Summary
Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von Eisenoxid-Nanopartikel-Mikroblasen (NSMs) durch Selbstorganisation, synergisierende magnetische, akustische und optische Reaktionsfähigkeit in einer nanotherapeutischen Plattform für magnetische Hyperthermie und photothermische Kombinationskrebstherapie vorgestellt.
Abstract
Die präzise Abgabe von Krebsmedikamenten, die auf eine gezielte und tief eindringende Abgabe sowie eine kontrollierte Freisetzung an der Tumorstelle abzielen, wurde in Frage gestellt. Hier stellen wir Eisenoxid-Nanopartikel-Schalen-Mikroblasen (NSMs) durch Selbstorganisation her, die magnetische, akustische und optische Reaktionsfähigkeit in einer nanotherapeutischen Plattform synergistisch kombiniert. Eisenoxid-Nanopartikel dienen sowohl als magnetische als auch als photothermische Mittel. Nach der intravenösen Injektion können NSMs magnetisch zur Tumorstelle geleitet werden. Ultraschall löst die Freisetzung von Eisenoxid-Nanopartikeln aus und erleichtert das Eindringen von Nanopartikeln tief in den Tumor aufgrund des Kavitationseffekts von Mikroblasen. Danach kann eine magnetische Hyperthermie und photothermische Therapie am Tumor zur Kombinationskrebstherapie durchgeführt werden, eine Lösung für die Krebsresistenz aufgrund der Tumorheterogenität. In diesem Protokoll wurde die Synthese und Charakterisierung von NSMs einschließlich struktureller, chemischer, magnetischer und akustischer Eigenschaften durchgeführt. Darüber hinaus wurde die Anti-Krebs-Wirksamkeit durch Thermaltherapie mit In-vitro-Zellkulturen untersucht. Die vorgeschlagene Verabreichungsstrategie und Kombinationstherapie ist in der Krebsbehandlung vielversprechend, um sowohl die Wirksamkeit der Verabreichung als auch der Krebsbekämpfung zu verbessern.
Introduction
Krebs ist eine der tödlichsten Krankheiten und verursacht jedes Jahr Millionen von Todesfällen weltweit und enorme wirtschaftliche Verluste1. In Kliniken können herkömmliche Krebstherapien wie chirurgische Resektion, Strahlentherapie und Chemotherapie immer noch keine zufriedenstellende therapeutische Wirksamkeit bieten2. Einschränkungen dieser Therapien sind hohe toxische Nebenwirkungen, hohe Rezidivrate und hohe Metastasierungsrate3. Zum Beispiel wird chemotherapien durch die geringe Abgabeeffizienz von Chemo-Medikamenten genau an die Tumorstelle4gelitten. Die Unfähigkeit von Medikamenten, über die biologischen Barrieren, einschließlich extrazellulärer Matrix und hohem interstitiellen Flüssigkeitsdruck des Tumors, tief in das Tumorgewebe einzudringen, ist ebenfalls für die geringe therapeutische Wirksamkeit verantwortlich5. Außerdem tritt die Tumorresistenz normalerweise bei den Patienten auf, die eine Behandlung durch eine einzige Chemotherapie erhalten haben6. Daher haben Techniken, bei denen eine thermische Ablation des Tumors auftritt, wie die photothermische Therapie (PTT) und die magnetische Hyperthermietherapie (MHT), vielversprechende Ergebnisse zur Verringerung der Tumorresistenz gezeigt und sind in klinischen Studienaufgetaucht 7,8,9.
PTT löst die thermische Ablation von Krebszellen durch die Wirkung photothermischer Umwandlungsmittel unter Der Bestrahlung der Laserenergie aus. Die erzeugte hohe Temperatur (über 50 °C) induziert eine vollständige Zellnekrose10. Vor kurzem wurde gezeigt, dass Eisenoxid-Nanopartikel (IONPs) ein photothermisches Umwandlungsmittel sind, das durch Nahinfrarotlicht (NIR) aktiviert werden kann11. Trotz des niedrigen molaren Absorptionskoeffizienten im nahen Infrarotbereich sind IONPs Kandidaten für eine photothermische Niedertemperaturtherapie (43 °C), eine modifizierte Therapie zur Verringerung der durch Hitzeeinwirkung auf normalem Gewebe verursachten Schäden und zur Einleitung einer Antitumorimmunität gegen Tumormetastasen12. Eine der Einschränkungen von PTT ist die geringe Eindringtiefe des Lasers. Bei tief sitzenden Tumoren ist die magnetische Wechselfeld-induzierte Erwärmung von Eisenoxid-Nanopartikeln, auch magnetische Hyperthermie genannt, eine alternative Therapie für PTT13,14. Der Hauptvorteil von MHT ist die hohe Durchdringung des Magnetfeldes15. Die erforderliche relativ hohe Konzentration von IONPs bleibt jedoch ein großer Nachteil für die klinische Anwendung. Die Abgabeeffizienz der Nanomedizin (oder Nanopartikel) an solide Tumore bei Tieren betrug 1-10% aufgrund einer Reihe von Hindernissen wie Zirkulation, Akkumulation und Penetration16,17. Daher ist eine kontrollierte und zielgerichtete IONPs-Verabreichungsstrategie mit der Fähigkeit, eine hohe Gewebepenetration zu erreichen, in der Krebsbehandlung von großem Interesse.
Die ultraschallvermittelte Nanopartikelabgabe hat ihre Fähigkeit gezeigt, das Eindringen von Nanopartikeln tief in das Tumorgewebe zu erleichtern, aufgrund des Phänomens, das als Mikroblasenkavitation bezeichnet wird18,19. In der vorliegenden Studie stellen wir IONPs Shelled Microbubbles (NSMs) durch Selbstorganisation her, synergisierende magnetische, akustische und optische Reaktionsfähigkeit in einer nanotherapeutischen Plattform. Das NSM enthält einen Luftkern und eine Hülle aus Eisenoxid-Nanopartikeln mit einem Durchmesser von etwa 5,4 μm. Die NSMs können magnetisch zur Tumorstelle geführt werden. Dann wird die Freisetzung von IONPs durch Ultraschall ausgelöst, begleitet von Mikroblasenkavitation und Microstreaming. Der impulserte Microstreaming erleichtert das Eindringen von IONPs in das Tumorgewebe. PTT und MHT können durch NIR-Laserbestrahlung oder AFM-Anwendung oder durch die Kombination von beidem erreicht werden.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen durchgeführt, die von den OG Pharmaceutical Guidelines for Animal Care and Use of Laboratory Animals genehmigt wurden. Die Protokolle folgten den Richtlinien der Ethikkommission für Versuchstiere von OG Pharmaceutical.
1. Synthese von Nanopartikel-Schalen-Mikroblasen (NSMs)
- Dispergieren Sie magnetische Nanopartikel(Fe3O4,Eisenoxid) in entionisiertem Wasser zu einer 10 mg/ml Stammlösung.
- Legen Sie das Röhrchen mit der IONPs-Lösung für 20 Minuten in eine Ultraschallreinigungsmaschine. Erhalten Sie vor Gebrauch eine gleichmäßig dispergierte IONPs-Lösung.
- Fügen Sie 150 μL entionisiertes Wasser, 150 μL 10 mM Natriumdodecylsulfat (SDS) und 400 μL eine Stammlösung von IONPs aus Schritt 1.1 hinzu. im 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.
- Befestigen Sie den Homogenisator mit einem Gerüst in einem Eisbad.
- Legen Sie das Röhrchen der Mischung in ein Eisbad und positionieren Sie die Homogenisatorsonde genau so, dass sie in die Mischungslösung eingetaucht werden soll.
- Stellen Sie die Homogenisatordrehzahl auf 20.000 U/min ein und schalten Sie den Homogenisator für 3 min ein.
- Schalten Sie den Homogenisator aus und entfernen Sie das Röhrchen aus dem Eisbad.
- Legen Sie das Rohr zur 12-1-Stunden-Stabilisierung bei Raumtemperatur in das Rohrgestell.
- Adsorbieren Sie die resultierenden NSMs durch einen Magneten an der Rohrwand und entfernen Sie den Überstand. Dann mit 1 ml frischem entionisiertem Wasser auffüllen.
- Wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal und suspendieren Sie NSMs in 1 ml frischem destilliertem Wasser erneut.
- 10 μL NSMs-Suspension nach leichtem Schütteln auf einen sauberen Glasträger übertragen.
- Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit 20-facher Vergrößerung, um die Morphologie von NSMs zu visualisieren. Stellen Sie sicher, dass Sie Fotos in einem zufälligen Bereich aufnehmen.
- Messen Sie den Durchmesser der NSMs aus den Fotos mit einer Open-Access-Software Nano Measurer 1.2. Zählen Sie mindestens 200 Mikroblasen.
- Klicken Sie auf "Datei" und "Öffnen", um die zu bearbeitende Bilddatei auszuwählen. Nachdem das Bild importiert wurde, drücken Sie dasLineal. Zeichnen Sie eine rote Linie mit der gleichen Länge wie das Lineal.
- Drücken Sie dann die | "Einstellungen" "Lineal" und geben Sie die Länge des Lineals ein. Zeichnen Sie Linien der gleichen Länge wie die Durchmesser der einzelnen Mikroblasen im Bild. Schließen Sie alle Messungen ab und klicken Sie dann auf "Bericht" | " Bericht anzeigen".
2. Akustische Reaktion von NSMs
- 200 μL NSMs mit 800 μL entionisiertem Wasser verdünnen und dann in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen geben, um eine Stammlösung zu bilden.
- Schließen Sie den Funktionsgenerator, den Verstärker, die Impedanzanpassung und den hausgemachten fokussierten Wandler an. Platzieren Sie den Schallkopf in der Mitte an der Unterseite der künstlichen Quadersenke und verbinden Sie das Hydrophon mit einem Oszilloskop, um die Ultraschallintensität zu überwachen (Abbildung 1). Fügen Sie entionisiertes Wasser in die Spüle hinzu, um den Wandler einzutauchen.
- Stellen Sie den Funktionsgenerator auf den Sweep-Modus ein, stimmen Sie den Frequenzbereich von 10 kHz bis 900 kHz ab und stellen Sie die Amplitude auf 20 Vpp (Spannungsspitze-Spitze) ein. Stellen Sie die Leistung des Ultraschalls durch den Verstärker auf 0,1% ein. Die Dauer jedes Zyklus beträgt 4 s mit einem Zeitintervall von 1 s.
- Bereiten Sie 1 ml NSMs Stammlösungsproben im Röhrchen vor und befestigen Sie das Röhrchen mit einem Gerüst auf der Oberseite des hausgemachten fokussierten Wandlers. Befestigen Sie den Magneten an der Unterseite des Rohrs und ziehen Sie die NSMs an.
- Schalten Sie die Leistung des Funktionsgenerators und des Verstärkers ein. Schalten Sie den Funktionsgenerator nach Anwendung von 5 Zyklen (25 s) Ultraschall aus. Entfernen Sie den Magneten und sammeln Sie 1 ml der Lösung, die die freigesetzten IONPs enthält. Fügen Sie 1 ml entionisiertes Wasser in das Zentrifugenrohr hinzu.
- Wiederholen Sie Schritt 2.5. bis NSMs in der Röhre vollständig kollabieren.
- Quantifizieren Sie alle freigesetzten IONPs durch die optische Emissionsspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES), wie zuvor beschrieben13.
3. Optische Reaktion von NSMs
HINWEIS: In dieser Arbeit wird ein Lasersystem mit 808 nm Laserleistung und einer Infrarot-Wärmebildkamera verwendet, die zuvor von Xu et al. beschrieben wurde20.
- Lasersystemvorbereitung
- Schalten Sie die Stromversorgung des Lasers ein und lassen Sie ihn einige Minuten erwärmen. Befestigen Sie eine fasergekoppelte 808 nm Laserdiode auf einem Retortenständer.
- Richten Sie den Laserstrahl durch eine optische Faser auf die Probenstufe und konzentrieren Sie sich auf die Probenstufe, um durch eine konvexe Linse einen Lichtfleck von 6 mm (im Durchmesser) zu erreichen.
- Messen Sie die Ausgangsleistung mit einem Laserleistungsmesser und stellen Sie die Leistung auf 1 W/cm2ein.
- Befestigen Sie die Infrarot-Wärmebildkamera auf dem Stativ. Schalten Sie die Kamera ein und überprüfen Sie, ob sie funktioniert (z. B. überwachen Sie die Temperatur des fokussierten Interessenbereichs (ROI). Schalten Sie das Netzteil und die Infrarot-Wärmebildkamera aus.
- Photothermische Messung in wässriger Lösung
- Die 1-ml-Probe wird in verschiedenen IONPs-Konzentrationen (1,05 mg/ml, 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml, 5 mg/ml) in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen zubereitet.
- Platzieren Sie das interessierende Röhrchen im fokussierten Bereich des Laserstrahls und zeichnen Sie die Basistemperatur der Probe auf.
- Schalten Sie die Laserleistung und die Infrarot-Wärmebildkamera ein und bestrahlen Sie die Probe 10 Minuten lang ununterbrochen. Gleichzeitig zeichnen Sie die Temperatur in Echtzeit auf.
- Schalten Sie die Laserleistungs- und Infrarot-Wärmebildkamera nach 10 Minuten Bestrahlung aus. Warten Sie, bis die Temperatur des Bereichs zum Ausgangswert zurückgekehrt ist.
- Wiederholen Sie 3.2.2 bis 3.2.4 für die Messung anderer Proben.
HINWEIS: Verwenden Sie entionisiertes Wasser bei 20 °C als Kontrolle für die photothermische Messung.
- Photothermische Messung in kultivierten Zellen
HINWEIS: Murine Brustkrebszellen (4T1) wurden als Modell ausgewählt, um den Hemmwirkung durch photothermische Behandlung zu untersuchen.- Füttern Sie die Zellen mit Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin. Stellen Sie die Kultivierungsumgebung auf 37 °C und 5% CO2 ein.
- Kultur 4T1-Zellen in T25-Kolben und Durchgang der Zellen im Verhältnis 1:2, wenn 90% Konfluenz erreicht ist.
HINWEIS: Das Subkulturverhältnis kann entsprechend den spezifischen Zellbedingungen in verschiedenen Laboren angepasst werden. - Entfernen und verwerfen Sie das Kulturmedium. Spülen Sie die Zellschicht mit 1x PBS-Lösung aus, um das Restserum, das Trypsinhemmer enthält, zu entfernen.
- 2 ml Trypsin-EDTA-Lösung (0,25%) zum Ablösen in den Kolben geben. Dann fügen Sie 3 ml 1640 Medium hinzu und saugen Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren an.
- Sammeln Sie 5 ml der Zellsuspension und Zentrifuge bei 500 x g für 3 min.
- Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml frisches 1640-Medium hinzu, um eine Zellsuspension zu bilden.
- 100 μL der Zellsuspension werden in eine konfokale Schale mit 1 ml des Kulturmediums geben. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration der Zellsuspension 9 x10 5/ ml beträgt und die endgültige Zellkonzentration in der konfokalen Zellkulturschale 8,1 x 104/ ml beträgt.
- Stellen Sie die geimpfte konfokale Zellkulturschale für 24 h in einen Inkubator.
- Verdünnen Sie verschiedene Konzentrationen (1,05 mg/ml, 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml, 5 mg/ml) der IONPs-Probe, um 1 ml Lösung mit serumfreiem 1640-Medium herzustellen.
- Saugen Sie das Kulturmedium aus der konfokalen Schale ab und fügen Sie die vorbereitete Probenlösung hinzu.
- Schalten Sie die Laserleistung ein. Fokussieren Sie den Laserstrahl in der Mitte der Schüssel und stellen Sie die Ausgangsleistung auf 1 W/cm2ein. Schalten Sie die Infrarot-Wärmebildkamera ein, bestrahlen Sie die Zellen in der konfokalen Schüssel für 10 Minuten ununterbrochen. Zeichnen Sie die Temperatur in Echtzeit für die fokussierte Region auf.
- Schalten Sie die Laser- und Infrarot-Wärmebildkamera aus. Die bestrahlte Schale für weitere 24 h in den Inkubator geben.
- Entfernen und entsorgen Sie das Kulturmedium, fügen Sie 1 ml des frischen Kulturmediums in die konfokale Schale hinzu. 5 μL Calcein-AM-Lösung (1 mg/ml) in die Schüssel geben.
- Die konfokale Schale bei 37 °C und 5% CO2 für 15 min inkubieren. Spülen Sie die Zellschicht zweimal mit 1x PBS-Lösung aus.
- Beobachten und bilden Sie die Zellen mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 500-540 nm ab.
- Wählen Sie 5 Bereiche in den konfokalen Bildern zufällig aus und zählen Sie die Anzahl der lebenden 4T1-Zellen in jedem Bereich manuell. Quantifizieren Sie die Lebensfähigkeit von 4T1-Zellen, indem Sie die Anzahl der lebenden Zellen in allen experimentellen Gruppen mit der Kontrollgruppe vergleichen.
HINWEIS: Verwenden Sie das serumfreie Medium 1640 bei 20 °C als Kontrolle für die photothermische Messung. Verwenden Sie die Probe ohne Laserbestrahlung als Kontrollgruppe für die Zelllebensfähigkeit.
- Photothermische Messung in vivo
- Bereiten Sie 3 von 8 Wochen alten männlichen ICR-Mäusen mit einem Durchschnittsgewicht von 25 ± 2 g vor.
- Fügen Sie 2 g Gelatinepulver zu 20 ml entionisiertem Wasser hinzu. Die Lösung auf 40 - 50 °C erhitzen, das Gelatinegel vollständig auflösen, um eine transparente und klare Lösung zu bilden.
- 100 mg IONPs werden der Lösung aus 3.4.2 hinzugefügt.
- Das Gel auf 40 – 50 °C erhitzen, sofort 500 μL der Gelatinelösung in das rechte Brustpolster der Maus injizieren.
- Schalten Sie die Laserleistung ein und fokussieren Sie den Laserstrahl auf den Interessenbereich (rechtes Brustpolster der Mäuse). Stellen Sie die Ausgangsleistung auf 1 W/cm2 ein. Schalten Sie die Infrarot-Wärmebildkamera ein, bestrahlen Sie den Interessenbereich 10 Minuten lang ununterbrochen. Zeichnen Sie die Temperatur der interessierenden Region in Echtzeit auf.
- Schalten Sie die Laser- und Infrarot-Wärmebildkamera aus.
- Einschläfern von Mäusen durch CO 2-Erstickung und Zervixwirbelluxation oder eine andere vom Tierversuchsausschuss des Instituts genehmigte Methode.
4. Magnetische Hyperthermiemessung
HINWEIS: Hier wird ein zuvor von Wu et al. beschriebenes magnetisches Hyperthermiesystem verwendet (21).
- Bereiten Sie ein magnetisches Hyperthermiesystem vor, das einen AFM-Generator (Alternating Magnetic Field) und eine Infrarot-Wärmebildkamera umfasst.
- Schalten Sie die Kältemaschine für 10 Minuten ein und schalten Sie dann die moderate Hochfrequenz-Heizmaschine (z. B. AFM-Generator) ein.
- Stellen Sie die Parameter der Maschine wie folgt ein: Frequenz (f) = 415 kHz, Magnetfeldintensität = 1,8 kA/m.
- Magnetische Hyperthermiemessung in wässriger Lösung
- 1 ml der Probe in unterschiedlicher IONPs-Konzentration (1,05 mg/ml, 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml, 5 mg/ml) in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen vorbereiten.
- Legen Sie das Rohr in die Mitte einer wassergekühlten magnetischen Induktionskupferspule.
- Schalten Sie das magnetische Wechselfeld (AFM) und die Infrarot-Wärmebildkamera ein. Induzieren Sie die Probe für 10 min kontinuierlich und zeichnen Sie die Temperatur in Echtzeit auf.
HINWEIS: Die Kamera befindet sich oben in der Probe und liefert eine Querschnittsansicht der Probe. - Schalten Sie das AFM und die Infrarot-Wärmebildkamera aus. Warten Sie, bis die Temperatur der Kupferspule 10 Minuten lang wieder auf die Basislinie zurückgekehrt ist.
HINWEIS: Achten Sie auf hohe Temperaturen, vermeiden Sie direkten Kontakt mit den Händen und warten Sie auf die Kühlung, bevor Sie Proben entfernen. - Wiederholen Sie 4.2.2 bis 4.2.4 für die Messung der anderen Proben.
- Schalten Sie die moderate Hochfrequenz-Heizmaschine (AFM) und den Kühler aus.
HINWEIS: Verwenden Sie das entionisierte Wasser bei 20 °C als Kontrolle für die magnetische Hyperthermiemessung.
- Magnetische Hyperthermiemessung in vivo
- Bereiten Sie 3 von 8 Wochen alten männlichen ICR-Mäusen mit einem Durchschnittsgewicht von 25 ± 2 g vor.
- Bereiten Sie 20 ml 10 % Gelatinegel mit 5 mg/ml IONPs-Lösung vor.
- Das Gelatinegel auf 40 - 50 °C erhitzen, sofort 500 μL der Gelatinelösung in das rechte Brustpolster des Tieres injizieren.
HINWEIS: Magnetisch induzierte Hyperthermie-Experimente wurden mit der Heizmaschine unter Verwendung der gleichen Parameter wie der In-vitro-Test durchgeführt. - Schalten Sie das magnetische Wechselfeld (AFM) und die Infrarot-Wärmebildkamera ein. Legen Sie das rechte Brustpolster der Mäuse in die Mitte einer wassergekühlten magnetischen Induktionskupferspule.
- Schalten Sie die Infrarot-Wärmebildkamera ein, nehmen Sie die Interessenregion (rechtes Brustpolster der Mäuse) 10 Minuten lang kontinuierlich ab und zeichnen Sie die Temperatur der Interessenregion in Echtzeit auf.
- Schalten Sie den Netzschalter der Maschine und der Infrarot-Wärmebildkamera nach 10 Minuten Induktion aus. Warten Sie, bis die Temperatur der Kupferspule für 10 Minuten zum Ausgangswert zurückgekehrt ist.
- Wiederholen Sie 4.3.4 bis 4.3.6 für die Messung anderer Proben.
- Schalten Sie die moderate Hochfrequenz-Heizmaschine (AFM) und den Kühler aus.
HINWEIS: Achten Sie auf hohe Temperaturen, vermeiden Sie direkten Kontakt mit den Händen und warten Sie auf die Kühlung, bevor Sie Proben entfernen. - Einschläfern von Mäusen durch CO 2-Erstickung und Zervixwirbelluxation oder eine andere vom Tierversuchsausschuss des Instituts genehmigte Methode.
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Representative Results
Die in dieser Studie verwendeten dreifach ansprechenden Nanopartikel-Schalen-Mikroblasen (NSMs) wurden durch Rühren der Mischung aus Tensid und IONPs hergestellt. Die IONPs (50 nm) setzten sich an der Grenzfläche von Flüssigkeits- und Gaskern selbst zusammen, um eine dicht gepackte magnetische Hülle zu bilden. Die Morphologie von NSMs ist in Abbildung 1Adargestellt. Die resultierenden NSMs wiesen eine Kugelform und einen durchschnittlichen Durchmesser von 5,41 ± 1,78 μm auf (Abbildung 1B). Die Ergebnisse zeigten, dass die NSMs erfolgreich vorbereitet wurden. Bei lagerung in Wasser blieben die Mikroblasen mehr als 1 Jahr intakt und waren in Puffern und Zellkulturmedium für mindestens 10 Tage stabil19. Wie in Abbildung 1Dgezeigt, wurde eine schrittweise Freisetzung von Fe mit der Erhöhung der Anzahl der Zyklen des angewandten Ultraschalls erreicht. Nach 10 Zyklen wurden ca. 20% des Fe freigesetzt. Bis zu 50 Ultraschallzyklen erreichte die Menge an freigesetztem Fe ein Plateau von etwa 80%. Diese Ergebnisse deuteten auf die On-Demand-Freisetzung von IONPs durch einen externen Ultraschallauslöser hin.
Die IONPs-vermittelte photothermische Messung in wässriger Lösung ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Temperatur von IONPs stieg mit zunehmender Bestrahlungszeit schnell an, wie in Abbildung 2A,Bgezeigt. Eine Temperaturerhöhung von 30 °C konnte erreicht werden, wenn man 10 min lang einem NIR-Laser (808 nm,1W/cm2)bei einer Fe-Konzentration von 5 mg/ml ausgesetzt wurde.
Die von PTT erzeugte Wärme könnte die Krebszellen abtöten. Die Lebensfähigkeit der 4T1-Zelle mittels PTT wurde mittels NIR-Laserbehandlung (808 nm, 1W/cm2)für 10 min untersucht. Wie in Abbildung 3A,B, im Vergleich zur Kontrollgruppe gezeigt, gab es keinen Unterschied in der Morphologie und der Anzahl der lebenden Zellen, wenn sie mit einer hohen Konzentration von Fe (5 mg/ml) inkubiert wurden, was auf eine gute Bioverfügbarkeit von IONPs hindeutet. Nach der Bestrahlung mit dem NIR-Laser wurden die Zellen rund geformt, was auf Apoptose hindeutet. Die Quantifizierung der lebenden Zellzahl, d.h. der Lebensfähigkeit von Zellen, ist in Abbildung 3C dargestellt. Die Zellen, die mit hoher IONPs-Konzentration (3,65 mg/ml und 5 mg/ml) unter NIR-Bestrahlung inkubiert wurden, hatten die höchste Sterberate, die bei etwa 80% bzw. 100% liegt. Die mit niedriger IONPs-Konzentration (1,025 mg/ml und 1,35 mg/ml) behandelte Gruppe zeigte eine ähnliche Tötungseffizienz wie etwa 40%. Die Ergebnisse zeigen, dass die photothermische Wirkung von NSMS Krebs effektiv behandeln kann.
Wie in Abbildung 4A,Bgezeigt, stieg die Temperatur des Gelatineinjektionsbereichs nach 5 min NIR-Bestrahlung schnell um etwa 20 °C an. Die reale Oberflächentemperatur des interessierenden Gebiets bei Mäusen konnte auf etwa 57 °C erreicht werden. Wie in Abbildung 5gezeigt, wurden bei Exposition gegenüber dem AFM die Wärmebildgebung verschiedener Konzentrationen von IONPs (1,05 mg/ml, 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml, 5 mg/ml) mit einer Infrarot-Wärmebildkamera überwacht (Abbildung 5A), und die erhöhten Temperaturkurven wurden aufgezeichnet und in verschiedenen Zeitintervallen aufgezeichnet und aufgezeichnet (Abbildung 5B). Unter ihnen konnten die IONPs mit 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml und 5 mg/ml die Lösung schnell erhitzen und die Temperatur (20 °C, 30 °C, 40 °C) nach 10 min Induktion erhöhen. Die Ergebnisse zeigen eine magnetische Wechselfeldantwort, die für NSMS charakteristisch ist.
Im in vivo magnetischen Hyperthermie-Experiment wurden Mäuse 10 min lang mit AFM mit einer Frequenz von 415 kHz und der magnetischen Amplitude von 1,8 kA/m exponiert. Der Erwärmungsprozess wurde von einer Infrarot-Wärmebildkamera in Echtzeit überwacht (Abbildung 6A, 6B). Signifikante Temperaturänderungen des Interessengebietes wurden beobachtet (Abbildung 6). Die Temperatur stieg mit der Zeit schnell an, mit einem Anstieg von 50 °C für 10 minuten Induktion.
Abbildung 1: Charakterisierung und kontrollierte IONPs-Freisetzung der NSMs. (A) Repräsentatives Hellfeldmikroskopiebild von NSMs. Maßstabsbalken: 20 μm. (B) Die Durchmesserverteilung der NSMs, n = 200. (C) Diagramm der im Experiment verwendeten Ultraschallgeräte. (D) Kumulative Freisetzungsprofile von IONPs aus NSMs unter Ultraschallstimulation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: IONPs-vermittelte photothermische Messung in wässrigen. (A) Infrarot-Wärmebilder unterschiedlicher Konzentrationen von IONPs nach 10 min Laserbestrahlung bei 808 nm für 1 W/cm2. (B) Typische Temperaturhöhenkurven unterschiedlicher Konzentrationen von IONPs (808 nm, 1 W/cm2,10 min). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: IONPs-vermittelte photothermische Messung in 4T1-Zellen. (A) Konfokale Fluoreszenzmikroskopieaufnahmen von lebenden 4T1-Zellen nach 24h-Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen von IONPs (gefärbt mit Calcein-AM, grün). NIR-behandelte Zellen wurden 10 min (1W/cm2)mit dem 808-nm-Laser exponiert. Maßstabsleiste: 50 μm. (B) Typische Temperaturhöhenkurven verschiedener Konzentrationen von IONPs behandelten 4T1 Zellen für 10 min NIR-Bestrahlung (1 W/cm2). (C) Quantifizierung der Lebensfähigkeit von 4T1-Zellen, die mit IONPs in verschiedenen Konzentrationen mit oder ohne NIR-Behandlung inkubiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: IONPs-vermittelte photothermische Messung in vivo. (A) Infrarot-Wärmebilder des Interessenbereichs der Maus, die dem NIR-Laser ausgesetzt wurde (808 nm, 1 W/cm2,10 min), aufgenommen in verschiedenen Zeitintervallen. (B) Erhöhte Temperaturkurven in verschiedenen Zeitintervallen nach NIR-Laserbehandlung (808 nm, 1 W/cm2,10 min). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: IONPs-vermittelte magnetische Hyperthermiemessung in wässrigen. (A) Infrarot-Wärmebilder unterschiedlicher Konzentrationen von IONPs-Lösung unter dem AFM bei der Frequenz von 415 kHz und der magnetischen Amplitude von 1,8 kA/m für 10 min. (B) Typische Temperaturkurven verschiedener Konzentrationen von IONPs-Lösung unter dem AFM bei der Frequenz von 415 kHz und der magnetischen Amplitude von 1,8 kA/m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: IONPs-vermittelte magnetische Hyperthermie in vivo. (A) Infrarot-Wärmebilder des Interessenbereichs der Mäuse, die in verschiedenen Zeitintervallen unter dem AFM mit der Frequenz von 415 kHz und der magnetischen Amplitude von 1,8 kA/m für 10 min aufgenommen wurden. (B) Erhöhte Temperaturkurven in verschiedenen Zeitintervallen unter AFM bei der Frequenz von 415 kHz und der magnetischen Amplitude von 1,8 kA/m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier präsentierten wir ein Protokoll zur Herstellung von Eisenoxid-Nanopartikel-Schalen-Mikroblasen (NSMs) durch Selbstorganisation, Synergie von magnetischer, akustischer und optischer Reaktionsfähigkeit in einer nanotherapeutischen Plattform. Die IONPs wurden dicht um den Luftkern gepackt, um eine magnetische Hülle zu bilden, die durch das externe Magnetfeld zum Zielen gesteuert werden kann. Einmal abgegeben, kann die Freisetzung von IONPs durch Ultraschallauslöser erreicht werden. Die freigesetzten IONPs können sowohl durch NIR light als auch afM für PTT und MHT oder die Kombination aus beiden aktiviert werden.
Während des gesamten Protokolls spielen die Syntheseschritte von NSMs eine wichtige Rolle, die die Grundlage des gesamten Protokolls ist. Gleichzeitig validierte die kontrollierte Freisetzung von IONPs in vitro die akustische Reaktion von NSMs. Das Protokoll der photothermischen Messung in wässriger Lösung und der magnetischen Hyperthermiemessung in wässriger Lösung validierte auch die magnetische bzw. optische Reaktion von NSMs.
Um die NSMs erfolgreich vorzubereiten, muss die Lösung von IONPs vor der Verwendung 20 min lang beschallt werden, um die gleichmäßige Dispersion von IONPs im Wasser zu gewährleisten. Wenn das Rühren durchgeführt wurde, muss die Homogenisatorsonde vollständig in die Lösung eingetaucht werden. Bei der Untersuchung der akustischen Reaktion von NSMs muss das Probenröhrchen direkt auf die Oberseite des Wandlers gelegt werden und die NSMs durch den Magneten an den Boden des Röhrchens ziehen, um die Dämpfung der Ultraschallintensität zu verhindern. Wenn der Temperaturanstieg während der photothermischen Messung oder der magnetischen Hyperthermiemessung nicht signifikant war, kann dies darauf hindeuten, dass sich die Probe weder im Fokus des Laserstrahls noch im Zentrum einer wassergekühlten magnetischen Induktionskupferspule befand.
Es sollte beachtet werden, dass das Protokoll noch einige Einschränkungen hat. Zum Beispiel, obwohl der mittlere Durchmesser der vorbereiteten NSMs ähnlich dem Durchmesser einiger klinisch verwendeter Mikroblasen22 (für Ultraschallbildgebung) war, muss die Gleichmäßigkeit der NSM-Größe verbessert werden. Darüber hinaus sollte die Zirkulation von NSMs im Blut durch Modifikation der Mikroblasenoberfläche verbessert werden. Abgesehen davon wurde die synergisierende Therapie in vivo nicht nachgewiesen, und die therapeutische Wirksamkeit in vivo ist noch unbekannt.
Die vorgeschlagene IONPs-Verabreichungsstrategie erreicht nicht nur die On-Demand-Freisetzung von IONPs, sondern fördert auch das Eindringen von IONPs in das Tumorgewebe. Derzeit schränken der erhöhte interstitielle Flüssigkeitsdruck im Tumor und das dichte Tumorstroma die Nanopartikelabgabeeffizienz starkein 5. Daher bietet dieses Protokoll eine gewebedurchdringende Strategie für die nanomedizinische Verabreichung und ist von großem Interesse an der Krebsbehandlung.
Wir haben auch gezeigt, dass IONPs-vermittelte PTT und MHT sowohl in vitro als auch in vivo wirksam sind. Die Ergebnisse zeigten, dass die IONPs eine gute photothermische Umwandlung und magnetische thermische Umwandlungsfähigkeiten hatten und Tumore effizient abtrünnig abtüngen konnten. Die Kombination von PTT und MHT reichte aus, um den vollständigen Krebszelltod zu gewährleisten und die Wirksamkeit gegen Krebs zu verbessern. In Zukunft wird die duale Thermaltherapie (d.h. PTT und MHT) durch NSMs eine neue Option für die Behandlung von tief sitzenden soliden Tumoren in Kliniken bieten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81601608) und NUPTSF (NY216024) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 808 nm laser power | Changchun New Industries Optoelectronics Tech | MDL-F-808-5W-18017023 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher SCIENTIFIC | C3099 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Function generator | Keysight | 33500B series | 20 MHz, 2 channels with arbitrary waveform generation capability |
| Gelatin gel | Sigma | 9000-70-8 | |
| Heating machine | Shuangping | SPG-06- II | |
| Homemade focused transducer | Frequency=855, R-X=36.2W+5.8W, |Z|-θ=37W+8° | ||
| Homogenizer | SCILOGEX | D-160 | 8000-30000 rpm |
| Hydrophone | T&C | NH1000 | |
| ICR male mice | OG Pharmaceutical. Co. Ltd | 8-week-old | |
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry | PerkinElmer | ||
| Infrared thermal imaging camera. | FLIR | E50 | |
| Iron(II,III) oxide | Alfa Aesar | 1317-61-9 | 50-100nm APS Powder |
| Laser power meter | Changchun New Industries Optoelectronics Tech | ||
| Oscilloscope | Keysight | DSOX3054T | Bandwidth 500 MHz, Sampling Rate 5 GS/S, 4 channels |
| RF Power Amplifier | T&C | AG1020 | The signal source can also be connected to an external signal source. The gain can be adjusted from 0 to 100%. It has multiple functions such as frequency sweep, pulse, and triangle. |
| Roswell Park Memorial Institute-1640 | KeyGEN BioTECH | KGM31800 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 151-21-3 |
References
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