Summary
מוצג כאן פרוטוקול לייצור מיקרו-פגזים עם ננו-חלקיקים (NSMs) המופגזים בתחמוצת ברזל באמצעות הרכבה עצמית, סינרגיה של תגובה מגנטית, אקוסטית ואופטית בפלטפורמה ננו-תרפיוטית אחת לטיפול בהיפרתרמיה מגנטית ובשילוב פוטותרמי לסרטן.
Abstract
אספקה מדויקת של סוכנים נגד סרטן שמטרתם לידה ממוקדת וחדירה עמוקה, כמו גם שחרור מבוקר באתר הגידול כבר מאותגר. כאן, אנו מייצרים מיקרו-חלקיקים המופגזים בתחמוצת ברזל (NSMs) באמצעות הרכבה עצמית, סינרגטיזציה של תגובה מגנטית, אקוסטית ואופטית בפלטפורמה ננו-תרמית אחת. חלקיקי תחמוצת ברזל משמשים הן כסוכנים מגנטיים והן כסוכנים פוטותרמיים. לאחר הזרקה תוך ורידי, NSMs יכול להיות מונחה מגנטית לאתר הגידול. אולטראסאונד מפעיל את שחרורו של חלקיקי תחמוצת ברזל, להקל על חדירה של חלקיקים עמוק לתוך הגידול בשל אפקט cavitation של microbubbles. לאחר מכן, היפרתרמיה מגנטית וטיפול פוטותרמי יכול להתבצע על הגידול לטיפול משולב בסרטן, פתרון להתנגדות לסרטן בשל הטרוגניות הגידול. בפרוטוקול זה בוצעו סינתזה ואפיון של NSMs כולל תכונות מבניות, כימיות, מגנטיות ואקוסטיות. בנוסף, היעילות נגד סרטן על ידי טיפול תרמי נחקרה באמצעות תרביות תאים במבחנה. אסטרטגיית הלידה המוצעת והטיפול המשולב טומנים במכינו הבטחה גדולה בטיפול בסרטן לשיפור יעילות הלידה והטיפול.
Introduction
סרטן הוא אחת המחלות הקטלניות ביותר, גרימת מיליוני מקרי מוות מדי שנה ברחבי העולם והפסדים כלכליים עצומים1. במרפאות, טיפולים נגד נגד נגדים קונבנציונליים, כגון כריתה כירורגית, הקרנות וכימותרפיה עדיין לא יכולים לספק יעילות טיפולית משביעת רצון2. מגבלות של מטפלים אלה הם תופעות לוואי רעילות גבוהות, שיעור הישנות גבוה ושיעור גרורות גבוה3. לדוגמה, כימותרפיה סובלת מיעילות המסירה הנמוכה של תרופות כימותרפיות דווקא לאתר הגידול4. חוסר היכולת של תרופות לחדור עמוק לתוך רקמת הגידול על פני המחסומים הביולוגיים, כולל מטריצה חוץ תאית ולחץ נוזלים ביניים גידול גבוה, אחראי גם על היעילות הטיפולית הנמוכה5. חוץ מזה, ההתנגדות לגידול מתרחשת בדרך כלל בחולים שקיבלו טיפול על ידי כימותרפיה אחת6. לכן, טכניקות שבהן מתרחשת אבלציה תרמית של הגידול, כגון טיפול פוטותרמי (PTT) וטיפול היפרתרמיה מגנטית (MHT), הראו תוצאות מבטיחות כדי להפחית את ההתנגדות לגידולים והתעוררו בניסויים קליניים7,8,9.
PTT מפעיל אבלציה תרמית של תאים סרטניים על ידי פעולה של סוכני המרה פוטותרמיים תחת הקרנה של אנרגיית הלייזר. הטמפרטורה הגבוהה שנוצרה (מעל 50 °C (50 °F) מעורר נמק תא מלא10. לאחרונה, חלקיקי תחמוצת ברזל (IONPs) הוכחו להיות סוכן המרה פוטותרמי שניתן להפעיל על ידי אור כמעט אינפרא אדום (NIR)11. למרות מקדם ספיגת הטוחנת הנמוכה באזור האינפרא אדום הקרוב, IONPs מועמדים לטיפול פוטותרמי בטמפרטורה נמוכה (43 מעלות צלזיוס), טיפול מותאם כדי להפחית את הנזק שנגרם על ידי חשיפה לחום לרקמות רגילות וליזום חסינות antitumor מפני גרורות הגידול12. אחת המגבלות של PTT היא עומק החדירה הנמוך של הלייזר. עבור גידולים עמוקים בישיבה, שדה מגנטי לסירוגין (AFM) המושרה חימום של חלקיקי תחמוצת ברזל, המכונה גם היפרתרמיה מגנטית, הוא טיפול אלטרנטיבי עבור PTT13,14. היתרון העיקרי של MHT הוא החדירה הגבוהה של שדה מגנטי15. עם זאת, הריכוז הגבוה יחסית הנדרש של יונים נשאר חיסרון מרכזי עבור היישום הקליני שלה. יעילות המסירה של ננו-רפואה (או חלקיקים) לגידולים מוצקים בבעלי חיים הייתה 1-10% עקב סדרה של מכשולים כולל מחזור הדם, הצטברות וחדירה16,17. לכן, אסטרטגיית משלוח IONPs מבוקרת וממוקטת עם היכולת להשיג חדירה גבוהה לרקמות היא עניין רב בטיפול בסרטן.
משלוח ננו-חלקיקים בתיווך אולטראסאונד הראה את יכולתו להקל על חדירת חלקיקים עמוק לתוך רקמת הגידול, בשל התופעה הנקראת cavitation microbubble18,19. במחקר הנוכחי, אנו מייצרים מיקרו-יבלות IONPs המופגזות באמצעות הרכבה עצמית, סינרגטיזציה של תגובה מגנטית, אקוסטית ואופטית בפלטפורמה ננו-תרמית אחת. ה- NSM מכיל ליבת אוויר ומעטפת של חלקיקי תחמוצת ברזל, בקוטר של כ 5.4 מיקרומטר. NSMs יכול להיות מונחה מגנטית לאתר הגידול. אז שחרורו של יעונים מופעל על ידי אולטרסאונד, מלווה cavitation microbubble ומיקרו סטרים. התנע המתקבל מהמיקרו-סטרים מאפשר חדירה של יונים לרקמת הגידול. ניתן להשיג את ה- PTT וה- MHT על ידי הקרנת לייזר NIR או יישום AFM, או עם השילוב של שניהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הנחיות OG התרופות לטיפול בבעלי חיים ושימוש בחיות מעבדה. הפרוטוקולים פעלו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה לחיות מעבדה של OG פרמצבטיקה.
1. סינתזה של מיקרו-חלוקים מופגזים ננו-חלקיקים (NSMs)
- פזרו חלקיקים מגנטיים (Fe3O4, תחמוצת ברזל) במים דה-יונים כדי ליצור פתרון מלאי של 10 מ"ג/מ"ל.
- מניחים את הצינור המכיל את פתרון IONPs במכונת ניקוי קולית במשך 20 דקות. קבל פתרון IONPs מפוזרים באופן אחיד לפני השימוש.
- הוסף 150 μL של מים דהויונים, 150 μL של 10 mM נתרן דודסיל סולפט (SDS), ו 400 μL של פתרון מלאי של IONPs מהשלב 1.1. בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- תקן את ההומוגניזר עם פיגום באמבט קרח.
- מניחים את צינור התערובת באמבט קרח ומניחים את הגשושית הומוגניזר בדיוק כדי להיות שקוע בתמיסת התערובת.
- התאימו את מהירות ההומוגניזר ל-20,000 סל"ד והדליקו את ההומוגניזר למשך 3 דקות.
- כבה את homogenizer ולהסיר את הצינור מאמבט הקרח.
- מניחים את הצינור על מתלה הצינור לייצוב של 12 שעות בטמפרטורת החדר.
- ספיחה NSMs הביא לקיר הצינור על ידי מגנט ולהסיר את supernatant. ואז לחדש עם 1 מ"ל של מים דה-יוניזציה טריים.
- חזור על תהליך הכביסה במשך שלוש פעמים והשהה מחדש את NSMs ב-1 מ"ל של מים מזוקקים טריים.
- העבר 10 μL של השעיית NSMs למגלשת זכוכית נקייה לאחר רועד מעט.
- השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 20 כדי לדמיין את המורפולוגיה של NSMs. ודאו לצלם תמונות באזור אקראי.
- מדוד את הקוטר של NSMs מהתמונות באמצעות גישה פתוחה Nano Measurer 1.2 תוכנה. תספור לפחות 200 מיקרו-נבלים.
- לחץ על "קובץ" ועל "פתח" כדי לבחור את קובץ התמונה לעיבוד. לאחר ייבוא התמונה, הקש על "הסרגל". צייר קו אדום באותו אורך כמו הסרגל.
- לאחר מכן לחץ על "הגדרות" | "סרגל" והזן את אורך הסרגל. צייר קווים באותם אורכים כמו הקטרים של המיקרו-יבלים הבודדים בתמונה. השלם את כל המדידות ולאחר מכן לחץ על "דווח" | " הצג דוח".
2. תגובה אקוסטית של NSMs
- לדלל 200 μL של NSMs עם 800 מים deionized μL, ולאחר מכן להעביר לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל כדי ליצור פתרון מלאי.
- חבר את מחולל הפונקציה, המגבר, התאמת העכבות והמתמר הממוקד תוצרת בית. מקם את המתמר במרכז בתחתית הכיור הקובואידי המלאכותי וחבר את ההידרופון עם אוסצילוסקופ כדי לפקח על עוצמת אולטרסאונד היציאה (איור 1). מוסיפים מים דה-יון לכיור כדי לטבול את המתמר.
- התאם את מחולל הפונקציות למצב הטאטוא, כוונן את טווח התדרים מ- 10 kHz ל- 900 kHz והגדר את המשרעת ל- 20 Vpp (שיא מתח). התאם את הכוח של אולטרסאונד ל 0.1% על ידי המגבר. משך הזמן של כל מחזור הוא 4 s עם מרווח זמן של 1 s.
- הכן 1 mL NSMs דגימות פתרון מלאי בצינור ולתקן את הצינור עם פיגום על החלק העליון של מתמר ממוקד תוצרת בית. חבר את המגנט לתחתית הצינור ומשוך את ה- NSMs.
- הפעל את הכוח של מחולל הפונקציה והמגבר. לכבות את מחולל הפונקציה לאחר יישום של 5 מחזורים (25 s) של אולטרסאונד. הסר את המגנט ולאסוף 1 מ"ל של הפתרון המכיל את IONPs שוחרר. מוסיפים 1 מ"ל של מים דה-יוניים לצינור הצנטריפוגה.
- חזור על שלב 2.5. עד NSMs בצינור לקרוס לחלוטין.
- לכמת את כל IONPs שוחרר על ידי ספקטרומטר פליטה אופטית פלזמה מצמיד אינדוקטיבית (ICP-OES) כפי שתואר קודם לכן13.
3. תגובה אופטית של NSMs
הערה: בעבודה זו, מערכת לייזר המכילה כוח לייזר 808 ננומטר ומצלמת הדמיה תרמית אינפרא אדום שתואר בעבר על ידי Xu et al. מנוצל20.
- הכנת מערכת לייזר
- הפעל את ספק הכוח של הלייזר ואפשר לו להתחמם במשך מספר דקות. תקן דיודה לייזר 808 ננומטר על דוכן תגמולים.
- כוון את קרן הלייזר לשלב הדגימה דרך סיב אופטי והתמקד בשלב הדגימה כדי להשיג נקודת אור בקוטר 6 מ"מ (בקוטר) על ידי עדשה קמרה.
- מדוד את תפוקת הכוח באמצעות מד כוח לייזר והתאם את העוצמה ל- 1 W /cm2.
- תקן את מצלמת ההדמיה התרמית האינפרא אדום על החצובה. הפעל את המצלמה ובדוק אם הוא עובד (למשל, נטר את אזור העניין הממוקד (ROI). כבה את ספק הכוח ואת מצלמת ההדמיה התרמית האינפרא-אדום.
- מדידה פוטותרמית בפתרון מימי
- הכן את דגימת 1 מ"ל בריכוז יונים שונים (1.05 מ"ג/ מ"ל, 1.35 מ"ג / מ"ל, 3.65 מ"ג / מ"ל, 5 מ"ג / מ"ל) בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- מניחים את צינור העניין באזור הממוקד של קרן הלייזר ומתעדים את הטמפרטורה הבסיסית של המדגם.
- הפעל את כוח הלייזר ואת מצלמת ההדמיה התרמית האינפרא אדום והקרין את הדגימה במשך 10 דקות ברציפות. במקביל, להקליט את הטמפרטורה בזמן אמת.
- כבה את כוח הלייזר ואת מצלמת ההדמיה התרמית האינפרא אדום לאחר 10 דקות של הקרנה. המתן עד שהטמפרטורה של האזור תחזור לקו הבסיס.
- חזור על 3.2.2 עד 3.2.4 למדידה של דגימות אחרות.
הערה: השתמש במים דה-יון ב 20 °C (70 °F) כפקד עבור המדידה photothermal.
- מדידה פוטותרמית בתאים בתרבית
הערה: תאי סרטן השד מורין (4T1) נבחרו כמודל לחקור את אפקט העיכוב על ידי טיפול פוטותרמי.- להאכיל את התאים עם רוזוול פארק ממוריאל מכון-1640 (RPMI-1640) בינוני בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו 1% פניצילין. הגדר את סביבת הפולחן כ-37 °C (5°F) ו-5% CO2.
- תרבית 4T1 תאים ב T25 צלוחיות ומעבר התאים ביחס 1:2 כאשר 90% מפגש הוא הגיע.
הערה: ניתן להתאים את יחס תת-תרבות בהתאם לתנאי התא הספציפיים במעבדות שונות. - הסר והשלך את מדיום התרבות. יש לשטוף את שכבת התא בתמיסת 1x PBS כדי להסיר את הסרום השיורי המכיל מעכב טריפסין.
- הוסף 2 מ"ל של פתרון טריפסין-EDTA (0.25%) לבקבוקונית לניתוק. לאחר מכן להוסיף 3 מ"ל של 1640 תאים בינוניים ושאפתנים על ידי צנרת בעדינות.
- לאסוף 5 מ"ל של השעיית התא צנטריפוגה ב 500 x g במשך 3 דקות.
- הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של בינוני 1640 טרי כדי ליצור השעיית תא.
- הוסף 100 μL של השעיית התא לצלחת confocal המכיל 1 מ"ל של מדיום התרבות. ודא כי הריכוז של השעיית התא הוא 9 x 105/mL, ואת ריכוז התא הסופי בצלחת קונפוקלי תרבות התא הוא 8.1 x 104/mL.
- מניחים את צלחת הקונפוקלי של תרבית התא המחוסנת באינקובטור למשך 24 שעות.
- לדלל ריכוז שונה (1.05 מ"ג/מ"ל, 1.35 מ"ג/מ"ל, 3.65 מ"ג/מ"ל, 5 מ"ג/מ"ל) של דגימת IONPs כדי להפוך פתרון 1 מ"ל עם 1640 בינוני ללא סרום.
- שואפים את המדיום התרבותי מהצלחת הקונפוצלית ומוסיפים את הפתרון לדוגמה המוכן.
- תדליק את כוח הלייזר. למקד את קרן הלייזר במרכז המנה ולהתאים את כוח היציאה ל 1 W / ס"מ2. הפעל את מצלמת ההדמיה התרמית אינפרא אדום, להקרין את התאים בצלחת הקונפוקלית במשך 10 דקות ברציפות. תעד את הטמפרטורה בזמן אמת עבור האזור הממוקד.
- כבה את מצלמת ההדמיה התרמית של הלייזר והאינפרא-אדום. מעבירים את המנה המוקרנת לאינקובטור לעוד 24 שעות.
- מוציאים ומשליכים את המדיום התרבותי, מוסיפים 1 מ"ל של מדיום התרבות הטרייה בצלחת הקונפוצלית. מוסיפים 5 μL של פתרון Calcein-AM (1 מ"ג / מ"ל) לתוך המנה.
- לדגור על צלחת הקונפוקלי ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2 במשך 15 דקות. יש לשטוף את שכבת התא עם פתרון PBS 1x פעמיים.
- התבונן וצלם את התאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי עם אורך גל עירור של 488 ננומטר ואורך גל פליטה של 500-540 ננומטר.
- בחרו 5 אזורים בתמונות הקונפוקליות באופן אקראי וספרו את מספר תאי 4T1 החיים בכל אזור באופן ידני. לכמת את הכדאיות של תאי 4T1 על-ידי השוואת מספר התאים החיים בכל קבוצות הניסוי עם קבוצת הביקורת.
הערה: השתמש במדיום 1640 ללא סרום ב-20 °C (70 °F) כפקד על המידה הפוטותרמית. השתמש במדגם ללא הקרנת לייזר כקבוצת בקרה של כדאיות התא.
- מדידה פוטותרמית בוויו
- הכן 3 עכברים זכר ICR בן 8 שבועות עם משקל ממוצע של 25 ± 2 גרם.
- מוסיפים 2 גרם אבקת ג'לטין ל-20 מ"ל של מים מתובלים. מחממים את התמיסה ל 40 - 50 מעלות צלזיוס, להמיס את ג'ל ג'לטין לחלוטין כדי ליצור פתרון שקוף וברור.
- הוסף 100 מ"ג יון לפתרון מ 3.4.2.
- מחממים את הג'ל ל 40 – 50 °C (50 °F), מיד להזריק 500 μL של פתרון ג'לטין לתוך כרית השד הימני של העכבר.
- הפעל את כוח הלייזר ומקד את קרן הלייזר באזור העניין (כרית השד הימנית של העכברים). כוונן את עוצמת היציאה ל- 1 ואט/ס"מ2. הפעל את מצלמת ההדמיה התרמית האינפרא אדום, להקרין את אזור הריבית במשך 10 דקות ברציפות. תעד את הטמפרטורה של אזור העניין בזמן אמת.
- כבה את מצלמת ההדמיה התרמית של הלייזר והאינפרא-אדום.
- המת חסד עכברים על ידי חנק CO2 ונקע חוליות צוואר הרחם או כל שיטה שאושרה על ידי ועדת המחקר בבעלי חיים של המכון.
4. מדידת היפרתרמיה מגנטית
הערה: כאן, מערכת היפרתרמיה מגנטית שתוארה בעבר על ידי וו ואח 'מנוצלת (21).
- הכן מערכת היפרתרמיה מגנטית כוללת גנרטור שדה מגנטי לסירוגין (AFM) ומצלמת הדמיה תרמית אינפרא אדום.
- הפעל את הצ'ילר במשך 10 דקות ולאחר מכן כוח על מכונת חימום תדר רדיו מתון (כלומר, גנרטור AFM).
- הגדר את הפרמטרים של המכונה כדלקמן: תדירות (ו) = 415 kHz, עוצמת שדה מגנטי = 1.8 kA / m.
- מדידת היפרתרמיה מגנטית בתמיסה מימית
- הכן 1 מ"ל של המדגם בריכוז IONPs שונים (1.05 מ"ג / מ"ל, 1.35 מ"ג / מ"ל, 3.65 מ"ג / מ"ל, 5 מ"ג / מ"ל) בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- מניחים את הצינור במרכז סליל נחושת אינדוקציה מגנטי מקורר מים.
- הפעל את השדה המגנטי לסירוגין (AFM) ואת מצלמת ההדמיה התרמית האינפרא-אדום. לגרום לדגימה במשך 10 דקות ברציפות ולרשום את הטמפרטורה בזמן אמת.
הערה: המצלמה ממוקמת בחלק העליון של המדגם, ומספקת תצוגה חתך של המדגם. - כבה את AFM ואת מצלמת הדמיה תרמית אינפרא אדום. המתן לטמפרטורת סליל הנחושת לחזור לקו הבסיס במשך 10 דקות.
הערה: היזהרו בטמפרטורה גבוהה, הימנעו ממגע ישיר עם הידיים והמתינו לקירור לפני הסרת הדגימות. - חזור על 4.2.2 עד 4.2.4 למדידה של הדגימות האחרות.
- כבה את מכונת חימום תדר הרדיו המתונה (AFM) ואת הצ'ילר.
הערה: השתמש במים המהוגזמים במהירות של 20 °C (20 °F) כפקד על מדידת היפרתרמיה מגנטית.
- מדידת היפרתרמיה מגנטית ב-vivo
- הכן 3 עכברים זכר ICR בן 8 שבועות עם משקל ממוצע של 25 ± 2 גרם.
- הכן 20 מ"ל של 10 % ג'ל ג'לטין המכיל 5 מ"ג / מ"ל פתרון IONPs.
- מחממים את ג'ל הג'לטין ל 40 - 50 °C (50 °F), מיד להזריק 500 μL של פתרון ג'לטין לתוך כרית השד הנכון של החיה.
הערה: ניסויי היפרתרמיה הנגרמת מגנטית נערכו עם מכונת החימום באמצעות אותם פרמטרים כמו מבחן במבחנה. - הפעל את השדה המגנטי לסירוגין (AFM) ואת מצלמת ההדמיה התרמית האינפרא-אדום. מניחים את כרית השד הימנית של העכברים במרכז סליל נחושת אינדוקציה מגנטי מקורר מים.
- הפעל את מצלמת ההדמיה התרמית האינפרא אדום, דמיין את אזור העניין (כרית השד הימנית של העכברים) במשך 10 דקות ברציפות ותיעד את הטמפרטורה של אזור העניין בזמן אמת.
- כבה את מתג ההפעלה של המכונה ומצלמת הדמיה תרמית אינפרא אדום לאחר 10 דקות של אינדוקציה. המתן לטמפרטורת סליל הנחושת כדי לחזור לקו הבסיס במשך 10 דקות.
- חזור על 4.3.4 עד 4.3.6 למדידה של דגימות אחרות.
- כבה את מכונת חימום תדר הרדיו המתונה (AFM) ואת הצ'ילר.
הערה: היזהרו בטמפרטורה גבוהה, הימנעו ממגע ישיר עם הידיים והמתינו לקירור לפני הסרת הדגימות. - המת חסד עכברים על ידי חנק CO2 ונקע חוליות צוואר הרחם או כל שיטה שאושרה על ידי ועדת המחקר בבעלי חיים של המכון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המיקרו-פגזים הננו-חלקיקיים (NSMs) בעלי ההפגזה המשולשת המשמשים במחקר זה הוכנו על ידי תסיסה של התערובת של פעילי השטח וה-IONPs. ה- IONPs (50 ננומטר) התאספו בעצמם בממשק של ליבת נוזל וגז, כדי ליצור מעטפת מגנטית צפופה. המורפולוגיה של NSMs מוצגת באיור 1A. NSMs שנוצר הציג צורה כדורית ובקוטר ממוצע של 5.41 ± 1.78 מיקרומטר (איור 1B). התוצאות הצביעו על כך שה- NSMs הוכנו בהצלחה. כאשר אוחסנו במים, microbubbles נשאר שלם במשך יותר משנה אחת, והיו יציבים במאגרים ו תרבית תאים בינוני לפחות 10 ימים19. כפי שמוצג איור 1D, שחרור צעד של Fe הושג עם הגדלת מספר המחזורים של אולטרסאונד מיושם. לאחר 10 מחזורים, כ -20% של Fe שוחררו. עד 50 מחזורי אולטרסאונד, כמות Fe שוחרר הגיע לרמה סביב 80%. תוצאות אלה הציעו את שחרור לפי דרישה של ינות על ידי הדק אולטרסאונד חיצוני.
מדידה פוטותרמית בתיווך IONPs בפתרון מימי מוצגת באיור 2. טמפרטורת היונים עלתה במהירות עם זמן הקרנה הולך וגדל כפי שמוצג באיור 2A,B. עלייה של 30 °C של הטמפרטורה יכולה להיות מושגת כאשר נחשפים לייזר NIR (808 ננומטר,1 W / ס"מ2) במשך 10 דקות בריכוז Fe של 5 מ"ג / מ"ל.
החום שנוצר על ידי PTT יכול להרוג את התאים הסרטניים. הכדאיות של תא 4T1 על ידי PTT הוערך על ידי לייזר NIR (808 ננומטר, 1 W / cm2) טיפול במשך 10 דקות. כפי שמוצג באיור 3A,B, בהשוואה לקבוצת הביקורת, לא היה הבדל במורפולוגיה ובמספר התא החי כאשר דגירה עם ריכוז גבוה של Fe (5 מ"ג/מ"ל), מה שמרמז על הזמינות הביולוגית הטובה של יונים. לאחר הקרנה על ידי לייזר NIR, התאים הפכו צורה עגולה, המציין אפופטוזיס. הכימות של מספר התא החי, כלומר הכדאיות של התאים מוצגת באיור 3C. התאים דגירה עם ריכוז יונים גבוה (3.65 מ"ג / מ"ל ו 5 מ"ג / מ"ל) תחת הקרנת NIR היה שיעור התמותה הגבוה ביותר, שהוא סביב 80% ו 100% בהתאמה. ריכוז IONPs נמוך (1.025 מ"ג / מ"ל ו 1.35 מ"ג / מ"ל) קבוצה מטופלת הראה יעילות הרג דומה כמו כ 40%. התוצאות מראות כי ההשפעה הפוטותרמית של NSMS יכולה לטפל ביעילות בסרטן.
כפי שניתן לראות באיור 4A,B, הטמפרטורה של אזור הזרקת ג'לטין עלתה במהירות בכ -20 °C (5 דקות) של הקרנת NIR. טמפרטורת פני השטח האמיתית של אזור העניין בעכברים ניתן להגיע סביב 57 °C (57 °F). כפי שמוצג באיור 5, כאשר נחשפים ל- AFM, ההדמיה התרמית של ריכוזים שונים של יונים (1.05 מ"ג / מ"ל, 1.35 מ"ג / מ"ל, 3.65 מ"ג / מ"ל, 5 מ"ג / מ"ל) היו מנוטרים על ידי מצלמה תרמית אינפרא אדום (איור 5A), ואת עקומות הטמפרטורה הגבוהה נרשמו והתו במרווחי זמן שונים (איור 5B). ביניהם, 1.35 מ"ג / מ"ל, 3.65 מ"ג / מ"ל ו 5 מ"ג / מ"ל IONPs יכול לחמם במהירות את הפתרון ולהגדיל את הטמפרטורה (20 °C (20 °C (50 °F), 30 °C (40 °F), בהתאמה) לאחר 10 דקות של אינדוקציה. התוצאות מראות תגובת שדה מגנטי לסירוגין האופיינית ל- NSMS.
בניסוי ההיפרתרמיה המגנטית in vivo, עכברים נחשפו ל- AFM בתדר של 415 קילו-הרץ והמשרעת המגנטית של 1.8 קילוואט/מ' למשך 10 דקות. תהליך החימום היה במעקב על ידי מצלמת הדמיה תרמית אינפרא אדום בזמן אמת(איור 6A, 6B). נצפו שינויי טמפרטורה משמעותיים בתחום העניין (איור 6). הטמפרטורה עלתה במהירות עם הזמן, עם תוספת של 50 °C (50 °F) במשך 10 דקות של אינדוקציה.
איור 1: שחרור יונים של NSMs ומבוקר של NSMs. (A) תמונת מיקרוסקופיה של NSMs. (B) התפלגות הקוטר של NSMs, n = 200. (C) התרשים של ציוד קולי המשמש בניסוי. (D) פרופילי שחרור מצטברים של יונים מ- NSMs תחת גירוי אולטרסאונד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מדידה פוטותרמית בתיווך ינותנים מימית. (A) אינפרא אדום תמונות תרמיות של ריכוזים שונים של IONPs לאחר 10 דקות של הקרנת לייזר ב 808 ננומטר עבור 1 W / cm2. (B) עקומות גובה טמפרטורה אופייניות בריכוזים שונים של יונים (808 ננומטר, 1 W /cm2, 10 דקות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מדידה פוטותרמית בתיווך יונטנים בתאי 4T1. (A) תמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות קונפוקליות של תאים חיים 4T1 לאחר דגירה 24 שעות עם ריכוזים שונים של יונים (מוכתמים עם Calcein-AM, ירוק). תאים שטופלו ב-NIR נחשפו ללייזר 808 ננומטר למשך 10 דקות (1 W/cm2). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (B) עקומות גובה טמפרטורה אופייניות בריכוזים שונים של יונים שטופלו בתאי 4T1 במשך 10 דקות של הקרנת NIR (1 W / cm2). (ג) כימות הכדאיות של תאי 4T1 דגירה עם יונים בריכוזים שונים עם או בלי טיפול NIR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מדידה פוטותרמית בתיווך יונטנים ב-vivo. (A) תמונות תרמיות אינפרא אדום של אזור העניין של העכבר חשוף לייזר NIR (808 ננומטר, 1 W / cm2, 10 דקות) שנתפסו במרווחי זמן שונים. (B) עקומות טמפרטורה גבוהות במרווחי זמן שונים לאחר טיפול לייזר NIR (808 ננומטר, 1 W/cm2, 10 דקות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מדידת היפרתרמיה מגנטית בתיווך ינות במדידת מימית. (A) תמונות תרמיות אינפרא אדום של ריכוזים שונים של פתרון IONPs תחת AFM בתדר של 415 kHz ואת המשרעת המגנטית של 1.8 kA/ m במשך 10 דקות. (B) עקומות טמפרטורה אופייניות של ריכוזים שונים של פתרון IONPs תחת AFM בתדר של 415 kHz ואת המשרעת המגנטית של 1.8 kA / m. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: היפרתרמיה מגנטית בתיווך יונטנים ב-vivo. (א) תמונות תרמיות אינפרא אדום של אזור העניין של העכברים שנתפסו במרווחי זמן שונים תחת ה- AFM בתדר של 415 קילו-הרץ והמשרעת המגנטית של 1.8 קילוואט/מ' למשך 10 דקות. (B) עקומות טמפרטורה גבוהות במרווחי זמן שונים תחת AFM בתדר של 415 קילו-הרץ והמשרעת המגנטית של 1.8 קילוואט/מ'. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן הצגנו פרוטוקול של ייצור מיקרו-חלקיקים המופגזים בתחמוצת ברזל (NSMs) באמצעות הרכבה עצמית, סינרגיה של תגובה מגנטית, אקוסטית ואופטית בפלטפורמה ננו-תרמית אחת. היונים נארזו בצפיפות סביב ליבת האוויר כדי ליצור מעטפת מגנטית, אשר ניתן לשלוט על ידי השדה המגנטי החיצוני עבור מיקוד. לאחר נמסר, שחרורו של יונס ניתן להשיג על ידי הדק אולטרסאונד. ניתן להפעיל את ה- IONPs המשוחררים הן על-ידי נורית NIR והן על-ידי AFM עבור PTT ו- MHT, או על-ידי שילוב של שניהם.
במהלך הפרוטוקול כולו, שלבי הסינתזה של NSMs ממלאים תפקיד חשוב, שהוא הבסיס לפרוטוקול כולו. יחד עם זאת, שחרור מבוקר של IONPs במבחנה אימת את התגובה האקוסטית של NSMs. הפרוטוקול של מדידה פוטותרמית בפתרון מימי ומדידת היפרתרמיה מגנטית בתמיסה מימית גם אימת את התגובה המגנטית והאופטית של NSMs בהתאמה.
על מנת להכין את NSMs בהצלחה, הפתרון של IONPs חייב להיות sonicated במשך 20 דקות לפני השימוש כדי להבטיח את הפיזור אפילו של IONPs במים. כאשר התסיסה בוצעה, הבדיקה homogenizer חייב להיות שקוע בפתרון לחלוטין. בעת לימוד תגובה אקוסטית של NSMs, צינור מדגם חייב להיות ממוקם על החלק העליון של המתמר ישירות ולמשוך את NSMs לתחתית הצינור על ידי המגנט כדי למנוע את ההנחתה של עוצמת אולטרסאונד. חוץ מזה, אם עליית הטמפרטורה לא הייתה משמעותית במהלך המדידה הפוטותרמית או מדידת היפרתרמיה מגנטית, זה יכול להיות כי המדגם לא היה במוקד של קרן הלייזר ולא במרכז סליל נחושת אינדוקציה מגנטי מקורר מים.
יש לציין כי לפרוטוקול עדיין יש כמה מגבלות. לדוגמה, למרות הקוטר הממוצע של NSMs מוכן היה דומה לקוטר של כמה microbubbles בשימוש קליני22 (עבור הדמיית אולטרסאונד), עם זאת, האחידות של גודל NSMs צריך להשתפר. בנוסף, זרימת הדם בדם צריכה להשתפר על ידי שינוי של משטח microbubble. מלבד זאת, טיפול סינרגטי לא אומת ב- vivo, והיעילות הטיפולית ב- vivo עדיין אינה ידועה.
אסטרטגיית המסירה המוצעת של IONPs לא רק להשיג את שחרור לפי דרישה של יננות, אלא גם לקדם את החדירה של יננות לתוך רקמת הגידול. נכון לעכשיו, לחץ הנוזלים הבין-כוכבי המוגבר בגידול ובסטרומה הגידול הצפוף מגבילים מאוד את יעילות אספקת הננו-חלקיקים5. לכן, פרוטוקול זה מספק אסטרטגיית חדירת רקמות לאספקת ננו-רפואה והוא בעל עניין רב בטיפול בסרטן.
הוכחנו גם כי PTT ו- MHT בתיווך IONPs יעילים הן במבחנה והן ב- in vivo. התוצאות הראו כי היונים היו המרה פוטותרמית טובה ויכולות המרה תרמית מגנטית ועשויים לנפח את הגידול ביעילות. השילוב של PTT ו- MHT הספיקו כדי להבטיח מוות מלא של תאים סרטניים ולשפר את יעילות נגד סרטן. בעתיד, טיפול תרמי כפול (כלומר, PTT ו- MHT) על ידי NSMs יספק אפשרות חדשה לטיפול בגידול מוצק עמוק במרפאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81601608) ו- NUPTSF (NY216024).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 808 nm laser power | Changchun New Industries Optoelectronics Tech | MDL-F-808-5W-18017023 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher SCIENTIFIC | C3099 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Function generator | Keysight | 33500B series | 20 MHz, 2 channels with arbitrary waveform generation capability |
| Gelatin gel | Sigma | 9000-70-8 | |
| Heating machine | Shuangping | SPG-06- II | |
| Homemade focused transducer | Frequency=855, R-X=36.2W+5.8W, |Z|-θ=37W+8° | ||
| Homogenizer | SCILOGEX | D-160 | 8000-30000 rpm |
| Hydrophone | T&C | NH1000 | |
| ICR male mice | OG Pharmaceutical. Co. Ltd | 8-week-old | |
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry | PerkinElmer | ||
| Infrared thermal imaging camera. | FLIR | E50 | |
| Iron(II,III) oxide | Alfa Aesar | 1317-61-9 | 50-100nm APS Powder |
| Laser power meter | Changchun New Industries Optoelectronics Tech | ||
| Oscilloscope | Keysight | DSOX3054T | Bandwidth 500 MHz, Sampling Rate 5 GS/S, 4 channels |
| RF Power Amplifier | T&C | AG1020 | The signal source can also be connected to an external signal source. The gain can be adjusted from 0 to 100%. It has multiple functions such as frequency sweep, pulse, and triangle. |
| Roswell Park Memorial Institute-1640 | KeyGEN BioTECH | KGM31800 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 151-21-3 |
References
- Kievit, F. M., Zhang, M. Cancer nanotheranostics: improving imaging and therapy by targeted delivery across biological barriers. Advanced Materials. 23 (36), 217-247 (2011).
- Wu, H., et al. Fe3O4-Based Multifunctional Nanospheres for Amplified Magnetic Targeting Photothermal Therapy and Fenton Reaction. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (2), 1045-1056 (2018).
- Thorat, N. D., et al. Physically stimulated nanotheranostics for next generation cancer therapy: Focus on magnetic and light stimulations. Applied Physics Reviews. 6 (4), 041306 (2019).
- Sun, Q., Zhou, Z., Qiu, N., Shen, Y. Design of Cancer Nanomedicine: Nanoproperty Integration and Synchronization. Advanced Materials. 29 (14), 1606628 (2017).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F.
- Anchordoquy, T. J., et al. Mechanisms and Barriers in Cancer Nanomedicine: Addressing Challenges, Looking for Solutions. ACS Nano. 11 (1), 12-18 (2017).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the "hot-spot" effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. of Iron Oxide Nanoparticles in Cancer Therapy: Amplification of Heating Efficiency by Magnetic Hyperthermia and Photothermal Bimodal Treatment. ACS Nano. 10 (2), 2436-2446 (2016).
- Rastinehad, A. R., et al. Gold nanoshell-localized photothermal ablation of prostate tumors in a clinical pilot device study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (37), 18590-18596 (2019).
- Sharma, S. K., Shrivastava, N., Rossi, F., Tung, L. D., Thanh, N. T. K. Nanoparticles-based magnetic and photo induced hyperthermia for cancer treatment. Nano Today. 29, 100795 (2019).
- Das, R., Rinaldi-Montes, N. Boosted Hyperthermia Therapy by Combined AC Magnetic and Photothermal Exposures in Ag/Fe3O4 Nanoflowers. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (38), 25162-25169 (2016).
- Yang, Y., et al. 1D Coordination Polymer Nanofibers for Low-Temperature Photothermal Therapy. Advanced Materials. 29 (40), 1703588 (2017).
- Curcio, A., et al. Iron Oxide Nanoflowers CuS Hybrids for Cancer Tri-Therapy: Interplay of Photothermal Therapy, Magnetic Hyperthermia and Photodynamic Therapy. Theranostics. 9 (5), 1288-1302 (2019).
- Espinosa, A., et al. Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and In Vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Xu, C., et al. Magnetic Hyperthermia Ablation of Tumors Using Injectable Fe(3)O(4)/Calcium Phosphate Cement. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (3), 13866-13875 (2015).
- Wilhelm, S., et al. Analysis of nanoparticle delivery to tumours. Nature Reviews Materials. 1, 16014 (2016).
- Chen, H., Zhang, W., Zhu, G., Xie, J., Chen, X.
- Rapoport, N. Y., Kennedy, A. M., Shea, J. E., Scaife, C. L., Nam, K. H. Controlled and targeted tumor chemotherapy by ultrasound-activated nanoemulsions/microbubbles. Journal of Controlled Release : The Official Journal of the Controlled Release Society. 138 (3), 268-276 (2009).
- Gao, Y., et al. Controlled nanoparticle release from stable magnetic microbubble oscillations. NPG Asia Materials. 8 (4), 260 (2016).
- Bao, B., et al. Mussel-inspired functionalization of semiconducting polymer nanoparticles for amplified photoacoustic imaging and photothermal therapy. Nanoscale. 11 (31), 14727-14733 (2019).
- Wu, H., et al. Enhanced Tumor Synergistic Therapy by Injectable Magnetic Hydrogel Mediated Generation of Hyperthermia and Highly Toxic Reactive Oxygen Species. ACS Nano. 13 (12), 14013-14023 (2019).
- Alzaraa, A., et al. Targeted microbubbles in the experimental and clinical setting. American Journal of Surgery. 204 (3), 355-366 (2012).
