定义为高低温，昆虫失去运动功能，无法保持直立5，6，7，8，9，10，11。6,7,8,9,10,115CTmin与冷昏迷的开始相吻合，冷温6带来的可逆瘫痪。虽然在热极限下瘫痪通常是可逆的，但持续暴露在这些温度下会导致生态死亡5。
测量热极限的常用方法
各种仪器被用来测量热极限（如辛克莱等人）6.简言之，昆虫在12、13、,浸于液体浴池中的容器12、13、11、14、15、16、,14,15,16铝块1310、17,17或带套的容器18中加热或冷却，并监测直至运动停止。在分析过程中监测昆虫，最常见的方法是直接观察，其中对个体进行实时或回顾性监测，并录下6、9、10、11、15、17。,10,11,15,176,虽然直接观测方法对设备要求最低，但都是劳动密集型的，限制了吞吐量。或者，昆虫可以通过收集个体在离散时间，因为他们,从栖息6，19，20，21,19,20或使用活动监测13间接观察。
与直接观测方法相比，测量热极限的间接方法通常比吞吐量高，而且可能不太容易出错。最常见的间接监测方法使用带衣水的温度控制列6、8、19、20、21。6,8,19,20,21昆虫被放置在带栖息的柱内，内室的温度通过从温度控制流体浴中泵送液体通过柱的套管衬里进行控制。达到其热极限的个人从栖息处下降，并在离散的温度或时间间隔内被收集。虽然这种方法适用于CT分钟，但它已被发现不适合CT最大值，因为当温度升高时，苍蝇会自愿走出柱底。此处描述的新方法通过在自动测量过程中单独包含苍蝇来规避此问题。
除了观察方法外，两种类型的温度制度通常用于评估热上限。动态测定包括逐渐升高的温度，直到运动功能丧失;温度是动态CT最大值max7，8，9，13。,8,9,13相比之下，静态测定由恒定的压力温度组成，直到运动功能丧失;时间点是热敲落时间（热KDT），也被称为静态CT最大值（sCT最大值）在最近的论文由Jürgensen等人,7，8，9，16，22。8,16,2279虽然CT最大值和热敲制测定（热KD测定）产生具有不同单位的指标，但两个特性的数学建模表明它们提供了热耐受性方面可比的信息，并且两者都与生态相关8,8，9。动态测定产生的温度可以与环境条件进行比较，当耐热性差异很大时，例如具有广泛不同热散位物种之间的比较，则更可取。然而，由于热损伤积累的Q10值很高，静态测定对于检测小效应尺寸（如热公差9的特异性变化）可能更可取。此外，实际上，静态检测需要的设备不如动态检测。
目的
本文的目的是正式确定CT最小 和热KD测定的方法，可用于未来的研究，以评估动虫的热极限。这些协议根据以前建立的方法进行改编，设计为高吞吐量、自动化且具有成本效益。这两项测定都可以在短时间内完成（±2小时），这意味着可以在一天中进行多个实验，在不牺牲可重复性或准确性的情况下产生大量数据。通过此设置，可以同时测量 96 只苍蝇的耐热性，而 CTmin 的柱 可以容纳 100 多只苍蝇，前提是有足够的表面积进行栖息。
用于观察 CT min 的高通量方法 通过添加红外传感器来自动计数苍蝇，修改了常见的套护柱方法。Shuman等人于1996年23 日首次提议使用红外传感器进行计数，但一直未得到广泛采用。红外传感器的添加允许生成连续数据，而不是以离散的时间间隔收集数据。该协议还通过消除手动数据输入和在离散时间点手动切换千斤列下方的收集管，最大限度地减少了实验者错误。
从之前对昆虫10、12的耐热性两项研究中，对记录热KDT的高通量方法进行了修改。单个苍蝇储存在温度控制培养箱中的 96 井板中，并录制视频。该协议最大限度地减少了实验者在确定热 KDT 时的偏差，因为可以通过播放录制来审查和验证实验。该协议还提供一组自定义 Python 脚本，可用于加快视频分析速度。使用单个井消除了当其他个体移动或摔倒时可能发生的干扰，当在同一竞技场10、17中观察到个体群体时，可能会造成问题。此外，温度控制培养箱在所有96孔中提供稳定的温度，这与有时在温度控制铝块10上观察到的温度梯度不同。另请注意，96 井记录方法可以调整为测量动态 CT最大值和潜在的 CT最小值（请参阅讨论）。
为了证明每个方案，比较了来自 果蝇 黑色素杆菌遗传参考 小组 （DGRP）选择线的成年果蝇黑色素杆菌女性的热极限。之所以选择这些线，是因为初步实验表明热公差存在显著差异。这些测定证明是区分热公差的强健方法。以下两种协议，高通 量CT最小测定（第1节）和高通量热KD测定（第2节），描述了为能够适应 任何可安装于仪器（如成人果蝇）的昆虫生命阶段生成CT最小值和热KDT数据 的必要操作。对于CT 分钟，昆虫能够栖息也是必不可少的。在这里，每个测定都证明在 成人果蝇黑色素。但是，对于其他分类或生命阶段6可能需要修改。细微的变化可能包括使用具有较大开口的栖息材料，以容纳 CTmin 测定 中更大的样本，或使用更高质量的摄像机来识别慢移动昆虫的细微 KDT 或热 KD 测定中的生命阶段。该协议没有描述准备苍蝇的方法，但重要的是要标准化饲养协议，以确保可重复性25（ 见加西亚和蒂茨26和 Teets和Han27）。提供的协议包括有关如何构建和设置设备、如何记录测量以及数据分析的简要说明的信息。
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Protocol
1. 高通量CT最小 测定
- 组装套护柱（图1 A，A图2）
- 用电锯切割最宽（7 厘米 x 6.35 厘米 x 0.3 厘米）和最窄的（5.7 厘米 x 5.1 厘米 x 0.3 厘米）丙烯酸管，长度相等（31.5 厘米）（图 2A）。这两个管子将是套管柱的外侧和内侧壁。
- 切两个环（2厘米宽）从中间（6.35厘米x5.7厘米x 0.3厘米）丙烯酸管与电锯（图2A）.这两个环将是内管和外侧管之间的空间，在两个长丙烯酸管之间形成一个空间，使流体流动。
- 小心地在外侧（最宽）丙烯酸管上钻两个孔，顶部一个孔，底部一个孔。确保每个孔与管端 3.5 厘米。在管的对面钻孔（图2B）。
- 为了减少开裂，请将胶带放在管上，放在未来孔的点上，并在钻头的最低扭矩设置上非常缓慢地钻孔。
- 使用螺纹水龙头，螺纹两个孔，以便软管适配器可以拧入外管的两个孔。要减少开裂，请用手使用润滑剂和螺纹。
- 将两个空间滑到内护套上，两端各有一个（底部和顶部）。在空间和内护套的端之间留下一小块空间（0.5 厘米）（图 2B）。
- 使用丙烯酸水泥将焊缝焊接到位。
- 在内管和空间上设置水泥后，将该结构滑入带孔的较大外管中。确保外管和内管两端齐平。空间器将远离末端 0.5 厘米，在柱子的两端形成小沟槽（图2C）。
- 使用丙烯酸水泥将外管焊接到焊缝上，使用可调钢夹将设备粘合在一起。等水泥套。
- 将软管适配器螺纹插入外管的孔中，现在固定在空间和内管上。
注：适配器应仅螺纹进入外管，而不应插入内管和外管之间的开放空间。如果软管适配器螺纹过远，请用电锯将它们缩短到适当的长度。 - 用硅胶密封剂将软管适配器密封到外管上的螺纹中。
- 用硅胶密封剂填充套管两端内侧和外侧的两个沟槽。
- 要测试柱，请将直径为 0.6 厘米的油管连接到软管适配器上。将柱底的适配器连接到带油管的水源，将柱顶的适配器连接到带不同管的排水管。
- 从底部到顶部通过设备运行水，并检查有无泄漏。如果出现泄漏，请确定它们来自哪里，并用硅胶密封。
- 设置套套柱和 果蝇漏斗监视器 （DFM）
- 用三爪式反驳夹将夹紧的夹形柱固定到反驳支架上。将柱子垂直对齐，一端与天花板开放，另一端与实验室工作台对齐（图1B）。
- 将温度控制冷藏浴的液体输入和输出连接到具有 0.6 厘米直径塑料管的柱形适配器喷嘴（图 1B）。将流体输入连接到柱底部的喷嘴，将流体输出连接到柱顶部的喷嘴。
- 切割两个 3 厘米厚的圆形泡沫绝缘塞（与柱中最内侧隔间开口的周长相同）。确保插头紧贴，两端插入时密封最内侧的柱子（图 1B）。
- 通过其中一个插头的中心刺穿一个孔，将热电偶的裸端穿过约 5 厘米的孔，用胶带固定。将热电偶的另一端插入热电偶数据记录器。
- 将热电偶数据记录器连接到计算机。
- 将两块塑料排水沟护罩（5 厘米 x 7 厘米，直径为 ±0.5 厘米的开口）楔入柱子内，用作栖息材料。将一块护罩从列的顶部放置 2/3rd，从列顶部放置另一块 1/3rd（图 1B）。
- 固定底部插头（不带热电偶）和顶部插头（带热电偶）。当插头插入柱的顶部时，确保热电偶不接触柱的侧面。
- 调整柱架上柱的高度，使柱底和台顶之间有 25 厘米的距离。
- 将反火环（直径 5 厘米）固定到柱下方 5 厘米的蒸馏支架上，然后将回转环旋转到柱的一侧。
- 将 DFM 直接设置在反波环上（图 1B）。根据制造商的协议连接所有电子元件：电源、电源接口和计算机。
- 连接组件后，按照制造商的协议完成 DFM 和 DFM 软件的设置。
- Ct分钟 测定
- 将液浴的输入和输出阀转动到打开位置。
- 按下电源按钮打开温度控制的液体浴，然后按下播放按钮运行程序，将浴缸温度提高并保持在 25°C。 给流体浴和柱 5-10 分钟达到并保持 25 °C。
- 拆下柱子顶部的插头，用漏斗（直径 5.08 厘米）替换;参见 图 1C。
- 将苍蝇从食物小瓶中插入柱子。
- 拆下漏斗，并迅速用顶部插头更换，小心不要让苍蝇逃脱。给苍蝇 5 分钟安定，偶尔敲底塞鼓励苍蝇爬。
- 按下液浴上的启动按钮，开始 CT最小 斜坡程序（25 °C 5 分钟;25°C 至 10°C，0.5 °C/min;10°C 2 分钟;10°C 至 -10 °C，0.25 °C/分钟）。
注：此 CT最小斜坡 协议的其他变体可根据研究问题使用（例如，比较不同斜坡速率对 CTmin28 的影响）。 - 单击打开计算机上的热电偶记录软件，然后单击 "记录" 图标，在测定期间开始每隔一秒记录列内的温度。确保每个温度记录都包含特定于第二个温度记录的时间戳，以便以后可以将温度数据与 DFM 的数据合并。
- 将 5 mL 的 90% 乙醇加入 15 mL 锥形离心管，并将其放在柱下方的机架中。
- 偶尔，点击柱子的底部插头，以吸引底部的任何苍蝇爬上去。大多数苍蝇将在栖息或接近柱的顶部 15 °C。
- 在 15 °C 下，拆下底部插头并收集乙醇底部插头上的任何苍蝇。计数并注意，这些苍蝇是在15°C时收集的，但他们的CT分钟 是未知的。
注：底部插头的去除温度应在检测前确定，并基于测试物种或治疗 的预测CT分钟。对于此测定，根据初步测定中发现的这些特定 DGRP 线的 CT min 选择 15 °C。 - 将 75 mm 外径玻璃漏斗放入 DFM 中。调整反火环、DFM 和漏斗，使它们在列下。确保漏斗的唇完全密封柱的底部（图1D）。
- 将漏斗底部插入 15 mL 收集管（图 1D）。
- 单击"软件"图标打开计算机上的 DFM 软件。该软件将立即开始记录飞行到达其CT分钟的时间/日期。达到CT分钟的苍蝇 会失去神经肌肉功能，从栖息中脱落，然后通过DFM。
- 通过检查顶部插头和栖息点， 以观察所有苍蝇是否已达到其CT分钟数（即，仍保持神经肌肉功能）。当所有的苍蝇都达到他们的CT分钟时，审判就结束了。
- 在试用结束时，调整 DFM 并漏斗远离柱开口。有些苍蝇可能达到其CT分钟 ，但仍然卡在柱子中（即楔在栖息处或由单个柏油钩悬空）。打开顶部插头并卸下这些苍蝇。这些苍蝇 的CT分钟是未知的。
- 使用 RStudio 中的 Merge 命令，结合热电偶记录软件（即温度、日期和时间）和 DFM 软件（即漏斗中的苍蝇数量、日期和时间）的 .txt 输出文件 。根据共享日期/时间变量合并两个文件。
2. 高通量热 KD 测定
- 设备组装和制备
- 使用粘合剂，将钢织线网（±1.5 mm 孔径）固定到 96 孔无底板的底部。
- 用热胶枪和热胶将磁铁连接到 96 井无底板底部的对面（图 3）。
- 要制作一个定制的隔膜盖与胶粘膜设计为96孔板，粘在一起两个薄膜粘在一起，形成一个山脊塑料板。
- 将塑料板放在 96 井板上，并使用胶带将塑料板粘附在板的所有四面。在板上每孔的开口上，用盒式切割机（即总共 96 x）在塑料板中切割一个"x"。
- 用 CO 2 麻醉苍蝇， 并分别将它们装入经过改造的 96 井无底板的每个井中，并配有吸气器和隔膜盖。当苍蝇用CO2麻醉时，从96井板中取下隔膜 盖，用紧贴的透明盖子进行更换。
- 将装有苍蝇的 96 井无底板放在食物上，并盖上清晰的紧固盖。确保苍蝇在 CO2 麻醉和测定开始之间至少 48 小时（步骤 2.2.1-2.2.5）。
注：经过修改的96孔无底板的底部由网状物制成，因此在试验开始前，用CO2 麻醉的苍蝇可以装载并留在食物上至少48小时。任何塑料容器 >8.5 厘米宽 x 13 厘米长，至少 2 厘米深，以适应 1 厘米深的食物层可以使用。 - 用胶带将网络摄像头固定到温度控制培养箱内部的底部。将相机直接向上（图4）。固定摄像机上方约 10 厘米的孵化器架。
注：网络摄像头从下方向上点并记录 96 井板，以确保尽可能多地查看井面（例如，不被板井壁挡在视野外）。当苍蝇到达他们的KDT时，它们落到井底;在这种情况下，最接近网络摄像头的一侧，因此在视图中，无论他们的井离视图中心有多远。 - 将网络摄像头连接到计算机。
- 用胶带将一张白纸（8.5 厘米 x 13 厘米;96 井板底部的确切区域）贴在货架底部（图 4）。确保通过网络摄像头查看纸张时填充整个帧。
- 在培养箱中放置光源。使用纸张或其他材料来抑制光线并尽量减少眩光。
注 步骤 2.1.10 特定于每个孵化器，因为孵化器的照明和反射各不相同。目标是在培养箱中有足够的照明，以便使用网络摄像头观看时，在每一个井中的苍蝇和板后面的白纸之间提供良好的对比度。
- 执行热 KD 测定
- 将培养箱设置为 37.5 °C，等待约 30 分钟，让培养箱有时间达到并保持所需的温度。确切的温度将取决于被评估的昆虫和任何其他时间考虑。
- 将 96 井板倒置在培养箱中，使板的底部（网状侧）与纸盒底部的白纸对等（图 4）。记下托盘和网络摄像头框架中孔（列和行名称）的方向。彩色胶带沿着96井板的两侧和白纸的边缘可以验证方向（图4）。
注：在热 KD 检测的试验中，使用热电偶记录板内的温度，确保培养箱温度与 96 井板内的温度一致。在进行热 KD 测定之前，谨慎检查具有多个热电偶的 96 井板井之间的温度变化是否可忽略不计。 - 关闭孵化器门。
- 单击 视频 录制软件上的"录制"。
- 2 小时后，检查记录，查看所有苍蝇已到达其最后的静止位置并停止移动。一旦所有苍蝇停止移动，点击停止视频录制软件。对于在这里测试的基因型，在25°C下饲养，大多数苍蝇在37.5°C时达到60分钟的KDT（另见Jürgensen等人9）。
- 处置苍蝇。
- 使用自定义 Python 脚本 （补充编码文件 1-3） 来估计视频中苍蝇到达热 KDT 时的时间。
注：步骤 2.2.7 是可选的。为了加快视频分析速度，开发了一组自定义 Python 脚本，用于测量每个井中像素密度随时间的变化（请参阅 补充编码文件）。当苍蝇停止移动时，像素密度是恒定的，这些数据的绘图可用于定位苍蝇被击倒时视频中的近似时间。虽然可以使用此脚本自动执行数据分析，但目前视频中的细微缺陷会导致像素密度变化与真实 KD 时间之间的细微差异。 - 单击打开视频文件，将每只苍蝇的 KDT 记录在每一个井中。试验和观察者之间最一致的热 KDT 测量是记录苍蝇到达其最终静止点的时间。
- 反向跟踪视频，专注于单个井，并注意到苍蝇首先离开其最终休息点的时间。对每一个井重复此过程。
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Representative Results
测量了来自嗜血杆菌黑色素酯遗传参考面板（DGRP）的女性的热极限（即CT min和热KDT），以证明从所述两种协议生成的高通量数据。使用min DGRP 行 714 （n = 37） 和 913 （n = 45） 测定 CT 分钟。对热 KDT 进行了检测，并与 DGRP 行 189（n = 42）和 461（n = 42）进行比较，并手动分析视频文件。实验的总时间（包括观看视频）每个协议都花了 <2 小时。
DGRP线913的女性平均CT最小 温度明显低于DGRP线714的女性（图5A;威尔科森排名和测试， W = 1585， P < 0.001）.两条线的CT最小分布明显：913线CT最小 值为5.00±1.35°C（均值± SD），714线CT最小 值为9.60±1.53°C。
37.5 °C时的热量 KDT 与 DGRP 线 73 和 461 之间的雌性明显不同（图 5B;威尔科森排名和测试， W = 1658.5， P < 0.001）.虽然两条线路的 KDT 存在差异，但很容易检测到线路之间的热 KDT 差异。73号线的线平均KDT比461线长14.8分钟（73号线平均KDT，55.58±6.92分钟;线路 461 均值 KDT，40.78 ± 6.64 分钟）。
图 1：为 CT 分钟测定设置套接 柱。 （A） 组装的夹克柱。（B） 带顶部和底部插头的套管柱密封内室。热电偶通过顶部插头上的孔进行螺纹螺纹。DFM 安装在柱下方的回火环上，然后移到侧面。（C） CT分钟测定 的开始。顶部插头被拆下，苍蝇通过柱顶开口的漏斗倒入内室。（D） 在 CT 分钟测定期间，套护柱和 DFM。底部插头已从列中删除，DFM 和漏斗位于列下方。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 2：套护柱的技术图解。 （A） 每块丙烯酸管切至长度：i） 两个音圈切割至3.5厘米长（步骤1.1.2）：ii）。最宽的丙烯酸管切割至31.5厘米（步骤1.1.1）;和 iii 最窄的丙烯酸管切割到 31.5 厘米（步骤 1.1.1）。（B） 两个洞（灰色）钻入最宽的丙烯酸管，从两端和对面3.5厘米（i;步骤1.1.2）。用两个分圈（ii;步骤1.1.6和1.1.7）组装最窄的丙烯酸管。（C） 步骤 1.1.8-1.1.12 后完成的套套柱。软管适配器以灰色表示。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：96井无底板的底部（左）和顶部（右）视图。 钢编织网附在经过改造的 96 井无底板的底部。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：热KD测定的孵化器设置。 （A） 网络摄像头和舞台设置在远处。（B） 在试验开始前，在孵化器中安装摄像头和舞台设置。网络摄像头固定在孵化器的地板上，托盘比网络摄像头高 10 厘米。（C） 在热 KD 检测期间，网络摄像头上方白色舞台上的 96 井板的方向。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 5：来自果蝇遗传参考面板 （DGRP） 的 精选线路的下部和上限热限。 （A）两条 DGRP 线的 CT 最小值。（B） 在 37.5 °C 时加热两条 DGRP 线路的 KDT。 请点击这里查看此图的较大版本。
图 6：测试数据集的视频分析脚本的活动输出。 每个图表示来自 96 井板的一个井的活动数据。共测试了84个样品并进行了展示。井 ID 标记在每个直方图的右侧。 请点击这里查看此图。
补充编码文件 1.请点击这里下载此文件。
补充编码文件 2.请点击这里下载此文件。
补充编码文件 3.请点击这里下载此文件。
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Discussion
上面详述的两种方法生成高通量数据，用于最高和较低的热限的生态相关指标。这些协议以以前确立的昆虫热极限研究共同方法为基地（辛克莱等人总结）。6. 两个协议都可以在短时间内完成（每个协议±2小时），生成具有较大样本量的数据集，不牺牲重复性或准确性，并通过消除手动数据记录和输入（CTmin检测 ）或创建每次检测的备份视频记录（热 KD 测定）来最大限度地减少实验者错误。
通过比较DGRP24中特定线的成年女性的热极限，产生了代表性的结果。两种测定都显示出线路之间的热公差显著差异。这些测定中各行之间的效果大小相对较大，这反过来又允许通过视觉和统计比较对组进行可靠的区分。两条 DGRP 线之间 KDT 的巨大差异突出了静态测定与动态斜坡检测的潜在优势;静态检测比动态检测9，可以更好地检测组间较小的差异。受热 KD 测定的两条 DGRP 线路在平均 KDT 中相差 14.8 分钟。作为参考，Rolandi 等人 13 使用动态斜坡协议显示，34 DGRP 线的最高和最低 CT 最大值差仅为 1.42 °C，或 <6 分钟，加长程为 0.25 °C/min。
相对于其他方法，CT min 测定和热 KD 测定有几个优点。CT min 测定中的 自动计数减少了实验者在仪器上花费的时间，从而增加了花在其他任务上的时间。建造丙烯酸夹克柱的费用为50美元，而购买定制玻璃夹克柱的费用为400美元。对于热 KD 检测，视频录制无需实时直接观察，并且占用了每个样本少量的物理空间。其他协议，如Jürgensen等人9所使用的协议，使用大型水族馆来观察被淹没在单独小瓶中的个体，但这种方法需要训练有素的调查人员快速检查小瓶的移动和大量的设备空间。Rolandi等人13使用 红外传感器检测96孔板中CT最大值 的运动或缺乏运动，而这种热KD测定使用廉价的网络摄像头（+70美元）来检测运动。此摄像机可以检测红外活动监视器可能遗漏的细微运动。
此外，还开发了一组可自定义的脚本，用于在热 KD 检测中快速估计 KDT（补充编码文件 1-3）。这些脚本可用于节省时间，在观看视频之前，在每个视频中获得大致接近的热 KDT，并且这些脚本具有更高的视频质量，可能会自动执行数据录制。提供了三个处理视频的脚本：FirstFrame.py（补充编码文件1），它定义了视频的第一个图像帧;WellDefine.py（补充编码文件2），它定义了第一个图像帧中96个井板的每个单独井;和MotionDetect.py（补充编码文件3），通过计算顺序帧之间的像素密度变化，将视频文件转换为活动信号。程序的唯一输入是视频文件，输出包括汇总统计和每井活动的时间序列数据集（图6）。使用灰度滤镜来降低图像尺寸，高斯低通滤波器可降低图像噪声，使用膨胀形态操作来增加移动对象的边框，从而变换视频帧之间的像素密度差异。在这种情况下，活动定义为顺序帧之间的像素值的绝对差异。然后，热 KDT 可以估计为包含大于零的活动值的最后一帧的索引。例如，在样本数据集的井 g12 中最后记录活动的帧（图 6）刚刚在 2，000 s（33.33 分钟）之后，如平线所示。然后，观察者可以播放数字视频，并快速找到热KDT的井g12与这个时间戳。
通过稍作修改和故障排除，这两种检测都有其他应用，尤其是热 KD 检测。可以修改视频录制设置，以记录静态冷击击时间、冷却昏迷恢复时间或潜在的动态 CT最大值和 CT最小 值。冷昏迷恢复时间是一个人在冷压力29后恢复运动需要的时间。因此，通过此设置，可以通过在 96 井板中诱导冷昏迷，然后使用视频设置记录培养箱中的恢复时间，来测量冷昏迷恢复时间。最后，经过仔细的微调，动态CT最大值 或CT最小 值可以记录在可编程斜坡培养箱中。仔细注意96口井内的温度将是一个问题，因为随着温度的变化，孵化器中温度的轻微变化可能会放大。
在进行 CT 最小值或热 KD 测定时，应考虑几个注意事项。首先，昆虫的质量、年龄、性别、生命阶段、遗传背景和以往的经验可以,影响,6、13、30、316,13的热限。30对于这两种检测，测试对象必须具有动性。其次，每个CT最小装置一次只能检测一组。因此，在比较处理时需要考虑热公差32、33,33等变量。解决这个问题的一个解决方案是同时使用多种仪器对多种治疗条件进行CT最小检测。第三，有些物种可能不适合进行一种或两种测定。例如，有些物种可能不容易在CT分钟测定中攀爬或飞向栖息，或在达到热KDT之前在高温下停止活动，从而难以辨别敲击时间。最后，为了确保在热 KD 测定中进行准确的比较，KDT 标准（步骤 2.2.8）在复制、观察、试验等之间保持一致至关重要。为了适应不同的昆虫种类，可能需要修改其中任何一个测试设备。可能的修改包括使用不同类型的栖息进行CTmin测定，使用孔少、空间更大的细胞培养板（48、24、12或6孔），而不是96孔板，以适应较大的昆虫，或调整用于热KD测定的温度，以确保敲击时间不会太快或太慢。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢艾莉·麦卡比在饲养苍蝇方面提供的援助。这项工作得到了美国农业部国家粮食和农业研究所哈奇项目赠款1010996和国家科学基金会赠款OIA-1826689对N.M.T.的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing - 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
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