Microplot Ontwerp en Plant en Bodem Monster Voorbereiding voor ¹⁵Stikstof Analyse

Summary

Een microplot ontwerp voor ¹⁵N tracer onderzoek wordt beschreven om meerdere in-season plant en bodem bemonstering gebeurtenissen tegemoet te komen. Voor de analyse van 15 N worden bodem- en verwerkingsprocedures voor monsters, met inbegrip van slijp- en weegprotocollen, voor ¹⁵N-analyse naar voren gebracht.

Abstract

Veel stikstof meststof studies evalueren het totale effect van een behandeling op end-of-season metingen, zoals graan opbrengst of cumulatieve N verliezen. Een stabiele isotopenbenadering is noodzakelijk om het lot van kunstmest afkomstig N (FDN) via het bodemgewassysteem te volgen en te kwantificeren. Het doel van dit document is om een klein onderzoek ontwerp gebruik te maken van niet-beperkte ¹⁵N verrijkte microplots voor meerdere bodem en planten bemonstering gebeurtenissen over twee groeiseizoenen te beschrijven en monster verzameling, behandeling en verwerking protocollen voor totaal ¹⁵N analyse. De methoden werden aangetoond met behulp van een gerepliceerde studie van zuid-centraal Minnesota geplant om maïs(Zea mays L.). Elke behandeling bestond uit zes maïsrijen (76 cm rijafstand) van 15,2 m lang met een microplot (2,4 bij 3,8 m) aan één uiteinde. Ureum van kunstmestkwaliteit werd bij het planten toegepast op 135 kg^{N·ha -1,} terwijl de microplot ureum kreeg verrijkt tot 5 atoom % ¹⁵N. Tijdens het groeiseizoen werden meerdere malen bodem- en plantenmonsters genomen, waarbij ervoor werd gezorgd dat kruisbesmetting wordt geminimaliseerd door gebruik te maken van afzonderlijke gereedschappen en tijdens alle procedures niet-verrijkte en verrijkte monsters fysiek worden gescheiden. Bodem- en plantenmonsters werden gedroogd, gemalen om door een 2 mm scherm te gaan en vervolgens met behulp van een rolpotmolen tot een bloemachtige consistentie te vermalen. Tracer studies vereisen extra planning, monster verwerkingstijd en handenarbeid, en maken hogere kosten voor ¹⁵N verrijkte materialen en monsteranalyse dan traditionele N-studies. Echter, met behulp van de massa balans aanpak, tracer studies met meerdere in-season sampling gebeurtenissen kunnen de onderzoeker om FDN verdeling te schatten via de bodem-gewas systeem en schatten onverklaarbare FDN uit het systeem.

Introduction

Kunstmest stikstof (N) gebruik is essentieel in de landbouw om te voldoen aan de voedsel-, vezel-, diervoeders en brandstof eisen van een groeiende wereldbevolking, maar N verliezen van agrarische velden kan een negatieve invloed hebben op de kwaliteit van het milieu. Omdat N ondergaat vele transformaties in de bodem-gewas systeem, een beter begrip van N fietsen, gewas gebruik, en het algemene lot van kunstmest N zijn noodzakelijk om het beheer praktijken die N gebruik efficiëntie te bevorderen en te minimaliseren milieuverliezen te verbeteren. Traditionele N kunstmeststudies richten zich voornamelijk op het effect van een behandeling op eindseizoenmetingen zoals gewasopbrengst, gewas N opname ten opzichte van de toegepaste N-snelheid (schijnbare efficiëntie van het gebruik van meststoffen) en restgrond N. Hoewel deze studies het totale systeem N-inputs, -outputs en efficiëntieverbeteringen kwantificeren, kunnen zij N niet identificeren of kwantificeren in het bodemgewassysteem dat is afgeleid van kunstmestbronnen of de bodem. Een andere aanpak met behulp van stabiele isotopen moet worden gebruikt om het lot van kunstmest afgeleide N (FDN) in het bodemgewassysteem op te sporen en te kwantificeren.

Stikstof heeft twee stabiele isotopen, ¹⁴N en ¹⁵N, die in de natuur voorkomen met een relatief constante verhouding van 272:1 voor ¹⁴N/¹⁵N¹ (concentratie van 0,366 atoom % ¹⁵N of 3600 ppm ¹⁵N^2,3). De toevoeging van ¹⁵N verrijkte meststof verhoogt het totale ¹⁵N-gehalte van het bodemsysteem. Aangezien ¹⁵N verrijkte meststof mengt met niet-verrijkte bodem N, de gemeten verandering van ¹⁴N /¹⁵N verhouding kunnen onderzoekers FDN traceren in het bodemprofiel en in het gewas^3,4. Een massabalans kan worden berekend door het totale bedrag van ¹⁵N-tracer in het systeem en elk van zijn onderdelen²te meten. Omdat ¹⁵N verrijkte meststoffen aanzienlijk duurder zijn dan conventionele meststoffen, worden ¹⁵N verrijkte microplots vaak ingebed in de zuiveringspercelen. Het doel van deze methoden papier is om een kleine plot onderzoeksontwerp met behulp van microplots voor meerdere in-season bodem en plant bemonstering gebeurtenissen voor maïs (Zea mays L.) te beschrijven en protocollen voor de voorbereiding van plant en bodemmonsters voor totaal ¹⁵N-analyse te beschrijven. Deze resultaten kunnen vervolgens worden gebruikt om de efficiëntie van het gebruik van N-meststoffen te schatten en een gedeeltelijke N-begroting te creëren die fdn in de bulkgrond en het gewas verantwoordt.

Protocol

1. Beschrijving van de veldsite

OPMERKING: Bij het uitvoeren van ¹⁵N tracerveldproeven moeten geselecteerde sites variatie minimaliseren als gevolg van bodem, topografie en fysieke kenmerken^5. Kruisbesmetting kan optreden na zijdelingse bodembeweging als gevolg van hellings-, wind- of watertranslocatie of grondbewerking, terwijl de verticale verdeling van bodem N kan worden beïnvloed door ondergrondse waterstroom en tegeldrainage⁶.

1. Beschrijf de proefterrein met inbegrip van beheer uit het verleden (bijvoorbeeld eerdere gewassen en grondbewerking), breedte- en lengtegraad, fysische en chemische eigenschappen van de bodem (bijvoorbeeld bodemtekstanalyse, initiële vruchtbaarheidsomstandigheden, pH en bulkdichtheid).
2. Neem GPS-coördinaten op voor de onderzoekssite en de veldhoeken.
3. Beschrijf het beheer van het groeiseizoen, inclusief ongedierte- en ziektebeheer (herbicide, insecticide of fungicidegebruik), bodemvruchtbaarheidsbeheer (inclusief tarief, bron, plaatsing en toepassingstiming), grondbewerking, irrigatiegebeurtenissen en hoeveelheden en residubeheer.
4. Als gewasgroei en microbe bemiddelde N transformaties worden beïnvloed door bodemvocht, bodemtemperatuur en luchttemperatuur, record klimaat informatie met inbegrip van dagelijkse hoge en lage temperaturen, dagelijkse neerslag, en bodemvocht en temperaturen op verschillende diepten die de bodem bemonstering diepten weerspiegelen.

2. Plotontwerp

1. Plant zes maïsrijen (~ 86.000 planten ha^-1)op 76 cm afstand met een uiteindelijke perceelafmeting van 15,2 m bij 4,6 m.
   1. Bebouw grensgebieden op 1,5 m van elk uiteinde van de lengtedimensie (0-1,5 m, 13,7-15,2 m) en een extra grensoppervlakte van 1,5 m lang (9,8-11,3 m) grenzend aan de bemonsterings- en oogstgebieden (figuur 1).
   2. Wijs rijen 2 en 3 aan als het gebied van de in-season plant en de bodembemonsteringsgebied (1.5-9.8 m) en rijen 4 en 5 als oogstgebied (1.5-9.8 m) voor graanopbrengst.
   3. Stel een microplotgebied (11,3-13,7 m) met afmetingen van 2,4 m bij 3,8 m gecentreerd op de breedteafmeting. Verzamel alle ¹⁵met N verrijkte planten- en bodemmonsters uit dit gebied, waardoor 0,38 m ongesamende rand overblijft op de lengte en breedteafmetingen om randeffecten te minimaliseren (figuur 2).
2. Bepaal de behandeling plot en microplot hoeken met verschillende gekleurde vlaggen.

3. Voorzorgsmaatregelen voor bodem- en plantenmonsters

1. Gebruik speciale apparatuur en verwerkingsruimten voor niet-verrijkte en verrijkte materialen. Verontreiniging van niet-verrijkte materialen (kunstmest, bodem of plant) door verrijkte materialen en vice versa kan de resultaten drastisch beïnvloeden.
2. Verzamel en verwerk ¹⁵N verrijkte bodem- en plantenmonsters in volgorde van laagste tot hoogste ¹⁵N verwachte verrijking om kruisbesmetting te minimaliseren. Zorg ervoor dat werkoppervlakken, handschoenen, gebruiksvoorwerpen en machines tussen elk monster grondig worden gereinigd om kruisbesmetting door monsteroverdracht tot een minimum te beperken.
3. Minimaliseer het voetverkeer in microplots om verontreiniging van niet-verrijkte bemonsteringsgebieden te voorkomen. Draag beschermende schoenbekledingen bij het openen van microplots en verwijder ze bij het verlaten van het microplotgebied.

4. ¹⁵N bereiding en toepassing van verrijkte meststoffen

1. Volgens de door ref. 2 voor meststof ¹⁵N-onderzoek naar het gebruik (F¹⁵NUE) naar voren gebrachte richtsnoeren, verdunt 10 atoom % ¹⁵N verrijkt ureum tot 5 atoom % ¹⁵N verrijkt ureum en lost in 2 L gedeïmiseerd water op om een uniforme verrijking van ureummeststof te garanderen.
   OPMERKING: De vereiste concentratie van ¹⁵N verrijkte meststof is afhankelijk van de doelstellingen van de agronomische studie. Indien de concentratie van met voorraad ¹⁵N verrijkte meststof de eisen van de onderzoeker overschrijdt, kan de concentratie van de voorraadmeststof met vergelijkbare conventionele meststof worden verdund met behulp van de volgende formule³.
   X2 = [(C1/C2) - 1] × X1
   X2 is de massa van de conventionele niet-verrijkte meststof, X1 is de massa van de verklikmeststof, C1 is de isotopenconcentratie [uitgedrukt in atom % overmaat (gemeten atoom % verrijking minus de natuurlijke achtergrondconcentratie verondersteld te zijn 0,3663 atoom %)] van de oorspronkelijke tracermeststof, en C2 is de isotopenconcentratie van het uiteindelijke mengsel. Gezien 100 g verrijkt ureum van 10 10 % zou bijvoorbeeld 92,7 g conventionele niet-verrijkte meststof nodig zijn voor een definitieve isotopenconcentratie van 5 atoom %;
   X2 = {[(10-0,3663)/5] - 1} × 100.
2. Analyseer de oplossing voor ^{de 15}N-concentratie om verrijking te verifiëren. De auteurs maakten gebruik van de analytische diensten van UC Davis Stable Isotope Facility.
   OPMERKING: Reacties van het bodem-plant-microbe regime op toevoegingen van meststoffen kunnen worden beïnvloed door de fysieke vorm van kunstmest. Afhankelijk van de doelstellingen van de studie, kan de ureumoplossing worden toegepast als een vloeistof of uitgedroogd om kristallen te hervormen. De kristallen kunnen worden verdicht tot een taart met behulp van een Carver pers op 10.000 psi, gevolgd door het verpletteren van de taart en screening van de deeltjes op de gewenste grootte³.
3. Breng de ¹⁵N verrijkte ureumoplossingen gelijkmatig aan op de microplots met behulp van een gekalibreerde rugzak CO₂ sproeier(figuur 3A). Als er meerdere N-percentages of verrijkingsniveaus worden gebruikt, u overwegen om aangewezen CO_2-sproeiers voor elk verrijkingsniveau te gebruiken of gebruik een enkele sproeier en pas oplossingen toe van de laagste tot de hoogste verrijking om kruisbesmetting van de behandeling te minimaliseren.
4. Neem ureumhoudende meststoffen op met lichte grondbewerking, handharken of ten minste 0,6 cm irrigatie binnen 24 uur van toepassing om het potentieel van vervluchtigingsverlies te minimaliseren.
5. Tijdens het tweede groeiseizoen wordt geen extra ¹⁵N verrijkte ureummeststof op de microplot aangebracht. Breng conventionele niet-verrijkte ureum aan op de gehele behandeling om een differentiële respons in maïsgroei als gevolg van stikstof te voorkomen.

5. Verwerking van veldmonsters: bovengrondse maïsbiomassa

1. Verzamel in elke bemonsteringsfase een samengesteld monster van zes bovengrondse maïsplanten vanuit het bemonsteringsgebied⁽¹⁵N niet verrijkt) en een samengesteld monster van zes bovengrondse maïsplanten uit de ^{met 15}N verrijkte microplot. Ten minste twee planten moeten elke bemonsterde plant scheiden om te voorkomen dat de groeidynamiek van planten aanzienlijk verandert. De auteurs verzamelden plantenmonsters in de fysiologische ontwikkelingsfasen V8 en R1¹¹ en in fysiologische rijpheid(figuur 2).
2. Volgens de in de stappen 3.1 en 3.2 beschreven principes haken V8 en R1 bovengrondse biomassa (≤5 cm bij ≤5 cm); een tuinafvalversnipperaar is een bevredigende optie. Plaats gehakte biomassa in gelabelde stof of papieren zakken en droog in een geforceerde lucht oven op 60 °C tot constante massa. Nota van het droge biomassagewicht (figuur 3B).
3. Partitie fysiologisch volwassen maïsplanten in stover (alle vegetatieve weefsels met inbegrip van bladeren, kaf, en stengels), graan, en kolf fracties. Hak en droog in een geforceerde luchtoven op 60 °C tot constante massa. Nota van de biomassa droog gewicht.
4. Snijd binnen de microplot alle maïsstengels aan het bodemoppervlak, bind in een bundel, label volgens plot en verwijder uit het veld(figuur 3C). Pas de hoekvlaggen van microplot aan om bijna gelijk te zijn aan het bodemoppervlak om het risico van verwijdering door de combine tijdens de oogst of grondbewerking na de oogst te minimaliseren.
5. Oogst graan uit het oogstgebied en rapporteer de opbrengst met een vochtgehalte van 15,5%¹². Oogst resterende onderzoeksgebieden met een perceel te combineren.
6. Hark niet-verrijkte biomassa uit het microplot gebied. Hak en opnieuw microplot bovengrondse biomassa toe te brengen op de juiste plot(figuur 3D).
7. Neem residu in het bodemoppervlak met grondbewerking die ervoor zorgt dat het transport van bodem- en maïsresten in of uit het microplotgebied tot een minimum wordt beperkt. Vervang alle microplot hoek vlaggen verwijderd als gevolg van grondbewerking.
8. Plant tweedejaars maïs op dezelfde rijen als de eerstejaars maïs.
9. Verzamel tweedejaars bovengrondse maïsbiomassa alleen bij fysiologische rijpheid en proces zoals eerstejaars maïsmonsters zoals beschreven in stap 5.3. Verzamel microplotmonsters uit het midden van het microplotgebied (1,52 m bij 0,76 m) om mogelijke signaalverdunning na grondbewerking te voorkomen (figuur 2). Oogst graan uit het oogstgebied en rapporteer de opbrengst met een vochtgehalte van 15,5%.
10. Volgens de principes van de stappen 3.1 en 3.2, meng en maal grondig 100 tot 200 g gedroogd plantaardig materiaal om door een zeef van 2 mm te gaan. Meng het grondmateriaal grondig en bewaar een ondersteekstuk in een gelabelde muntenvelop voor verdere verwerking.
    OPMERKING: Een Thomas Wiley molen is een bevredigende optie voor plantenweefsel slijpen, terwijl een Perten Laboratory Mill 3610 is een bevredigende optie voor het malen van graan.
    LET OP: Mensen slijpen plant monsters moeten dragen oorbescherming en worden beschermd tegen het inademen van stof door het dragen van een Nationaal Instituut voor Veiligheid en Gezondheid goedgekeurd N95 Partikel filteren Facepiece Respirator.

6. Verwerking van veldmonsters: bodem

1. Verzamel eerstejaars bodemmonsters 8 dagen na ¹⁵N verrijkte meststof toepassing, V8, R1, en post-oogst voor de grondbewerking. Verzamel tweedejaars bodemmonsters bij de pre-plant en na de oogst. Vanwege logistieke bemonsteringsbeperkingen verzamelden de auteurs bodemmonsters in het seizoen bij 0- tot 15-, 15- tot 30-, en 30- tot 60-cm diepten, bodemmonsters na de oogst op 0- tot 15-, 15- tot 30-, 30- tot 60-, en 60- tot 90-cm diepte, en tweedejaars voorplant grondmonsters op 0- tot 30-, 30- tot 60-, 60- tot 120- cm diepte.
   OPMERKING: Als een bodemsonde niet in staat is om een bodemkern te verzamelen tot de diepste gewenste diepte als een enkele kern, verzamel diepere diepte kernen uit dezelfde boorgaten als de bovenste diepten ontdoen van de bovenste 1-cm van de bodem om te voorkomen dat verontreiniging van de bodem vallen uit de bovenste diepten.
   1. Verzamel een vier-core (1,8-cm diameter) samengestelde bodemmonster uit de niet-verrijkte bemonstering gebied op V8 en R1 met behulp van een hand sonde. Verzamel een kern in de maïsrij en drie kernen tussen de maïsrijen.
   2. Verzamel een composietmonster met een diameter van twee kernen (5 cm) uit het niet-verrijkte bemonsteringsgebied voor de installatie en na de oogst met behulp van een hydraulische sonde.
   3. Verzamel een 15-core (1,8-cm diameter) samengesteld bodemmonster uit het microplot gebied 8 dagen na ¹⁵N verrijkte meststof toepassing, V8, en R1 met behulp van een hand sonde. Verzamel drie tot vier kernen in de maïsrij en 11 tot 12 kernen tussen de maïsrijen.
      LET OP: Bodems zijn zeer heterogeen. Het grotere aantal kernen verzameld vanuit het verrijkte microplot biedt een betere schatting van de werkelijke ¹⁵N verrijking van bodem N¹³.
   4. Verzamel een drie-core (5-cm diameter) composiet bodemmonster van de microplot gebied op pre-plant en post-oogst met behulp van een hydraulische sonde.
   5. Homogeniseer elk samengesteld bodemmonster in een emmer en plaats het in een vooraf gelabelde papieren zak.
2. Droge bodemmonsters bij 35 °C in een geforceerde luchtoven tot constante massa. Maal elk monster om door een zeef van 2 mm te gaan. Een mechanische bodemslijper is bevredigend als deze tussen elk monster grondig kan worden gereinigd.
   OPMERKING: Bodemmonsters kunnen worden gedroogd door monsters op trays in een dunne laag te verspreiden. Trays moeten zich in een gebied bevinden dat vrij is van verontreiniging door bronnen buiten N. Niet-verrijkte en verrijkte monsters moeten fysiek worden gescheiden om kruisbesmetting te voorkomen.
   LET OP: Mensen die bodemmonsters slijpen, moeten oorbescherming dragen en beschermd zijn tegen het inademen van stof door het dragen van een nationaal instituut voor veiligheid en gezondheid op het werk goedgekeurd n95 partikelfilter gezichtsbedekkende ademhaling.

7. Laboratoriummonsterverwerking: gemalen bodem- en plantenmonsters

1. Droge grondmonsters (2 mm) 's nachts in een oven bij 60 °C.
2. Volgens de in stap 3 beschreven principes, maal je gedroogde plantenmonsters of bodemmateriaal tot een fijne, bloemachtige consistentie. Een rolpot molen is een bevredigende optie.
   OPMERKING: De pottenmolen van de auteurs is een op maat gemaakt transportbandsysteem dat 54 rolpotten tegelijk kan verwerken.
   1. Vul elke rolpot (250 mL borosilicaat glazen pot met een schroef-bovenste deksel) met 10 tot 20 g grondmonster en zeven roestvrijstalen staven (8,5 cm lang, 0,7 cm diameter).
   2. Rol rolpotten op 0,4 x g voor 6-24 uur of totdat monsters een fijne, bloemachtige consistentie hebben.
   3. Breng het fijn gemalen materiaal over in een schone, gelabelde 20 mL scintillatie flacon.
   4. Tussen elk monster, was rolpotten, roestvrijstalen staven, en deksels met zeep en water om eventuele residu te verwijderen.
      1. Dompel rolpotten en deksels onder in een 5% HCl zuurbad (bereid van 36-38% geconcentreerde voorraad) 's nachts¹⁴.
         LET OP: Zoutzuur is corrosief. Het kan leiden tot ernstige brandwonden, oogletsel, en is schadelijk bij inademing. Draag altijd beschermende kleding, handschoenen en oog- en gezichtsbescherming. Flush contacteerde weefsel grondig met water. Gebruik altijd een secundaire container bij het transport van zuren. Voeg altijd zuur toe aan water omdat deze reactie exotherm is. Neutraliseer onmiddellijk zure morsen met zuiveringszout.
         LET OP: Een groot zuurbad kan worden bereid als 100 L van 5% HCl in een 208 L plastic container. Bereid verschillende kleinere volumes in een rookkap en breng de oplossingen vervolgens over op de plastic container. Vervang de oplossing om de drie maanden.
      2. Triple rinse rolpotten en deksels met gedeïsized water en lucht droog.
      3. Dompel roestvrijstalen staven onder in een NaOH-bad van 0,05 M (bereid door 2 g NaOH op te lossen in 1 L gedeïsized water) 's nachts¹⁴. Bereid elke dag een nieuw NaOH-bad van 0,05 M voor.
         LET OP: Natriumhydroxide kan ernstige brandwonden en oogletsel veroorzaken. Draag altijd beschermende kleding en oogbescherming. Verwijder onmiddellijk verontreinigde kleding en spoel huid of ogen enkele minuten af met water.
      4. Spoel de staven onder stromend warm leidingwater gedurende 5 minuten. Decanteren en drievoudige spoel de staven met gedeïsized water. Laat de staven drogen op een met papieren handdoek omzoomde lade.

8. Weeg bodemmonsters en bodemmonsters af voor totale N- en ¹⁵N-analyse

1. Analyseer enkele representatieve planten- en bodemmonsters op het totale N-gehalte (bijv. verbrandingsanalyse¹⁵). Bereken de monstermassa die voldoende N-inhoud biedt voor ¹⁵N-analyse volgens de specificaties van de analysator.
   OPMERKING: De auteurs maakten gebruik van de analytische diensten van UC Davis Stable Isotope Facility. Verrijkte monstergewichten werden geoptimaliseerd voor 20 μg N met een maximum van 100 μg N.
2. Organiseer like-samples van laagste tot hoogste verwachte ¹⁵N verrijking. Dupliceer elke achtste tot twaalfde monster in elke run om de precisie van het monster te controleren. Neem ten minste één controlemonster per run¹⁶op.
3. Label een schone 96-well plaat en voorzien deksel met individuele goed verdamping ringen. Snijd een schone indexkaart om net in het deksel te passen om monsterbeweging tussen putten tijdens het transport te voorkomen.
4. Het dragen van nitril handschoenen, reinig de microschaal, werkoppervlakken, spatel, en tangen met laboratoriumdoekjes en ethanol. Plaats schoongemaakte gebruiksvoorwerpen op een Kimwipe op de labbank.
   OPMERKING: Niet-verrijkte en verrijkte monsters moeten worden verwerkt met behulp van afzonderlijke weegschalen en gebruiksvoorwerpen om kruisbesmetting te voorkomen.
5. Gebruik tangen om een voorgevormde 5 mm x 9 mm blikcapsule op een schoon werkoppervlak te plaatsen, zoals een roestvrij stalen blok met een put van 5 mm x 8 mm. Tik de capsule voorzichtig in de put om de cilindrische vorm te hervormen en de onderkant van de capsule indien nodig plat te maken.
   OPMERKING: Omdat monstermassa's zeer klein zullen zijn, is het risico op monsterbesmetting groot. Raak de capsules nooit aan met handschoenen. Gooi de capsule als het raakt een ander oppervlak dan de tangen, schoon werkoppervlak, schaal wegen pan, of 96-well plaat.
6. Gebruik tangen om de bovenste 1 mm van de capsule voorzichtig uit te flareen om manipulatie te vergemakkelijken. Om schade aan de weegschaal te voorkomen bij het teeren van het gewicht van de capsule, zweeft en laat u de capsule 1 tot 2 mm boven de microschaal weegpan los. Tare de capsule. Gebruik tangen om de capsule terug te brengen naar het schone werkoppervlak.
7. Gebruik een spatel om zorgvuldig de vereiste massa van fijn gemalen monstermateriaal aan de capsule toe te voegen. Vermijd morsen van monstermateriaal op het buitenoppervlak van de capsule of het werkoppervlak.
8. Met behulp van tangen, langzaam krimpen de bovenste derde van de capsule en vouw over te verzegelen. Met behulp van tangen, blijven vouwen en comprimeren van de capsule in een bolvormige vorm waarbij ervoor wordt gezorgd niet te punctie of scheur het tin.
   OPMERKING: Voor monsters met een laag N-gehalte kunnen monstervolumes nodig zijn die de capaciteit van de 5x9 mm-capsule overschrijden. Grotere capsules (bijvoorbeeld 9 mm x 10 mm) mogen in deze gevallen worden gebruikt.
9. Gebruik tangen om de ingepakte capsule meerdere keren van een hoogte van 1 cm op een schoon, donker oppervlak of spiegel te laten vallen om te controleren op lekken. Als er geen stof verschijnt, weegt u het monster met dezelfde techniek als beschreven in stap 8.6. Neem het monstergewicht op. Plaats de capsule in een 96-put plaat en neem de put plaatsing.
   1. Als er stof op het donkere oppervlak verschijnt, registreert u het gewicht van het monster. Wikkel het monster in een tweede tinnen capsule, controleer opnieuw op lekken en plaats het in een schone plaat met 96 armen.
      LET OP: Als de ingepakte capsule te groot is om in een 96-putplaat te passen, gebruik dan een plaat van 24 of 48 goed.
10. Tussen de monsters, reinig elk van de gebruiksvoorwerpen en oppervlakken met ethanol en laboratorium doekjes met speciale aandacht voor de spatel en tang randen.
11. Zet het deksel vast aan de 96-put plaat met tape en bewaar in een desiccator.

9. Berekeningen

1. Bereken de massa van N (kg∙ha^-1)in de planten- of bodemmonsters met behulp van de volgende vergelijkingen.
   
   
2. Bereken de meststof N-fractie (N_f), meststof afgeleid N (FDN) en bodem afgeleide N (SDN) voor planten- en bodemmonsters¹⁷.
   
   wanneer A het atoom % ¹⁵N verrijking is.
3. 
   
4. Bereken meststof ¹⁵N gebruiksefficiëntie¹⁷.
   

Representative Results

De resultaten gepresenteerd in deze paper komen van een veld site opgericht in 2015 aan de Universiteit van Minnesota Southern Outreach and Research Center gelegen in de buurt van Waseca, MN. De site werd beheerd als een maïs-soja [Glycine max (L.) Merr] rotatie voorafgaand aan 2015, maar werd beheerd als een maïs-maïs rotatie tijdens de 2015 en 2016 groeiseizoenen. De grond was een Nicollet klei leem (fijn-leem, gemengd, superactief, mesic Aquic Hapludolls)-Webster klei leem (fijn-leem, gemengd, superactief, mesic Typic Endoaquolls) complex. Bodemvruchtbaarheid werd beheerd volgens de universitaire richtlijnen, met uitzondering van N¹⁸. Verschillende N-mestbehandelingen werden gerangschikt in een gerandomiseerd compleet blokontwerp met vier replicaties, maar alleen het 135 kg N·ha^-1-tarief dat als ureum bij het planten wordt toegepast, wordt in dit document gepresenteerd. De bulkdichtheid van de bodem werd gemeten in het midden van 0- tot 15-, 15- tot 30-, 30- tot 60-, 60- tot 90-, en 60- tot 120-cm dieptelagen van twee 5-cm diepe monsters per replicatie met behulp van de intacte kernmethode¹⁹. Bulkdichtheid werd gemiddeld binnen de diepte over replicaties en verondersteld constant te zijn over het veld. Plot setup en plant en bodem monsters werden verzameld en verwerkt zoals beschreven in het protocol sectie.

Het totaal (FDN + SDN) bovengrondse biomassa N steeg met elke opeenvolgende bemonsteringsgebeurtenis over het eerste groeiseizoen (figuur 4). De concentratie van de afgeleide N-meststof was eerder in het groeiseizoen het grootst, goed voor 44 ± 4% (gemiddelde ± standaardfout) van de totale bovengrondse biomassa N bij V8 en daalde met elke opeenvolgende bemonsteringsperiode (figuur 4A). SDN was echter consequent de grootste fractie van bovengrondse biomassa N die het belang van bodem N-aanbod voor een optimale maïsgroei illustreerde. Bij fysiologische rijpheid in het eerste jaar was 27 ± 1% van de bovengrondse biomassa N afkomstig van FDN met vergelijkbare verhoudingen in graan-, stover- en kolffracties(figuur 4B). Bij fysiologische rijpheid in het tweede jaar werd slechts 2 ± 0,1% van de eerstejaars FDN teruggewonnen in de bovengrondse biomassa met 1,6 ± 0,2 kg fdn^{ha -1} uit het eerste jaar die in het graan werd uitgevoerd (figuur 4A).

Het FDN-budget voor bodemgewas is nuttig voor het kwantificeren van FDN-fietsen binnen het systeem in de loop van de tijd. Binnen 8 d van de toepassing van meststoffen, de meerderheid van FDN was in de top 15 cm van het bodemprofiel, zoals verwacht (Figuur 5). 22,2 ± 4,4 kg N ha^-1 was echter al in de diepere diepten bewogen, terwijl 4 ± 10% van de FDN vermist was. Niet-verantwoorde FDN wordt waarschijnlijk voornamelijk gedreven door N-verliesmechanismen, waaronder uitloging, denitrificatie en vervluchtiging die FDN onder de diepten van de bodembemonstering verplaatsen of de FDN volledig uit het systeem verwijderen. Bij V8 en R1 steeg de niet-verantwoorde FDN tot 60,4 ± 4,7 kg N ha^-1 gemiddeld, terwijl bodem N (0-15 cm) gemiddeld 31,6 ± 6,8 kg N^{ha -1} bedroeg. De snelle groei van Corn en de hoge N-vraag van V8 naar R1 resulteerden in een toename van 19,0 ± 4,4 kg FDN ha^-1 in bovengrondse biomassa van de centrale die de 17,7 ± 5,2 kg FDN ha^-1 reductie van de bodemdiepten van 15 tot 60 cm weerspiegelt. Bodemtemperatuur en vochtcondities tussen deze maïsontwikkelingsstadia hebben de neiging om microbiële groei te bevorderen, wat resulteert in een snelle omzet van organische residuen en hergebruik van gemineraliseerde N. Deze resultaten suggereren dat maïswortels ontgonnen anorganische FDN van de 15- tot 60-cm diepte, terwijl FDN in de 0- tot 15-cm diepte werd voornamelijk gefietst tussen de bodem organische stof en microbiële fracties. Aanvullende isotopenanalyse van bodemonorganische en organische N-pools is nodig om deze hypothese te valideren en meer detail en inzicht te geven in fdn-fietsdynamiek¹⁰. In het boekjaar 1 na de oogst was 59 ± 2% van de oorspronkelijke FDN vermist, terwijl 18,1 ± 3,9 kg FDN ha^-1 in de bovenste 30 cm van de bodem stond (figuur 5) en 22,1 ± 2,3 kg FDN ha^-1 werd uitgevoerd in de korrel (figuur 4B). Meststof ¹⁵N gebruik efficiëntie was 24% (Vergelijking 7) en is aan de lage kant van de vaak gerapporteerde F¹⁵NUE maatregelen (25-45%) gerapporteerd door andere studies²⁰. Hoewel de apparatuur tussen elk monster grondig werd gereinigd, zouden de lagere F¹⁵NUE-maatregelen van de studie een artefact van verrijkte monsterverdunning kunnen zijn door verrijkte monsters te verwerken in volgorde van laagste tot hoogste verwachte verrijking. De hoeveelheid FDN in de top 30 cm verdubbelde (36,0 ± 5,2 kg FDN ha^-1) van post-oogst jaar 1 tot pre-plant jaar 2 als gevolg van gedeeltelijke residupepebrapeval sinds de vorige herfst, maar per post-oogst jaar 2 slechts 17,3 ± 3,3 kg FDN ha^-1 werd nog steeds gevonden in het bodem-maïssysteem (Figuur 5). Uit deze studie blijkt dat tegen het einde van het eerste en het tweede jaar slechts 41 en 29%, respectievelijk van eerstejaars FDN, in het bodem-maïssysteem (met inbegrip van FDN uitgevoerd in het graan) werd verantwoord, terwijl de rest ofwel verloren ging aan het milieu of onder de bodembemonsteringsdiepte van 90 cm werd uitgeloogd.

Er kunnen valse resultaten worden verkregen wanneer monsters kruisbesmettingen hebben die de berekeningen van N_f,FDN en SDN beïnvloeden. Stel dat een met ¹⁵N verrijkt plantenmonster met een werkelijke verrijking van 3.000 atoom % ¹⁵N verontreinigd is met niet-verrijkt materiaal dat de concentratie ¹⁵N verdunt tot 2.500 atoom % ¹⁵N. Verder, ervan uit te nemen dat Total N_Plant 100 kg N ha^-1bedraagt, bedroeg de verrijking van de meststof 5.000 en het atoom % ^{15 15}N verrijking van het niet-verrijkte plantenmonster 0,366. Het met ¹⁵N verrijkte plantenmonster N_f zou worden teruggebracht van 0,568 (werkelijk) tot 0,461 (besmet monster) waarbij het werkelijke FDN met 10,7 kg N ha^-1wordt onderschat . Overschattingen van FDN kunnen optreden wanneer monsters met een lage ¹⁵N-verrijking besmet zijn met extra ¹⁵N. Daarom moet in alle stappen van monsterverzameling en -verwerking uiterste zorg worden genomen om monsterverontreiniging tot een minimum te beperken, maar vooral wanneer de monstermassa's worden verminderd (bijvoorbeeld slijp- en weegprocedures).

Figuur 1: Plotontwerp voor het behandelplot en microplot. De figuur illustreert de afmetingen en relatieve plaatsingen van de grensgebieden, het niet-verrijkte bemonsteringsgebied, het oogstgebied en het microplotgebied binnen het zuiveringsperceel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Microplot plant en bodem bemonstering diagram. De figuur illustreert de relatieve plant- en bodembemonsteringsposities in elke bemonsteringsfase die het veranderen van maïs N-opnamepatronen van later bemonsterde maïsplanten voorkomt. Bemonsteringsgebeurtenissen vonden plaats 8 dagen na de toepassing van ¹⁵N verrijkte meststoffen, in de fysiologische ontwikkelingsstadia V8 en R1, in fysiologische rijpheid in het jaar van ¹⁵N verrijkte meststoffentoepassing(PMY1) en het volgende jaar(PMY2), en voorafgaand aan het planten van het tweede jaar(PPY2). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Chronologische weergave van microplotmanagement. (A) Los ¹⁵met verrijkte ureum op in 2 L gedeïmplanteerd water en spuit bij het planten op de microplot. (B) Verzamel en hak een samengesteld monster van zes bovengrondse maïsplanten uit het bemonsteringsgebied⁽¹⁵N niet verrijkt) en een zes-bovengronds maïsplantcomposietmonster van de ¹⁵N verrijkte microplot op de vooraf bepaalde bemonsteringstijden. (C) Na de monsterverzameling bij fysiologische rijpheid, verwijder alle resterende bovengrondse biomassa uit het microplot. (D) Na de oogst, hark niet-verrijkte bovengrondse maïs biomassa uit het microplot gebied. Chip en opnieuw de microplot maïs bovengrondse biomassa op het microplot gebied. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Voorbeeld van bovengrondse biomassa N verdeeld in kunstmest afgeleide N (FDN) en bodem afgeleide N (SDN) fracties. Totale bovengrondse biomassa N werd gescheiden in de afzonderlijke bronnen van FDN (vaste kleur) en SDN (gehashte kleur) in (A) en (B). Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. AA) Bovengrondse biomassa N werd gemeten in de v8- en R1-maïsfysiologische ontwikkelingsstadia en in fysiologische rijpheid in het jaar van ¹⁵N -toepassing van meststoffen(PMY1) en het jaar daarop ¹⁵N -toepassing van meststoffen (PMY2). De waarde boven elke kolom vertegenwoordigt het percentage van het totaal aantal N dat FDN was. (B) Bovengrondse biomassa N gemeten op PMY1 en PMY2 wordt weergegeven in de afzonderlijke delen van kolf (alleen jaar 1), stover (stengel en bladeren; omvat kolf voor PMY2), en graan voor FDN en SDN. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Voorbeeld van de bodem-maïs meststof afgeleid N (FDN) begroting. De massa van FDN teruggewonnen in bovengrondse (Abvgd) maïs biomassa en op verschillende bodem bemonstering diepten wordt gemeld voor zes bemonstering gebeurtenissen over twee groeiseizoenen. Bemonsteringsgebeurtenissen vonden plaats 8 dagen na de toepassing van ¹⁵N verrijkte meststoffen(PA),in de fysiologische ontwikkelingsstadia V8 en R1, in fysiologische rijpheid in het jaar van ¹⁵N verrijkte meststoffentoepassing(PMY1) en het volgende jaar(PMY2), en voorafgaand aan het planten van het tweede jaar(PPY2). Het verschil tussen de toegepaste meststofsnelheid (135 kg N ha^-1) en de massa FDN die in de bodem-maïsgedeelten wordt teruggewonnen, is de niet-verantwoorde FDN-fractie. De totale massa van FDN voor PPY2 en PMY2 was 113 kg FDN ha^-1 omdat 22 kg FDN ha^-1 werd uitgevoerd uit de bodem-maïs systeem als eerste jaar graan. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Stabiel isotopenonderzoek is een nuttig instrument voor het volgen en kwantificeren van FDN via het bodemgewassysteem. Er zijn echter drie belangrijke veronderstellingen in verband met N tracer studies die, indien geschonden conclusies uit het gebruik van deze methode ongeldig kan maken. Ze zijn 1) de tracer is uniform verdeeld over het systeem, 2) processen in het kader van de studie optreden op dezelfde tarieven, en 3) N het verlaten van de ¹⁵N verrijkte pool keert niet terug³. Omdat deze studie geïnteresseerd is in de verdeling van het totale FDN over het bodemgewassysteem, zijn de aannames 2 en 3 minimaal zorgwekkend²¹.

De hoge kosten van ¹⁵N verrijkt materiaal beperken over het algemeen de grootte van ¹⁵N tracerstudies. Daarom moet de onderzoeker, voordat hij een N-tracer-studie start, zorgvuldig de doelstellingen van het onderzoeksproject plannen, rekening houdend met: het aantal steekproeven, de duur van de studie (dagen tot jaren), het toepassingspercentage van de N-meststof en de verrijkingsconcentratie van ¹⁵N die nodig is om verschillen met natuurlijke overvloed te meten (0,366 atoom %) na ¹⁵N verrijkte meststofverdunning door bulkgrond². Veelgebruikte ¹⁵N verrijkingsniveaus en toepassingspercentages worden gerapporteerd voor verschillende soorten agronomisch onderzoek in Ref. 2. Na het bepalen van de onderzoeksdoelstellingen moet het microplot voldoende groot zijn om de bodem- en plantenbemonstering aan te passen en randeffecten te voorkomen. Het in dit protocol beschreven plotontwerp maakt gebruik van een niet-beperkt perceel dat vereist dat niet-bemonsterde grensgebieden worden gebruikt⁶. De ¹⁵N-concentratie in grensgebieden wordt verdund door massastroom over de microplotgrens en N-opname van buiten de microplot door laterale maïswortels die in rijen 1 en 6 groeien. Besloten percelen, waar fysieke barrières in de bodem worden gedreven, vereisen geen grensgebieden, maar vereisen wel extra werk tijdens de inrichting van microplot en kunnen routinematige veldoperaties beperken⁶. Referenties 3, 6, 22-25 bieden aanvullende richtlijnen voor het selecteren van microplotmaten, randbreedtes en wanneer beperkte of niet-beperkte percelen het meest geschikt zijn.

Het plant- en bodembemonsteringsschema van deze studie is ontworpen om meerdere bemonsteringsgebeurtenissen over twee opeenvolgende groeiseizoenen mogelijk te maken. In het begin van het seizoen worden planten- en bodemmonsters genomen in de buurt van de buitenranden van de microplot. Elke opeenvolgende bemonsteringsgebeurtenis komt dichter bij het midden van de microplot om bemonstering eerder bemonsterde gebieden te voorkomen. Ten minste twee maïsplanten scheiden elke bemonsterde plant om veranderingen in maïs fysiologische ontwikkeling te minimaliseren. Een uitdaging met de bodembemonsteringstechniek van deze studie is dat de bodemkernbemonsteringsmethode de heterogene verdeling van ¹⁵N in het bodemprofiel³niet nauwkeurig kan onderscheppen. De ruimtelijke variabiliteit van het totale bodemntal N is hoog met een geschatte variatiecoëfficiënt van 15%³. Volledige uitgraving van microplot zou de nauwkeurigheid van ¹⁵N kwantificering verbeteren, maar vereist verwerking van aanzienlijke hoeveelheden grond en beperkt de bemonstering tot één gebeurtenis³ die niet in overeenstemming is met de doelstellingen van deze studie. Het onderverdelen van de microplot in kleinere bemonsteringseenheden maakt meerdere graafgebeurtenissen mogelijk, maar kan de vereiste microplotgrootte vergroten om ervoor te zorgen dat niet-bemonsterde eenheden niet worden beïnvloed door wijzigingen in de gewaskap en de bodemwaterdynamiek. Ondanks de potentiële vermindering van de nauwkeurigheid gebruiken veel studies de bodemkerntechniek voor microplots ≥1 m^{29,22,26,27,28}. De nauwkeurigheid van de monsters kan worden verhoogd door het aantal verzamelde en samengestelde bodemkernen per microplot te verhogen met behulp van de volgende formule^13:

n = (Z²)(CV²)/(d²)

wanneer n het aantal bodemkernen is, is Z de gestandaardiseerde normale variantie voor het overeenkomstige alfaniveau (1,96 voor 0,05 en 1,65 voor 0,10), is CV de variatiecoëfficiënt en d is de foutmarge in het complotgedien (als decimaal). Op basis van deze formule verwachten de auteurs dat 15 kernen per microplot het totaal aantal N op 95% van de percelen(n = 15) zouden schatten; Z = 1,96; CV = 15%; d = 0,076). Referentie 25 gebruikte een vergelijkbaar aantal kernen, maar verdeelde het microplot in 32 bemonsteringseenheden die bij elke bemonsteringsgebeurtenis bedrijfs- en bodemmonsters van vier eenheden verzamelen.

Anderen hebben aangetoond dat de microplot gegevens kunnen worden geëxtrapoleerd naar het hele perceel²⁹. Om deze veronderstelling echter geldig te laten zijn, moeten het behandelingsperceel en de microplot op dezelfde wijze worden beheerd. Indien mogelijk moet meststof N worden toegepast in dezelfde chemische en fysische vormen (bijvoorbeeld ureum opgelost in water) omdat deze eigenschappen van invloed zijn op de dynamiek tussen de bemesting en de bodem, met inbegrip van N-verliesmechanismen, immobilisatie en beschikbaarheid voor bodemmicroben en -installaties³.

De in dit protocol beschreven rolpotslijpmethode is in staat grote hoeveelheden planten- en bodemmonsters te verpulveren, ideaal om een representatief, gehomogeniseerd monster te garanderen. Echter, de techniek vereist aanzienlijke handmatige arbeid en tijd om te laden, lossen, rollen, en schoon de rol potten. De monsterverwerking wordt beperkt door het beschikbare aantal rolpotten, de capaciteit van de transportbandeenheid en de grootte van het zuurbad. Commerciële slijpkrullen kunnen een alternatief zijn voor rolpotten, maar kunnen het volume van verwerkte planten- en bodemmonsters beperken. In het laboratorium gemaakte slijpbladeren voor eenmalig gebruik kunnen worden gebouwd die mogelijk zowel dienen als slijp- als monsteropslagvat. De belangrijkste overweging van een van deze slijpmethoden is het minimaliseren van kruisbesmetting tussen monsters.

Ten slotte, omdat ¹⁵N verrijkt kunstmestmateriaal duur is, kunnen ¹⁵N verrijkte bovengrondse biomassa en bodemmonsters worden bewaard en gehomogeniseerd voor gebruik in toekomstige studies. Deze producten kunnen vooral nuttig zijn bij het onderzoeken van residuontleding, mineralisatiepotentieel of andere voedingsfietsprocessen²¹.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 mL scintillation vial	ANY; Fisher Scientific is one example	0334172C
250 mL borosilicate glass bottle	QORPAK	264047
48-well plate	EA Consumables	E2063
96-well plate	EA Consumables	E2079
Cloth parts bag (30x50 cm)	ANY	NA	For corn ears
CO2 Backpack Sprayer	ANY; Bellspray Inc is one example	Model T
Coin envelop (6.4x10.8 cm)	ANY; ULINE is one example	S-6285	For 2-mm ground plant samples
Corn chipper	ANY; DR Chipper Shredder is one example	SKU:CS23030BMN0	For chipping corn biomass
Corn seed	ANY	NA	Hybrid appropriate to the region
Disposable shoe cover	ANY; Boardwalk is one example	BWK00031L
Ethanol 200 Proof	ANY; Decon Laboratories Inc. is one example	2701TP
Fabric bags with drawstring (90x60 cm)	ANY	NA	For plant sample collection
Fertilizer Urea (46-0-0)	ANY	NA	~0.366 atom % 15N
Hand rake	ANY; Fastenal Company is one example	5098-63-107
Hand sickle	ANY; Home Depot is one example	NJP150	For plant sample collection
Hand-held soil probe	ANY; AMS is one example	401.01
Hydraulic soil probe	ANY; Giddings is one example	GSPS
Hydrochloric acid, 12N	Ricca Chemical	R37800001A
Jar mill	ANY; Cole-Parmer is one example	SI-04172-50
Laboratory Mill	Perten	3610	For grinding grain
Microbalance accurate to four decimal places	ANY; Mettler Toledo is one example	XPR2
N95 Particulate Filtering Facepiece Respirator	ANY, ULINE is one example	S-9632
Neoprene or butyl rubber gloves	ANY	NA	For working in HCl acid bath
Paper hardware bags (13.3x8.7x27.8 cm)	ANY; ULINE is one example	S-8530	For soil samples and corn grain
Plant grinder	ANY; Thomas Wiley Model 4 Mill is one example	1188Y47-TS	For grinding chipped corn biomass to 2-mm particles
Plastic tags	ULINE	S-5544Y-PW	For labeling fabric bags and microplot stalk bundles
Sodium hydroxide pellets, ACS	Spectrum Chemical	SPCM-S1295-07
Soil grinder	ANY; AGVISE stainless steel grinder with motor is one example	NA	For grinding soil to pass through a 2-mm sieve
Tin capsule 5x9 mm	Costech Analytical Technologies Inc.	041061
Tin capsule 9x10 mm	Costech Analytical Technologies Inc.	041073
Urea (46-0-0)	MilliporeSigma	490970	10 atom % 15N