Summary
En mikroplot design för 15N spårämne forskning beskrivs för att rymma flera i säsong växt och jord provtagning händelser. Insamlings- och bearbetningsförfaranden för jord- och växtprov, inklusive slip- och vägningsprotokoll, för 15N-analys läggs fram.
Abstract
Många studier av kvävegödselmedel utvärderar den totala effekten av en behandling på mätningar i slutet av säsongen såsom spannmålsavkastning eller kumulativa N-förluster. En stabil isotopmetod är nödvändig för att följa och kvantifiera ödet för gödselmedel som härrör N (FDN) genom jordgrödningssystemet. Syftet med detta dokument är att beskriva en liten tomt forskning design utnyttja icke-begränsade 15N berikade mikroploter för flera jord och växt provtagning händelser under två växtsäsonger och ge prov insamling, hantering och bearbetning protokoll för totalt 15N analys. Metoderna visades med hjälp av en replikerad studie från sydcentrala Minnesota planteras till majs (Zea mays L.). Varje behandling bestod av sex majsrader (76 cm radavstånd) 15,2 m långa med en mikroplot (2,4 m med 3,8 m) inbäddade i ena änden. Urea av gödselmedel av gödningsmedel tillämpades på 135 kg N∙ha-1 vid plantering, medan mikroploten fick urea berikad till 5 atom % 15N. Jord- och växtprover togs flera gånger under hela växtsäsongen, var noga med att minimera korskontaminering genom att använda separata verktyg och fysiskt separera oberikade och berikade prover under alla förfaranden. Jord och växt prover torkades, marken för att passera genom en 2 mm skärm, och sedan marken till en mjöl-liknande konsistens med hjälp av en rulle burk kvarn. Tracer studier kräver ytterligare planering, prov bearbetningstid och manuellt arbete, och medför högre kostnader för 15N berikade material och provanalys än traditionella N studier. Med hjälp av massbalansmetoden gör dock spårämnesstudier med flera provtagningshändelser under säsong möjligt för forskaren att uppskatta FDN-fördelningen genom markgrödsystemet och uppskatta oerknad för FDN från systemet.
Introduction
Gödselmedel kväve (N) användning är viktigt i jordbruket för att möta livsmedel, fiber, foder och bränsle krav på en växande global befolkning, men N förluster från jordbruksområden kan negativt påverka miljökvaliteten. Eftersom N genomgår många omvandlingar i marken-gröda systemet, en bättre förståelse av N cykling, gröda utnyttjande, och den totala öde gödsel N är nödvändiga för att förbättra förvaltningsmetoder som främjar N användningseffektivitet och minimera miljöförluster. Traditionella N gödselmedel studier fokuserar främst på effekten av en behandling på slutet av säsongen mätningar såsom skörd, gröda N upptag i förhållande till N-takt tillämpas (uppenbara gödselmedel användningseffektivitet), och resterande jord N. Även om dessa studier kvantifierar det övergripande systemet N-insatsvaror, produktioner och effektivitetsvinster, kan de inte identifiera eller kvantifiera N i jordgrödsystemet som härrör från gödselkällor eller jorden. En annan metod med hjälp av stabila isotoper måste användas för att spåra och kvantifiera ödet för gödselmedel som härrör från N (FDN) i jordgrödningssystemet.
Kväve har två stabila isotoper, 14N och 15N, som förekommer i naturen vid ett relativt konstant förhållande på 272:1 för 14N/15N1 (koncentration av 0,366 atom % 15N eller 3600 ppm 15N2,,3). Tillsatsen av 15N berikade gödselmedel ökar den totala 15N-halten i marksystemet. Som 15N berikade gödselmedel blandas med oförtjänt jord N, den uppmätta förändringen av 14N /15N förhållandet tillåter forskare att spåra FDN i jordprofilen och in i grödan3,4. En massbalans kan beräknas genom att mäta den totala mängden 15N spårämne i systemet och var och en av dess delar2. Eftersom 15N berikade gödselmedel är betydligt dyrare än konventionella gödselmedel, 15N berikade mikroplots är ofta inbäddade i behandling tomter. Syftet med denna metod papper är att beskriva en liten tomt forskning design utnyttja mikroplots för flera under säsongen jord och växt provtagning händelser förmajs (Zea mays L.) och att presentera protokoll för att förbereda växt-och jordprover för totalt 15N analys. Dessa resultat kan sedan användas för att uppskatta N gödselmedel användningseffektivitet och skapa en partiell N budget redovisning för FDN i bulk jord och grödan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beskrivning av fältplats
Obs: När du utför 15N spårfältsförsök bör utvalda platser minimera variationen på grund av jord, topografi och fysiska funktioner5. Korskontaminering kan uppstå efter påverkan av markrörelser på grund av lutning, vind- eller vattenförskjutning, eller jordbearbetning, medan den vertikala fördelningen av jord N kan påverkas av vattenflödet under ytan och dränering av plattor6.
- Beskriv försöksfältet, inklusive tidigare förvaltning (t.ex. tidigare grödor och jordbearbetning), latitud och longitud, jordens fysikaliska och kemiska egenskaper (t.ex. jordtexturalanalys, initiala fertilitetsförhållanden, pH och jord bulkdensitet).
- Registrera GPS-koordinater för forskningsplatsen och fälthörnen.
- Beskriv växtsäsongen förvaltning inklusive skadedjur och sjukdomshantering (herbicid, insektsmedel, eller fungicid användning), jord fertilitet förvaltning (inklusive ränta, källa, placering och ansökan timing), jordbearbetning, bevattning händelser och mängder, och rester förvaltning.
- Som gröda tillväxt och mikrober medierad N omvandlingar påverkas av markfukt, marktemperatur och lufttemperatur, registrera klimatinformation inklusive dagliga höga och låga temperaturer, daglig nederbörd, och mark fukt och temperaturer på flera djup som återspeglar marken provtagning djup.
2. Tomt design
- Plantera sex majsrader (~86 000 växter ha-1) på 76 cm avstånd med en slutlig plotdimension på 15,2 m med 4,6 m.
- Upprätta gränsområden 1,5 m från varje ände av den på längden dimension (0-1,5 m, 13,7-15,2 m) och ytterligare ett gränsområde 1,5 m långt (9,8–11,3 m) som gränsar till provtagnings- och skördeområdena (figur 1).
- Ange raderna 2 och 3 som provtagningsområde under säsong (1,5-9,8 m) och raderna 4 och 5 som skördeareal (1,5–9,8 m) för majskornsutbyte.
- Upprätta ett mikroplot område (11,3-13,7 m) med måtten 2,4 m med 3,8 m centrerad på bredden dimensionen. Samla alla 15N berikade växt- och jordprover från detta område och lämna 0,38 m oförstärkt kant på längd- och breddmåtten för att minimera kanteffekter (figur 2).
- Avgränsa behandlingsdiagrammet och mikroplot hörn med olika färgade flaggor.
3. Försiktighetsåtgärder för jord- och växtprov
- Använd särskild utrustning och bearbetningsområden för otrikad och berikade material. Kontaminering av oförtrikat material (gödningsmedel, jord eller växt) av berikade material och vice versa kan drastiskt påverka resultaten.
- Samla in och bearbeta 15N anrikade jord- och växtprover i ordning efter lägsta till högsta 15N förväntade anrikning för att minimera korskontaminering. Se till att arbetsytor, handskar, redskap och maskiner rengörs noggrant mellan varje prov för att minimera korskontaminering från provförsmåring.
- Minimera fottrafiken i mikroplots för att förhindra kontaminering av oenricherade provtagningsområden. Använd skyddande skobeläggningar när du kommer åt mikroplots och ta bort dem när du lämnar mikroområdet.
4. 15N berikad beredning och applicering av gödselmedel
- Enligt de riktlinjer som anges i ref. 2 för gödningsmedel 15N användningseffektivitet (F15NUE) studier, späd 10 atom % 15N anrikad urea till 5 atom % 15N anrikad urea och lös upp i 2 L avjoniserat vatten för att säkerställa enhetlig anrikning av ureagödselmedel.
OBS: Den nödvändiga koncentrationen av 15N berikat gödselmedel är beroende av målen för den agronomiska studien. Om koncentrationen av bestånd 15N berikat gödselmedel överstiger forskarens krav, får koncentrationen av gödselmedel spädas ut med liknande konventionellt gödselmedel med hjälp av följande formel3.
X2 = [(C1/C2) - 1] × X1
X2 är massan av det konventionella oberikade gödselmedlet, X1 är spårgödselns massa, C1 är den isotopiska koncentrationen [uttryckt som atom % överskott (uppmätt atom % anrikning minus den naturliga bakgrundskoncentrationen antas vara 0,3663 atom %)] av det ursprungliga spårgödselmedlet och C2 är den isotopiska koncentrationen av den slutliga blandningen. Som exempel kan 92,7 g konventionellt oförändrat gödselmedel krävas till exempel 100 g 100 g anrikad urea, för en slutlig isotopkoncentration på 5 atom %.
X2 = {[(10-0.3663)/5] - 1} × 100. - Analysera lösningen för 15N koncentration för att kontrollera anrikning. Författarna utnyttjade de analytiska tjänster som tillhandahålls av UC Davis Stable Isotope Facility.
OBS: Reaktioner från jord-växt-mikrob regim till gödselmedel tillägg kan påverkas av den fysiska formen av gödselmedel. Beroende på studiens mål kan urealösningen appliceras som en vätska eller uttorkad för att reformera kristaller. Kristallerna kan komprimeras till en kaka med hjälp av en Carver tryck på 10.000 psi, följt av krossning kakan och screening partiklarna till önskad storlek3. - Applicera de 15N-berikade urealösningarna jämnt på mikroploterna med en kalibrerad RYGGSÄCK CO2-spruta (figur 3A). Om flera N-frekvenser eller anrikningsnivåer används, överväg att använda utsedda CO2-sprutor för varje anrikningsnivå eller använd en enda spruta och tillämpa lösningar från lägsta till högsta anrikning för att minimera korskontaminering av behandling.
- Införliva urea-innehållande gödselmedel med lätt jordbearbetning, hand krattor, eller minst 0,6 cm bevattning inom 24 h från applicering för att minimera avdunstning förlustpotential.
- Inga ytterligare 15N berikade urea gödselmedel appliceras på mikroplot under den andra växtsäsongen. Applicera konventionella oförtrikatade urea till hela behandlingen för att undvika en differentiell respons i majstillväxt på grund av kväve.
5. Fältprov bearbetning: ovan jord majs biomassa
- Samla vid varje provtagningssteg ett sammansatt prov på sex ovan jord från provtagningsområdet(15N utan att berikas) och ett sammansatt prov på kompositprov med sex ovan jord från den 15N-berikade mikroploten. Minst två växter bör separera varje provväxt för att undvika att avsevärt ändra växttillväxtdynamiken. Författarna samlade växtprover vid fysiologiska utvecklingsstadierna V8 och R1corn 11 och vid fysiologisk mognad (figur 2).
- Enligt de principer som beskrivs i steg 3.1 och 3.2, hacka V8 och R1 ovan jord biomassa (≤5 cm med ≤5 cm), en gårdsspillfliser är ett tillfredsställande alternativ. Placera hackad biomassa i märkt tyg eller papperspåsar och torka i en forcerad luftugn vid 60 °C tills konstant massa. Registrera torrvikten för biomassa (figur 3B).
- Partition fysiologiskt mogna majsväxter i stover (alla vegetativa vävnader inklusive blad, skal och stjälkar), spannmål, och cob fraktioner. Hacka och torka i en forcerad luftugn vid 60 °C tills konstant massa. Registrera biomassans torrvikt.
- Inom mikroplot, skär alla majs stjälkar på jordytan, binda i en bunt, etikett enligt tomt, och ta bort från fältet (figur 3C). Justera mikroplot hörn flaggor vara nästan jämn med jordytan för att minimera risken för avlägsnande av skörden under skörd eller jordbearbetning efter skörd.
- Skörda spannmål från skördearealen och rapportera avkastning på 15,5% fukthalt12. Skörda återstående forskningsområden med en tomtskörd.
- Rake oenricherad biomassa från mikroområdet. Hacka och återappliceringsnad ovan jord biomassa till rätt tomt (figur 3D).
- Införliva rester i jordytan med jordbearbetning och se till att minimera transport av jord- och majsrester till eller från mikroområdet. Byt ut alla mikroplot hörn flaggor bort på grund av jordbearbetning.
- Plantera andra året majs på samma rader som det första året majs.
- Samla andra året ovan jord majs biomassa endast vid fysiologisk mognad och process som första året majs prover som beskrivs i steg 5.3. Samla in mikroplotprover från mikroplotområdets centrum (1,52 m med 0,76 m) för att undvika eventuell signalutspädning efter jordbearbetning (figur 2). Skörda spannmål från skördearealen och rapportera avkastningen på 15,5% fukthalt.
- I 3.1 och 3.2,följer principerna i steg 3.1 och 3.2 noggrant 100–200 g torkat växtmaterial för att passera genom en sikt på 2 mm. Blanda noggrant det malda materialet och förvara ett delprov i ett märkt myntkuvert för vidare bearbetning.
OBS: En Thomas Wiley-kvarn är ett tillfredsställande alternativ för växtvävnadsslipning medan en Perten Laboratory Mill 3610 är ett tillfredsställande alternativ för slipning av spannmål.
VARNING: Personer som maler växtprover ska bära hörselskydd och skyddas från inandning av damm genom att bära ett nationellt institut för arbetarskydd godkänd N95 Partikelfiltrering Ansiktsskydd.
6. Bearbetning av fältprov: jord
- Samla första årets jordprover 8 dagar efter 15N berikade gödselmedel ansökan, V8, R1, och efter skörd före jordbearbetning. Samla upp andra års jordprover vid förväxt och efter skörd. På grund av logistiska provtagningsbegränsningar samlade författarna in jordprover under säsong vid 0- till 15-, 15- till 30-, och 30- till 60 cm djup, jordprover efter skörd vid jordprover på 0- till 15-, 15- till 30-, 30- till 60-60- och 60-90 cm djup och andra året jordprover före växten vid 0- till 30-, 30- till 60-, 60- till 120-cm djup.
OBS: Om en jordsond inte kan samla in en jordkärna till det djupaste önskade djupet som en enda kärna, samla djupare djupkärnor från samma borrhål som de övre djupen som kasserar den övre 1 cm jord för att undvika förorening från jord som faller från övre djup.- Samla upp ett kompositjordprov med fyra kärnor (1,8 cm) från det oenrikade provtagningsområdet vid V8 och R1 med hjälp av en handsond. Samla en kärna i majsraden och tre kärnor mellan majsraderna.
- Samla upp ett kompositjordprov med två kärnor (5 cm i diameter) från det oenrikade provtagningsområdet vid föranläggningen och efter skörden med hjälp av en hydraulisk sond.
- Samla ett 15-kärniga (1,8 cm i diameter) sammansatt jordprov från mikroområdet 8 dagar efter 15N berikad gödningsmedel, V8 och R1 med hjälp av en handsond. Samla tre till fyra kärnor i majs raden och 11 till 12 kärnor mellan majs rader.
OBS: Jordar är extremt heterogena. Det större antalet kärnor som samlats in inifrån den anrikade mikroplot ger en bättre uppskattning av den sanna 15N anrikning av jord N13. - Samla ett kompositjordprov med tre kärnor (5 cm i diameter) från mikroområdet vid föranläggningen och efter skörden med hjälp av en hydraulisk sond.
- Homogenisera varje sammansatt jordprov i en hink och placera det i en förmärkt papperspåse.
- Torra jordprover vid 35 °C i en forcerad luftugn tills konstant massa. Slipa varje prov för att passera genom en 2 mm sikt. En mekanisk jordkvarn är tillfredsställande om den kan rengöras noggrant mellan varje prov.
JORDprover kan lufttorkas genom att prover sprids i ett tunt lager. Brickor bör vara i ett område fritt från kontaminering av yttre N källor. Ej berikade och berikade prover bör separeras fysiskt för att förhindra korskontaminering.
VARNING: Personer som maler jordprover ska bära hörselskydd och skyddas från inandning av damm genom att bära ett nationellt institut för arbetarskydd godkänt N95 Partikelfiltrering Ansiktsskydd.
7. Bearbetning av laboratorieprov: mal jord- och växtprover
- Torra prov (2 mm) över natten i en ugn vid 60 °C.
- Enligt de principer som beskrivs i steg 3, mal torkade växtprover eller jordmaterial till en fin, mjölliknande konsistens. En rullburkkvarn är ett tillfredsställande alternativ.
OBS: Författarnas jar kvarn är ett specialbyggt transportband system som kan bearbeta 54 rullburkar i taget.- Fyll varje rullburk (250 ml borosilikat glasburk med skruvlock) med 10 till 20 g mark växt- eller jordprov och sju rostfria stänger (8,5 cm långa, 0,7 cm i diameter).
- Rulla rullburkar på 0,4 x g för 6-24 timmar eller tills proverna har en fin, mjöl-liknande konsistens.
- Överför det finmalda materialet till en ren, märkt 20 ml scintillationsflaska.
- Mellan varje prov, tvätta rullburkar, rostfria stavar, och lock med tvål och vatten för att ta bort eventuella rester.
- Sänk ner rullburkar och lock i ett 5% HCl syrabad (berett från 36-38% koncentrerat lager) över natten14.
VARNING: Saltsyra är frätande. Det kan orsaka svåra brännskador i huden, ögonskador, och är skadligt vid inandning. Använd alltid skyddskläder, handskar samt ögon- och ansiktsskydd. Spola kontaktad vävnad noggrant med vatten. Använd alltid en sekundär behållare när du transporterar syror. Tillsätt alltid syra i vatten eftersom denna reaktion är exoterm. Omedelbart neutralisera syra spill med bakpulver.
OBS: Ett stort syrabad kan beredas som 100 L av 5% HCl i en 208 L plastbehållare. Förbered flera mindre volymer i en rökhuva och överför sedan lösningarna till plastbehållaren. Byt ut lösningen var tredje månad. - Trippelsköljning rullburkar och lock med avjoniserat vatten och lufttorka.
- Sänk ned rostfria stavar i ett 0,05 M NaOH-bad (bereds genom upplösning 2 g NaOH i 1 L avjoniserat vatten) över natten14. Förbered en ny 0,05 M NaOH bad varje dag.
VARNING: Natriumhydroxid kan orsaka svåra brännskador i huden och ögonskador. Använd alltid skyddskläder och ögonskydd. Ta omedelbart bort förorenade kläder och skölj huden eller ögonen med vatten i flera minuter. - Skölj stavarna under rinnande varmt kranvatten i 5 minuter. Dekantera och trippelskölj stavarna med avjoniserat vatten. Låt stavarna lufttorka på en pappershandduk fodrad bricka.
- Sänk ner rullburkar och lock i ett 5% HCl syrabad (berett från 36-38% koncentrerat lager) över natten14.
8. Väg markväxt- och jordprover för total N- och 15N-analys
- Analysera några representativa växt- och jordprover för total N-halt (t.ex. förbränningsanalys15). Beräkna provmassan som ger tillräcklig N-halt för 15N-analys enligt analysatorns specifikationer.
OBS: Författarna använde de analytiska tjänster som tillhandahålls av UC Davis Stable Isotope Facility. Berikade provvikter optimerades för 20 μg N med högst 100 μg N. - Organisera like-samples från lägsta till högsta förväntade 15N anrikning. Duplicera var åttonde till tolfte provet i varje körning för att kontrollera provprecision. Inkludera minst ett kontrollprov per körning16.
- Märk en ren 96-brunnsplatta och monterat lock med individuella brunnsavdunstningsringar. Klipp ett rent indexkort för att passa precis innanför locket för att förhindra provrörelser mellan brunnar under transport.
- Bär nitrilhandskar, rengör mikroskalan, arbetsytor, spatel och pincett med laboratorieservetter och etanol. Placera rengjorda redskap på en Kimwipe på labbbänken.
OBS: Oförtrikaserade och berikade prover bör bearbetas med hjälp av separata vågar och redskap för att förhindra korskontaminering. - Använd pincett för att placera en förformad 5 mm x 9 mm tennkapsel på en ren arbetsyta, till exempel ett block av rostfritt stål med 5 mm x 8 mm brunn. Knacka försiktigt kapseln i brunnen för att reformera den cylindriska formen och platta till kapselns botten om det behövs.
OBS: Eftersom provmassor kommer att vara mycket liten är risken för provkontaminering hög. Rör aldrig kapslarna med handskar. Kassera kapseln om den vidrör någon annan yta än pincetten, ren arbetsyta, vågvägningspanna eller 96-brunnsplatta. - Använd pincett för att försiktigt blossa ut kapselns övre 1 mm för att underlätta manipulering. För att undvika fjällskador när du tar kapselns vikt, hovra och släpp kapseln 1 till 2 mm ovanför mikroskalans vägningspanna. Tjära kapseln. Använd pincett för att återföra kapseln till den rena arbetsytan.
- Använd en spatel för att noggrant lägga till den nödvändiga massan av finmalet provmaterial till kapseln. Undvik att spilla provmaterial på kapselns eller arbetsytornas utsida.
- Använd pincett, tryck långsamt den övre tredjedelen av kapseln och vik över för att täta. Använd pincett, fortsätt att vika och komprimera kapseln till en sfärisk form och var noga med att inte punktera eller riva burken.
PROVER med låg N-halt kan kräva provvolymer som överstiger kapaciteten hos kapseln 5x9 mm. Större kapslar (t.ex. 9 mm x 10 mm) kan användas i dessa fall. - Använd pincett för att släppa den inslagna kapseln flera gånger från en höjd av 1 cm på en ren, mörk yta eller spegel för att kontrollera om det finns läckor. Om inget damm uppträder, väg provet med samma teknik som beskrivs i steg 8.6. Registrera provvikten. Placera kapseln i en 96-brunnsplatta och registrera brunnsplaceringen.
- Om damm visas på den mörka ytan registrerar du provvikten. Linda provet i en andra tenn kapsel, kontrollera om det finns läckor och placera det i en ren 96-brunnsplatta.
OBS: Om den inslagna kapseln är för stor för att få plats i en 96-brunnsplatta, använd en 24- eller 48-brunnsplatta.
- Om damm visas på den mörka ytan registrerar du provvikten. Linda provet i en andra tenn kapsel, kontrollera om det finns läckor och placera det i en ren 96-brunnsplatta.
- Mellan proverna, rengör var och en av redskapen och ytorna med etanol och laboratorieservetter med särskild uppmärksamhet på spatel och pincettkanter.
- Fäst locket på 96-brunnsplattan med tejp och förvara i en exsickator.
9. Beräkningar
- Beräkna massan av N (kg∙ha-1) som finns i växt- eller jordproverna med hjälp av följande ekvationer.
- Beräkna gödsel N-fraktionen(Nf),gödselmedel som härrör från N(FDN)och jord som härletts N(SDN)för växt- och jordprover17.
där A är atomen % 15N anrikning. -
- Beräkna gödselmedel 15N använd effektivitet17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten presenteras i detta dokument kommer från en fältplats som inrättades 2015 vid University of Minnesota Southern Outreach and Research Center ligger nära Waseca, MN. Webbplatsen förvaltades som en majs-sojabönor [Glycine max (L.) Merr] rotation före 2015 men förvaltades som en majs-majs rotation under 2015 och 2016 växtsäsonger. Jorden var en Nicollet lera loam (fin-loamy, blandade, superaktiva, mesic Aquic Hapludolls)-Webster lera loam (fin-loamy, blandade, superaktiva, mesic Typic Endoaquolls) komplex. Markens bördighet hanterades enligt universitetets riktlinjer med undantag för N18. Flera N gödselmedel behandlingar arrangerades i en randomiserad komplett block design med fyra replikeringar men endast 135 kg N∙ha-1 ränta tillämpas som urea vid plantering presenteras i detta dokument. Jord bulk densitet mättes i mitten av 0- till 15-, 15- till 30-, 30- till 60-, 60- till 90-, och 60- till 120-cm djup lager från två 5-cm djupa prover per replikering med hjälp av intakt kärna metod19. Bulkdensiteten var i genomsnitt inom djup över replikeringar och antas vara konstant över hela fältet. Tomtinställningar och växt- och jordprover samlades in och bearbetades enligt beskrivningen i protokollavsnittet.
Totalt (FDN + SDN) ovan jord biomassa N ökade med varje på varandra följande provtagning händelse under den första växtsäsongen (figur 4). Koncentrationen av gödselmedel som härrörde från N var störst tidigare under växtsäsongen och stod för 44 ± 4 % (genomsnittligt ± standardfel) av den totala biomassan N ovan jord vid V8 och minskade för varje på varandra följande provtagningsperiod (figur 4A). Emellertid, SDN var konsekvent den största andelen av ovan jord biomassa N illustrerar vikten av jord N utbudet för optimal majs tillväxt. Vid fysiologisk mognad under det första året kom 27 ± 1 % av biomassan ovan jord N från FDN med liknande proportioner i säd- och kaminer och kolbfraktioner (figur 4B). Vid fysiologisk mognad under det andra året återfanns endast 2 ± 0,1 % av det första året fdn i biomassan ovan jord med 1,6 ± 0,2 kg första år FDN ha-1 exporterad i spannmål (figur 4A).
FDN-budgeten för jordskörden är användbar för att kvantifiera FDN-cykling inom systemet över tid. Inom 8 d gödselmedel ansökan, majoriteten av FDN var i topp 15 cm av jordprofilen, som förväntat (figur 5). 22,2 ± 4,4 kg N ha-1 hade dock redan flyttat in i de djupare djupen medan 4 ± 10 % av FDN saknades. Oerknat för FDN drivs sannolikt främst av N-förlustmekanismer inklusive urlakning, denitrifiering och avdunstning som antingen flyttar FDN under jordprovtagningsdjupen eller tar bort FDN från systemet helt. Vid V8 och R1 ökade det oredovisade FDN till 60,4 ± 4,7 kg N ha-1 i genomsnitt medan jord N (0-15 cm) var 31,6 ± 6,8 kg N ha-1 i genomsnitt. Corns snabba tillväxt och höga N-efterfrågan från V8 till R1 resulterade i en ökning med 19,0 ± 4,4 kg FDN ha-1 i ovan jord anläggningsbiomassa som återspeglar 17,7 ± 5,2 kg FDN ha-1-minskning från jorddjupen 15 till 60 cm. Marktemperatur och fukt förhållanden mellan dessa majs utvecklingsstadier tenderar att gynna mikrobiell tillväxt vilket resulterar i snabb omsättning av organiska rester och återanvändning av mineraliserade N. Dessa resultat tyder på att majs rötter bryts oorganiska FDN från 15- till 60-cm djup medan FDN i 0- till 15-cm djup var främst cyklade mellan marken organiskt material och mikrobiella fraktioner. Ytterligare isotopanalys av jord oorganiska och organiska N pooler är nödvändigt att validera denna hypotes och ge mer detaljer och insikt i FDN cykling dynamik10. Vid efter skörd år 1 saknades 59 ± 2 % av det ursprungliga FDN medan 18,1 ± 3,9 kg FDN ha-1 låg i jords övre 30 cm (figur 5) och 22,1 ± 2,3 kg FDN ha-1 exporterades i säden (figur 4B). Gödningsmedel 15N användningseffektivitet var 24% (Ekvation 7) och är i den nedre delen av vanligen rapporterade F15NUE åtgärder (25-45%) rapporterats av andra studier20. Även om utrustningen rengjordes noggrant mellan varje prov, kan de lägre F15NUE-måtten i studien vara en artefakt av berikad provutspädning genom bearbetning av berikade prover i den ordning som var minst till högsta förväntade anrikning. Mängden FDN i topp 30 cm fördubblades (36,0 ± 5,2 kg FDN ha-1) från efter skörd år 1 till pre-plant år 2 på grund av partiell resthaltsde breakdown sedan föregående fall men efter skörd år 2 endast 17,3 ± 3,3 kg FDN ha-1 hittades fortfarande inom jord-majssystemet (figur 5). Denna studie visar att i slutet av det första och andra året, endast 41 och 29%, respektive av första året FDN stod för inom jord-majs systemet (inklusive FDN exporteras i spannmål) medan resten antingen förlorades till miljön eller lakas under 90 cm jord provtagning djup.
Falska resultat kan erhållas när prover är korsförorenade som påverkar beräkningar av Nf,FDN och SDN. Anta till exempel att ett 15N-berikat växtprov med en faktisk anrikning på 3 000 atom % 15N är förorenat med icke berikad material som späder ut 15N-koncentrationen till 2 500 atom % 15N. Anta vidare att Total NPlant är 100 kg N ha-1,berikningen av gödselmedlet med 15N var 5 000 och anrikningen av det oberikade växtprovet var 0,366. 15 Det 15N-berikade växtprovet Nf skulle minskas från 0,568 (faktiskt) till 0,461 (kontaminerat prov) som underskattar det verkliga FDN med 10,7 kg N ha-1. Överskattningar av FDN kan förekomma när prover med låg anrikning på 15N är kontaminerade med ytterligare 15N. Därför bör extrem försiktighet iakttas i alla steg i provtagning och bearbetning för att minimera provkontaminering, men framför allt när provmassor minskas (t.ex. malnings- och vägningsförfaranden).
Figur 1: Plot design för behandling tomt och mikroplot. Figuren illustrerar måtten och relativa placeringarna av gränsområdena, oenricherat provtagningsområde, skördeareal och mikroplotområde inom behandlingsområdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mikroplotanläggning och jordprovtagningsdiagram. Figuren illustrerar de relativa växt- och jordprovtagningspositionerna i varje provtagningsskede som undviker att ändra upptagningsmönstren för majs N i senare prov av majsväxter. Provtagningshändelser inträffade 8 dagar efter den 15N-berikade gödselmedelstillämpningen, vid fysiologiska utvecklingsstadier på V8 och R1 corn, vid fysiologisk mognad under året för 15N anrikad gödselmedel (PMY1) och följande år (PMY2), och före plantering det andra året (PPY2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kronologisk skildring av mikroplothantering. (A)Lös upp 15N berikad urea i 2 L av avjoniserat vatten och spraya på mikroplot vid plantering. (B)Samla upp och hacka ett sammansatt prov på sex ovan jordsegroddet majs från provtagningsområdet(15N oförfalskat) och ett sammansatt prov på kompositprov på sex ovan jord majs från den 15N-berikade mikroploten vid de förutbestämda provtagningstiderna. (C)Efter provinsamling vid fysiologisk mognad, avlägsna all återstående biomassa ovan jord inifrån mikroploten. D)Efter skörd, kratta oenrikad ovan jord majs biomassa från mikroplot området. Chip och återapplicering av mikroplot majs ovan jord biomassa till mikroplot området. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Exempel på ovan jordbiomassa N uppdelad i gödselmedel som härrör från N (FDN) och jordbaserade N (SDN) fraktioner. Total biomassa ovan jord N delades upp i dess enskilda källor till FDN (enfärgad) och SDN (hashfärg) i (A) och (B). Felstaplar representerar standardfelet för medelvärdet. (A)Ovan jord biomassa N mättes vid V8 och R1 majs fysiologiska utvecklingsstadier och vid fysiologisk mognad under året för 15N gödselmedel ansökan(PMY1)och året efter 15N gödselmedel ansökan(PMY2). Värdet ovanför varje kolumn representerar procentandelen av den totala N som var FDN. (B)Biomassa ovan jord N mätt vid PMY1 och PMY2 visas i dess enskilda delar av kolv (endast år 1), spisar (stjälk och blad, inklusive kolv för PMY2) och spannmål för FDN och SDN. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Exempel på jordmajsgödselmedel som härrör från N (FDN) budget. Massan av FDN som återvunns i ovan jord(Abvgd)majsbiomassa och vid olika jordprovtagningsdjup rapporteras för sex provtagningshändelser under två växtsäsonger. Provtagningshändelser inträffade 8 dagar efter den 15N-berikade gödselmedelsapplikationen(PA),vid fysiologiska utvecklingsstadier på V8 och R1, vid fysiologisk mognad under året för 15N anrikad gödselmedel (PMY1) och följande år (PMY2), och före plantering det andra året(PPY2). Skillnaden mellan den tillämpade gödselgraden (135 kg N ha-1) och massan av FDN som återvinns i jordmajsportionerna är den oredovisade för FDN-fraktionen. Den totala massan av FDN för PPY2 och PMY2 var 113 kg FDN ha-1 eftersom 22 kg FDN ha-1 exporterades ut ur jord-majssystemet som första året spannmål. Felstaplar representerar standardfelet för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stabil isotopforskning är ett användbart verktyg för att spåra och kvantifiera FDN genom jordgrödningssystemet. Det finns dock tre huvudsakliga antaganden i samband med N tracer studier som om kränks kan ogiltigförklara slutsatser från att använda denna metod. De är 1) spårämnet är jämnt fördelat i hela systemet, 2) processer enligt studien sker i samma takt, och 3) N lämnar 15N berikad pool inte tillbaka3. Eftersom denna studie är intresserad av fördelningen av den totala FDN i hela jord-gröda systemet, antaganden 2 och 3 är av minimal oro21.
Den höga kostnaden för 15N berikat material begränsar i allmänhet storleken på 15N spårämne studier. Innan en N-spårämnesstudie inleds bör forskaren därför noggrant planera forskningsprojektets mål med beaktande av: antalet provtagningshändelser, studiens längd (dagar till år), n-gödselmedelstillämmningshastigheten och den 15N-anrikningskoncentration som krävs för att mäta skillnader från naturligt överflöd (0,366 atom %) följande 15N berikad utspädning av gödselmedel per bulkjord2. Vanliga 15N anrikningsnivåer och användningshastigheter rapporteras för olika typer av agronomisk forskning i Ref. 2. Efter att ha fastställt studiemålen måste mikroploten vara tillräckligt stor för att rymma jord- och växtprovtagning och undvika kanteffekter. Den projekttomt som beskrivs i detta protokoll använder ett icke-begränsat område som kräver att icke-provbaserade gränsområden används6. 15N-koncentrationen i gränsområden späds ut genom massflöde över mikroplotgränsen och N-upptag utifrån mikroploten av laterala majsrötter som växer i raderna 1 och 6. Trånga områden, där fysiska barriärer drivs ut i marken, kräver inte gränsområden men kräver ytterligare arbete under mikroplotanläggningen och kan begränsa rutinmässiga fältoperationer6. Referenserna 3, 6, 22-25 ger ytterligare vägledning om val av mikroplotstorlekar, kantbredder och när begränsade eller icke-begränsade områden kan vara lämpligast.
Växt- och jordprovtagningssystemet i denna studie är utformat för att möjliggöra flera provtagningshändelser under två på varandra följande växtsäsonger. Tidig säsong växt och jord prover tas nära ytterkanterna av mikroplot. Varje på varandra följande provtagningshändelse närmar sig mikroplotens centrum för att undvika provtagning av tidigare provområden. Minst två majsväxter separerar varje provväxt för att minimera förändringar i majs fysiologisk utveckling. En utmaning med denna studie jord provtagning teknik är att marken kärna provtagningsmetoden inte får exakt avlyssna den heterogena fördelningen av 15N i jordprofilen3. Den rumsliga variationen i markens totala N är hög med en uppskattad variationskoefficient på 15 %3. Fullständig mikroplot utgrävning skulle förbättra 15N kvantifiering noggrannhet men kräver bearbetning betydande volymer av jord och begränsar provtagning till en enda händelse3 som inte är i linje med målen för denna studie. Att dela upp mikroploten i mindre provtagningsenheter möjliggör flera utgrävningshändelser, men kan öka den mikroplotstorlek som krävs för att säkerställa att enheter som inte provtas inte påverkas av ändringar av grödans baldakin och markvattendynamik. Trots den potentiella minskningen av noggrannheten använder många studier jordkärntekniken för mikroploter ≥1 m29,,22,,26,27,28. Provprecisionen kan ökas genom att öka antalet jordkärnor som samlas in och kompositeras per mikroplot med hjälp av följande formel13:
n = (Z2)(CV2)/dd2)
där n är antalet jordkärnor, Z är den standardiserade normala variaten för motsvarande alfanivå (1,96 för 0,05 och 1,65 för 0,10), är CV variationskoefficienten och d felmarginalen i observationstmedelvärdet (som decimal). Baserat på denna formel förväntar sig författarna att 15 kärnor per mikroplot skulle uppskatta totalt N till ±7,6% på 95% av tomterna (n = 15; Z = 1,96; CV = 15%; d = 0,076). I referens 25 användes ett liknande antal kärnor, men mikroploten delades upp i 32 provtagningsenheter som samlade in växt- och jordprover från fyra enheter vid varje provtagningshändelse.
Andra har visat att mikroplot data kan extrapoleras till helatomten 29. För att detta antagande ska vara giltigt måste dock behandlingsområdet och mikroploten hanteras på samma sätt. Om möjligt bör gödselmedel N appliceras i samma kemiska och fysiska former (t.ex. urea upplöst i vatten) eftersom dessa egenskaper påverkar gödsel-jorddynamiken inklusive N förlustmekanismer, immobilisering och tillgång till jordmikrober och växter3.
Rullburkslipningsmetoden som beskrivs i detta protokoll kan pulverisera stora volymer av växt- och jordprover, idealisk för att säkerställa ett representativt, homogeniserat prov. Tekniken kräver dock betydande manuellt arbete och tid att lasta, lossa, rulla och rengöra rullburkarna. Provbearbetningen begränsas av det tillgängliga antalet rullburkar, transportbandenhetens kapacitet och storleken på syrabadet. Kommersiella slipningsflaska kan vara ett alternativ till rullburkar, men kan begränsa mängden bearbetade växt- och jordprover. Lab-made, engångsbruk slipning flaskor kan konstrueras som potentiellt fungerar som både slipning och prov lagringskärl. Det viktigaste övervägandet av någon av dessa slipmetoder är att minimera korskontaminering mellan proverna.
Slutligen, eftersom 15N berikat gödselmedel material är dyrt, 15N berikas ovan jord biomassa och jordprover kan behållas och homogeniseras för användning i framtida studier. Dessa produkter kan vara särskilt användbara vid undersökning av resthalter nedbrytning, mineralisering potential, eller andra näringsämnen cykling processer21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner stöd från Minnesota Corn Research & Promotion Council, Hueg-Harrison Fellowship, och Minnesota's Discovery, Research and InnoVation Economy (MnDRIVE) Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 mL scintillation vial | ANY; Fisher Scientific is one example | 0334172C | |
| 250 mL borosilicate glass bottle | QORPAK | 264047 | |
| 48-well plate | EA Consumables | E2063 | |
| 96-well plate | EA Consumables | E2079 | |
| Cloth parts bag (30x50 cm) | ANY | NA | For corn ears |
| CO2 Backpack Sprayer | ANY; Bellspray Inc is one example | Model T | |
| Coin envelop (6.4x10.8 cm) | ANY; ULINE is one example | S-6285 | For 2-mm ground plant samples |
| Corn chipper | ANY; DR Chipper Shredder is one example | SKU:CS23030BMN0 | For chipping corn biomass |
| Corn seed | ANY | NA | Hybrid appropriate to the region |
| Disposable shoe cover | ANY; Boardwalk is one example | BWK00031L | |
| Ethanol 200 Proof | ANY; Decon Laboratories Inc. is one example | 2701TP | |
| Fabric bags with drawstring (90x60 cm) | ANY | NA | For plant sample collection |
| Fertilizer Urea (46-0-0) | ANY | NA | ~0.366 atom % 15N |
| Hand rake | ANY; Fastenal Company is one example | 5098-63-107 | |
| Hand sickle | ANY; Home Depot is one example | NJP150 | For plant sample collection |
| Hand-held soil probe | ANY; AMS is one example | 401.01 | |
| Hydraulic soil probe | ANY; Giddings is one example | GSPS | |
| Hydrochloric acid, 12N | Ricca Chemical | R37800001A | |
| Jar mill | ANY; Cole-Parmer is one example | SI-04172-50 | |
| Laboratory Mill | Perten | 3610 | For grinding grain |
| Microbalance accurate to four decimal places | ANY; Mettler Toledo is one example | XPR2 | |
| N95 Particulate Filtering Facepiece Respirator | ANY, ULINE is one example | S-9632 | |
| Neoprene or butyl rubber gloves | ANY | NA | For working in HCl acid bath |
| Paper hardware bags (13.3x8.7x27.8 cm) | ANY; ULINE is one example | S-8530 | For soil samples and corn grain |
| Plant grinder | ANY; Thomas Wiley Model 4 Mill is one example | 1188Y47-TS | For grinding chipped corn biomass to 2-mm particles |
| Plastic tags | ULINE | S-5544Y-PW | For labeling fabric bags and microplot stalk bundles |
| Sodium hydroxide pellets, ACS | Spectrum Chemical | SPCM-S1295-07 | |
| Soil grinder | ANY; AGVISE stainless steel grinder with motor is one example | NA | For grinding soil to pass through a 2-mm sieve |
| Tin capsule 5x9 mm | Costech Analytical Technologies Inc. | 041061 | |
| Tin capsule 9x10 mm | Costech Analytical Technologies Inc. | 041073 | |
| Urea (46-0-0) | MilliporeSigma | 490970 | 10 atom % 15N |
References
- Sharp, Z. Principles of Stable Isotope Geochemistry. , 2nd Edition, (2017).
- Van Cleemput, O., Zapata, F., Vanlauwe, B. Guidelines on Nitrogen Management in Agricultural Systems. Guidelines on Nitrogen Management in Agricultural Systems. 29 (29), 19 (2008).
- Hauck, R. D., Meisinger, J. J., Mulvaney, R. L. Practical considerations in the use of nitrogen tracers in agricultural and environmental research. Methods of Soil Analysis: Part 2-Microbiological and Biochemical Properties. , 907-950 (1994).
- Bedard-Haughn, A., Van Groenigen, J. W., Van Kessel, C. Tracing 15N through landscapes: Potential uses and precautions. Journal of Hydrology. 272 (1-4), 175-190 (2003).
- Peterson, R. G. Agricultural Field Experiments: Design and Analysis. , Marcel Dekker, Inc. New York. (1994).
- Follett, R. F. Innovative 15N microplot research techniques to study nitrogen use efficiency under different ecosystems. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 32 (7/8), 951-979 (2001).
- Russelle, M. P., Deibert, E. J., Hauck, R. D., Stevanovic, M., Olson, R. A. Effects of water and nitrogen management on yield and 15N-depleted fertilizer use efficiency of irrigated corn. Soil Science Society of America Journal. 45 (3), 553-558 (1981).
- Schindler, F. V., Knighton, R. E. Fate of Fertilizer Nitrogen Applied to Corn as Estimated by the Isotopic and Difference Methods. Soil Science Society of America Journal. 63, 1734 (1999).
- Stevens, W. B., Hoeft, R. G., Mulvaney, R. L. Fate of Nitrogen-15 in a Long-Term Nitrogen Rate Study. Agronomy Journal. 97 (4), 1037 (2005).
- Recous, S., Fresneau, C., Faurie, G., Mary, B. The fate of labelled 15N urea and ammonium nitrate applied to a winter wheat crop. Plant and Soil. 112 (2), 205-214 (1988).
- Abendroth, L. J., Elmore, R. W., Boyer, M. J., Marlay, S. K. Corn Growth and Development. , (2011).
- Lauer, J. G. Methods for calculating corn yield. , http://corn.agronomy.wisc.edu/AA/pdfs/A033.pdf (2002).
- Gomez, K. A., Gomez, A. A. Statistical Procedures for Agricultural Research. , 2nd Edition, John Wiley and Sons. (1984).
- Khan, S. A., Mulvaney, R. L., Brooks, P. D. Diffusion Methods for Automated Nitrogen-15 Analysis using Acidified Disks. Soil Science Society of America Journal. 62 (2), 406 (1998).
- Horneck, D. A., Miller, R. O. Determination of Total Nitrogen in Plant Tissue. Handbook of Reference Methods for Plant Analysis. , 75-84 (1998).
- UC Davis Stable Isotope Facility. Carbon (13C) and Nitrogen (15N) Analysis of Solids by EA-IRMS. , https://stableisotopefacility.ucdavis.edu/13cand15n.html (2019).
- Stevens, W. B., Hoeft, R. G., Mulvaney, R. L. Fate of Nitrogen-15 in a Long-Term Nitrogen Rate Study: II. Nitrogen Uptake Efficiency. Agronomy Journal. 97 (4), 1046 (2005).
- Kaiser, D. E., Fernandez, F. G., Coulter, J. A. Fertilizing Corn in Minnesota. , University of Minnesota Extension. https://extension.umn.edu/crop-specific-needs/fertilizing-corn-minnesota (2018).
- Blake, G. R., Hartge, K. H.
- Jokela, W. E., Randall, G. W. Fate of Fertilizer Nitrogen as Affected by Time and Rate of Application on Corn. Soil Science Society of America Journal. 61 (6), 1695 (2010).
- Hart, S. C., Stark, J. M., Davidson, E. A., Firestone, M. K. Nitrogen Mineralization, Immobilization, and Nitrification. Methods of Soil Analysis, Part 2. Microbiological and Biochemical Properties. (5), 985-1018 (1994).
- Jokela, W., Randall, G. A nitrogen-15 microplot design for measuring plant and soil recovery of fertilizer nitrogen applied to corn. Agronomy journal (USA). 79 (APRIL), http://agris.fao.org/agris-search/search/display.do?f=1988/US/US88241.xml;US875113688 322-325 (1987).
- Olson, R. V. Fate of tagged nitrogen fertilizer applied to irrigated corn. Soil Science Society of America Journal. 44 (3), 514-517 (1980).
- Follett, R. F., Porter, L. K., Halvorson, A. D. Border Effects on Nitrogen-15 Fertilized Winter Wheat Microplots Grown in the Great Plains. Agronomy Journal. 83 (3), 608-612 (1991).
- Balabane, M., Balesdent, J. Input of fertilizer-derived labelled n to soil organic matter during a growing season of maize in the field. Soil Biology and Biochemistry. 24 (2), 89-96 (1992).
- Recous, S., Machet, J. M., Mary, B. The partitioning of fertilizer-N between soil and crop: Comparison of ammonium and nitrate applications. Plant and Soil. 144 (1), 101-111 (1992).
- Bigeriego, M., Hauck, R. D., Olson, R. A. Uptake, Translocation and Utilization of 15N-Depleted Fertilizer in Irrigated Corn. Soil Science Society of America Journal. 43 (3), 528 (1979).
- Glendining, M. J., Poulton, P. R., Powlson, D. S., Jenkinson, D. S. Fate of15N-labelled fertilizer applied to spring barley grown on soils of contrasting nutrient status. Plant and Soil. 195 (1), 83-98 (1997).
- Khanif, Y. M., Cleemput, O., Baert, L. Field study of the fate of labelled fertilizer nitrate applied to barley and maize in sandy soils. Fertilizer Research. 5 (3), 289-294 (1984).
