Summary
Burada sunulan, manyetik hipertermi ve fototermal kombinasyon kanser tedavisi için bir nanoterapötik platformda kendi kendine montaj, sinerjik manyetik, akustik ve optik yanıt verme yoluyla demir oksit nanopartikül kabuklu mikrobubbles (NSM) imalatı için bir protokoldür.
Abstract
Tümör alanında kontrollü bir salınımın yanı sıra hedefe yönelik ve derinlemesine nüfuz eden doğumu hedefleyen anti-kanser ajanlarının hassas bir şekilde teslimine karşı çıkıldı. Burada, demir oksit nanopartikül kabuklu mikrobubbles (NSM' ler) kendi kendine montaj yoluyla, manyetik, akustik ve optik yanıt hızını tek bir nanoterapötik platformda sinerjik hale geliyoruz. Demir oksit nanopartiküller hem manyetik hem de fototermal ajanlar olarak hizmet eder. İntravenöz enjekte edildikten sonra, NSM'ler manyetik olarak tümör bölgesine yönlendirilebilir. Ultrason, demir oksit nanopartiküllerinin salınımını tetikleyerek, mikrobubbles kavitasyon etkisi nedeniyle nanopartiküllerin tümörün derinliklerine nüfuz etmesini kolaylaştırır. Daha sonra, tümör heterojenliği nedeniyle kanser direnci için bir çözüm olan kombinasyon kanseri tedavisi için tümör üzerinde manyetik hipertermi ve fototermal tedavi yapılabilir. Bu protokolde NSM'lerin yapısal, kimyasal, manyetik ve akustik özellikleri içeren sentezi ve karakterizasyonu gerçek gerçekleştirildi. Ayrıca in vitro hücre kültürleri kullanılarak termal tedavi ile anti-kanser etkinliği araştırılmıştır. Önerilen doğum stratejisi ve kombinasyon tedavisi, kanser tedavisinde hem doğum hem de antikanser etkinliklerini iyileştirmek için büyük umut vaat ediyor.
Introduction
Kanser, dünya çapında her yıl milyonlarca ölüme ve büyük ekonomik kayıplara neden olan en ölümcül hastalıklardan biridir1. Kliniklerde, cerrahi rezeksiyon, radyoterapi ve kemoterapi gibi geleneksel antikanser tedavileri hala tatmin edici bir terapötik etkinlik sağlayamamaktadır2. Bu tedavilerin sınırlamaları yüksek toksik yan etkiler, yüksek nüks oranı ve yüksek metastaz oranı3'tür. Örneğin, kemoterapi kemoterapi ilaçlarının tümör bölgesine tam olarak düşük doğum verimliliğinden muzdariptir4. İlaçların hücre dışı matris ve yüksek tümör geçiş sıvısı basıncı da dahil olmak üzere biyolojik bariyerler boyunca tümör dokusunun derinliklerine nüfuz edememesi de düşük terapötik etkinlikten sorumludur5. Ayrıca tümör direnci genellikle tek kemoterapi ile tedavi gören hastalarda olur6. Bu nedenle fototermal tedavi (PTT) ve manyetik hipertermi tedavisi (MHT) gibi tümörün termal ablasyonunun meydana geldiği teknikler tümör direncini azaltmak için umut verici sonuçlar vermiş ve klinik çalışmalarda ortaya çıkmaktadır7,8,9.
PTT, lazer enerjisinin ışınlanması altında fototermal dönüşüm ajanlarının etkisiyle kanser hücrelerinin termal ablasyonunu tetikler. Üretilen yüksek sıcaklık (50 °C'nin üzerinde) tam hücre nekrozuna neden olur10. Çok yakın zamanda, demir oksit nanopartiküllerinin (İYONP'ler) yakın kızılötesi (NIR) ışık11ile etkinleştirilebilen bir fototermal dönüşüm ajanı olduğu gösterilmiştir. Yakın kızılötesi bölgedeki düşük azı dişi emilim katsayısına rağmen, İYONP'ler düşük sıcaklık (43 °C) fototermal tedavi, normal dokulara ısı maruziyetinin neden olduğu hasarı azaltmak ve tümör metastazına karşı antitümör bağışıklığı başlatmak için modifiye bir tedavi için adaydır12. PTT'nin sınırlamalarından biri lazerin düşük penetrasyon derinliğidir. Derin oturmuş tümörler için manyetik hipertermi olarak da adlandırılan demir oksit nanopartiküllerinin alternatif manyetik alan (AFM) kaynaklı ısıtılması PTT13,14için alternatif bir tedavidir. MHT'nin ana avantajı manyetik alanın yüksek penetrasyonudur15. Bununla birlikte, gerekli nispeten yüksek İYONP konsantrasyonu klinik uygulaması için önemli bir dezavantaj olmaya devam etmektedir. Hayvanlarda katı tümörlere nanotıpların (veya nanopartiküllerin) doğum verimliliği, dolaşım, birikim ve penetrasyon dahil olmak üzere bir dizi engel nedeniyle%1-10olmuştur 16,17. Bu nedenle, yüksek doku penetrasyonu elde etme yeteneğine sahip kontrollü ve hedefli bir İYONP doğum stratejisi kanser tedavisinde büyük ilgi çekmaktadır.
Ultrason aracılı nanopartikül iletimi, mikrobubble kavitasyon18,19adı verilen fenomen nedeniyle nanopartiküllerin tümör dokusunun derinliklerine nüfuz etmesini kolaylaştırma yeteneğini göstermiştir. Bu çalışmada, İYONP'leri kabuklu mikrobubbles (NSM' ler) kendi kendine montaj yoluyla üreterek manyetik, akustik ve optik yanıt hızını tek bir nanoterapötik platformda sinerji haline geliyoruz. NSM, yaklaşık 5,4 μm çapında bir hava çekirdeği ve demir oksit nanopartikülleri kabuğu içerir. NSM'ler manyetik olarak tümör bölgesine yönlendirilebilir. Daha sonra IYONP'lerin salınımı, mikrobubble kavitasyon ve mikroaksiyon eşliğinde ultrason ile tetiklenir. Mikro akımdan alınan momentum, İYONP'lerin tümör dokusuna nüfuz etmesine engel olmaktadır. PTT ve MHT, NIR lazer ışınlama veya AFM uygulaması ile veya her ikisinin kombinasyonu ile elde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri OG İlaç'ın Hayvan Bakımı ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımına ilişkin kılavuzları ile onaylanan protokollere uygun olarak gerçek gerçekleştirildi. Protokoller, OG İlaç'ın laboratuvar hayvanları için Etik Kurulu yönergelerine uydu.
1. Nanopartikül kabuklu mikrobubbles (NSMs) sentezi
- Manyetik nanopartikülleri (Fe3O4, demir oksit) deiyonize suda dağıtarak 10 mg/mL stok çözeltisi oluşturur.
- İYONP çözeltisini içeren tüpü 20 dakika boyunca ultrasonik bir temizleme makinesine yerleştirin. Kullanmadan önce düzgün dağılmış bir IONP çözümü edinin.
- Adım 1.1'den 150 μL deiyonize su, 150 μL 10 mM sodyum dodecyl sülfat (SDS) ve 400 μL IONP stok çözeltisi ekleyin. 1,5 mL santrifüj tüpünde.
- Homojenizatörleri buz banyosunda bir iskele ile sabitle.
- Karışımın tüpünü bir buz banyosuna yerleştirin ve homojenizatör probunu karışım çözeltisine daldırılacak şekilde tam olarak konumlandırın.
- Homojenizatör hızını 20.000 rpm'ye ayarlayın ve homojenizatöre 3 dakika açın.
- Homojenizozu kapatın ve tüpü buz banyosundan çıkarın.
- Tüpü oda sıcaklığında 12 saat stabilizasyon için tüp rafı için yerleştirin.
- Elde edilen NSM'leri bir mıknatısla tüp duvarına adsorbe edin ve süpernatantı çıkarın. Daha sonra 1 mL taze deiyonize su ile yenilenin.
- Yıkama işlemini üç kez tekrarlayın ve NSM'leri 1 mL taze damıtılmış suda yeniden askıya alın.
- Hafifçe sallayarak 10 μL NSM süspansiyonu temiz bir cam kaydırağa aktarın.
- NSMs morfolojisini görselleştirmek için 20x büyütmede floresan mikroskop kullanın. Rastgele alanda fotoğraf çektiğiden emin olun.
- Açık erişimli Nano Measurer 1.2 yazılımı kullanarak fotoğraflardan NSM'lerin çapını ölçün. En az 200 mikrobubble say.
- İşlenecek görüntü dosyasını seçmek için "Dosya" ve "Aç" ı tıklatın. Görüntü alındıktan sonra , "cetvel" tuşuna basın. Cetvelle aynı uzunluğa sahip kırmızı bir çizgi çizin.
- Ardından "Ayarlar" | "Cetvel" ve cetvelin uzunluğunu girin. Görüntüdeki tek tek mikrobubbles çaplarıyla aynı uzunluklarda çizgiler çizin. Tüm ölçümleri tamamlayın, ardından "Rapor" | " Raporu Görüntüle".
2. NSM'lerin akustik tepkisi
- 200 μL NSM'leri 800 μL deiyonize su ile seyreltin, ardından stok çözeltisi oluşturmak için 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
- Fonksiyon jeneratörünü, amplifikatörü, empedans eşleştirmesini ve ev yapımı odaklı dönüştürücüsü bağlayın. Dönüştürücüsü yapay küboid lavabonun altındaki ortaya yerleştirin ve çıkış ultrason yoğunluğunu izlemek için hidrofon bir osiloskopla bağlayın (Şekil 1). Dönüştürücüye daldırmak için lavaboya deiyonize su ekleyin.
- Fonksiyon jeneratörünü süpürme moduna ayarlayın, frekans aralığını 10 kHz ile 900 kHz arasında ayarlayın ve genliği 20 Vpp'ye (Voltaj tepe noktası) ayarlayın. Ultrasonun gücünü amplifikatör tarafından% 0.1'e ayarlayın. Her döngünün süresi 1 s zaman aralığı ile 4 s'dir.
- Tüpte 1 mL NSM stok çözeltisi örnekleri hazırlayın ve tüpü ev yapımı odaklanmış dönüştürücünün üzerine bir iskele ile sabitleyin. Mıknatısı tüpün altına takın ve NSM'leri çekin.
- Fonksiyon jeneratörünün ve amplifikatörün gücünü açın. 5 döngü (25 s) ultrason uygulamasından sonra fonksiyon jeneratörünü kapatın. Mıknatısı çıkarın ve serbest bırakılan İYONP'leri içeren çözeltinin 1 mL'lik kısmını toplayın. Santrifüj tüpüne 1 mL deiyonize su ekleyin.
- 2.5. tüpteki NSM'ler tamamen çökene kadar.
- Daha önce açıklandığı gibi endüktif olarak birleştirilmiş plazma optik emisyon spektrometresi (ICP-OES) ile serbest bırakılan tüm UYONP'leriölçün.
3. NSM'lerin optik tepkisi
NOT: Bu çalışmada, 808 nm lazer gücü içeren bir lazer sistemi ve daha önce Xu ve ark. tarafından tanımlanan kızılötesi termal görüntüleme kamerası20.
- Lazer sistemi hazırlama
- Lazerin güç kaynağını açın ve birkaç dakika ısınmasını bekleyin. Bir retort standında fiber bağlantılı 808 nm lazer diyot sabitle.
- Lazer ışınını optik fiber aracılığıyla numune aşamasına yönlendirin ve dışbükey bir lensle 6 mm ışık noktası (çap) elde etmek için numune aşamasına odaklanın.
- Güç çıkışını bir lazer güç ölçerle ölçün ve gücü 1 W/cm2'yeayarlayın.
- Tripoddaki kızılötesi termal görüntüleme kamerasını sabitle. Kamerayı açın ve çalışıp çalışmadığını kontrol edin (örneğin, odaklanmış ilgi alanı (YATıRıMG) sıcaklığını izleyin). Güç kaynağını ve kızılötesi termal görüntüleme kamerasını kapatın.
- Sulu çözeltide fototermal ölçüm
- 1 mL'lik numuneyi farklı İYONP konsantrasyonunda (1,05 mg/mL, 1,35 mg/mL, 3,65 mg/mL, 5 mg/mL) 1,5 mL santrifüj tüpünde hazırlayın.
- İlgi tüpünü lazer ışınının odaklanmış bölgesine yerleştirin ve numunenin taban çizgisi sıcaklığını kaydedin.
- Lazer gücünü ve kızılötesi termal görüntüleme kamerasını açın ve numuneyi sürekli olarak 10 dakika ışınlayın. Aynı zamanda, sıcaklığı gerçek zamanlı olarak kaydedin.
- 10 dakikalık ışınlamadan sonra lazer gücünü ve kızılötesi termal görüntüleme kamerasını kapatın. Bölgenin sıcaklığının taban çizgisine dönmesini bekleyin.
- Diğer numunelerin ölçümü için 3.2.2 ile 3.2.4 arasında tekrarlayın.
NOT: Fototermal ölçüm için kontrol olarak 20 °C'de deiyonize su kullanın.
- Kültürlü hücrelerde fototermal ölçüm
NOT: Murine meme kanseri hücreleri (4T1) fototermal tedavi ile inhibisyon etkisini araştırmak için bir model olarak seçilmiştir.- Hücreleri % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) ortamı ile besleyin. Kült ortamı 37 °C ve %5 CO 2 olarakayarlayın.
- T25 şişelerindeki Kültür 4T1 hücreleri ve %90 izdihama ulaşıldığında hücreleri 1:2 oranında geçiştirin.
NOT: Alt kültür oranı farklı laboratuvarlardaki özel hücre koşullarına göre ayarlanabilir. - Kültür ortamını kaldırın ve atın. Tripsin inhibitörü içeren artık serumu çıkarmak için hücre tabakasını 1x PBS çözeltisi ile durulayın.
- Müfreze için şişeye 2 mL Trypsin-EDTA çözeltisi (%0,25) ekleyin. Daha sonra 3 mL 1640 orta ekleyin ve hafifçe pipetleme yaparak hücreleri aspire edin.
- 5 mL hücre süspansiyonu ve santrifüjü 3 dakika boyunca 500 x g'da toplayın.
- Üstnatanı çıkarın ve bir hücre süspansiyonu oluşturmak için 1 mL taze 1640 ortam ekleyin.
- Kültür ortamının 1 mL'lik kısmını içeren bir konfokal kabın içine 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Hücre süspansiyon konsantrasyonunun 9 x 105/mL olduğundan ve hücre kültürü konfokal çanağındaki son hücre konsantrasyonunun 8,1 x 104/mL olduğundan emin olun.
- Aşılanmış hücre kültürü konfokal kabını 24 saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
- Serumsuz 1640 ortam ile 1 mL çözelti yapmak için İYONP örneğinin farklı konsantrasyonunu (1.05 mg/mL, 1.35 mg/mL, 3.65 mg/mL, 5 mg/mL) seyreltin.
- Kültür ortamını konfokal tabaktan emiş ve hazırlanan numune çözeltisini ekleyin.
- Lazer gücünü aç. Lazer ışınını çanağın ortasına odaklayın ve çıkış gücünü 1 W/cm2'yeayarlayın. Kızılötesi termal görüntüleme kamerasını açın, konfokal çanaktaki hücreleri sürekli olarak 10 dakika ışınlayın. Odaklanmış bölge için sıcaklığı gerçek zamanlı olarak kaydedin.
- Lazer ve kızılötesi termal görüntüleme kamerasını kapatın. Işınlanmış çanağı 24 saat daha inkübatöre aktarın.
- Kültür ortamını çıkarın ve atın, konfokal yemeğe 1 mL taze kültür ortamı ekleyin. Yemeğe 5 μL Calcein-AM çözeltisi (1 mg/mL) ekleyin.
- Konfokal kabı 37 °C'de ve %5 CO2'de 15 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre katmanını 1x PBS çözeltisi ile iki kez durulayın.
- Hücreleri 488 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 500-540 nm emisyon dalga boyu ile konfokal floresan mikroskopla gözlemleyin ve görüntüleyin.
- Konfokal görüntülerde rastgele 5 alan seçin ve her alandaki canlı 4T1 hücrelerinin sayısını manuel olarak sayın. Tüm deney gruplarındaki canlı hücre sayısını kontrol grubu ile karşılaştırarak 4T1 hücrelerinin canlılığını ölçün.
NOT: Fototermal ölçü için kontrol olarak 20 °C'de serumsuz 1640 ortamını kullanın. Lazer ışınlama olmadan örneği hücre canlılığı kontrol grubu olarak kullanın.
- Vivo'da fototermal ölçüm
- Ortalama ağırlığı 25 ± 2 g olan 8 haftalık ICR erkek farelerden 3'üni hazırlayın.
- 20 mL deiyonize suya 2 g jelatin tozu ekleyin. Çözeltiyi 40 - 50 ° C'ye ısıtın, şeffaf ve net bir çözelti oluşturmak için jelatin jelini tamamen çözün.
- Çözeltiye 3.4.2'den 100 mg İYONP ekleyin.
- Jeli 40 – 50 ° C'ye ısıtın, hemen farenin sağ meme yastığına jelatin çözeltisinin 500 μL'sini enjekte edin.
- Lazer gücünü açın ve lazer ışınını ilgi alanına odakla (farelerin sağ göğüs pedi). Çıkış gücünü 1 W/cm2'ye ayarlayın. Kızılötesi termal görüntüleme kamerasını açın, ilgi bölgesini sürekli olarak 10 dakika ışınlayın. İlgi bölgesinin sıcaklığını gerçek zamanlı olarak kaydedin.
- Lazer ve kızılötesi termal görüntüleme kamerasını kapatın.
- Fareleri CO2 boğulma ve boyun omur çıkığı veya Enstitünün hayvan araştırma komitesi tarafından onaylanan herhangi bir yöntemle ötenazi.
4. Manyetik hipertermi ölçümü
NOT: Burada, daha önce Wu ve arkadaşları tarafından tanımlanan manyetik bir hipertermi sistemi kullanılmaktadır (21).
- Manyetik hipertermi sistemi hazırlayın, alternatif bir manyetik alan (AFM) jeneratörü ve kızılötesi termal görüntüleme kamerası içerir.
- Soğutucuyu 10 dakika açın ve ardından orta derecede radyo frekansı ısıtma makinesini (örneğin AFM jeneratörü) açın.
- Makinenin parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: frekans (f) = 415 kHz, manyetik alan yoğunluğu = 1,8 kA/m.
- Sulu çözeltide manyetik hipertermi ölçümü
- Numunenin 1 mL'lik kısmını 1,5 mL'lik santrifüj tüpünde farklı İYONP konsantrasyonunda (1,05 mg/mL, 1,35 mg/mL, 3,65 mg/mL, 5 mg/mL) hazırlayın.
- Tüpü su soğutmalı manyetik indüksiyon bakır bobinin ortasına yerleştirin.
- Alternatif manyetik alanı (AFM) ve kızılötesi termal görüntüleme kamerasını açın. Numuneyi sürekli olarak 10 dakika boyunca indükle ve sıcaklığı gerçek zamanlı olarak kaydedin.
NOT: Fotoğraf makinesi, numunenin kesitsel görünümünü sağlayan numunenin üst kısmında bulunur. - AFM'yi ve kızılötesi termal görüntüleme kamerasını kapatın. Bakır bobinin sıcaklığının 10 dakika boyunca taban çizgisine geri gelmesini bekleyin.
NOT: Yüksek sıcaklığa dikkat edin, ellerle doğrudan temastan kaçının ve numuneleri çıkarmadan önce soğumayı bekleyin. - Diğer numunelerin ölçümü için 4.2.2 ile 4.2.4'i tekrarlayın.
- Orta derecede radyo frekanslı ısıtma makinesini (AFM) ve soğutucuyu kapatın.
NOT: Manyetik hipertermi ölçümü için kontrol olarak 20 °C'deki deiyonize suyu kullanın.
- Vivo manyetik hipertermi ölçümü
- Ortalama ağırlığı 25 ± 2 g olan 8 haftalık ICR erkek farelerden 3'üni hazırlayın.
- 5 mg/mL İYONP çözeltisi içeren % 10 jelatin jelin 20 mL'sini hazırlayın.
- Jelatin jelini 40 - 50 ° C'ye ısıtın, hemen hayvanın sağ meme yastığına jelatin çözeltisinin 500 μL'sini enjekte edin.
NOT: Manyetik kaynaklı hipertermi deneyleri, in vitro test ile aynı parametreler kullanılarak ısıtma makinesi ile gerçek yapılmıştır. - Alternatif manyetik alanı (AFM) ve kızılötesi termal görüntüleme kamerasını açın. Farelerin sağ göğüs pedini su soğutmalı manyetik indüksiyon bakır bobinin ortasına yerleştirin.
- Kızılötesi termal görüntüleme kamerasını açın, ilgi bölgesini (farelerin sağ meme pedi) 10 dakika boyunca sürekli görüntüleyin ve ilgi bölgesinin sıcaklığını gerçek zamanlı olarak kaydedin.
- 10 dakikalık indüksiyondan sonra makinenin ve kızılötesi termal görüntüleme kamerasının güç anahtarını kapatın. Bakır bobinin sıcaklığının 10 dakika boyunca taban çizgisine dönmesini bekleyin.
- Diğer numunelerin ölçümü için 4.3.4 ile 4.3.6'yı tekrarlayın.
- Orta derecede radyo frekanslı ısıtma makinesini (AFM) ve soğutucuyu kapatın.
NOT: Yüksek sıcaklığa dikkat edin, ellerle doğrudan temastan kaçının ve numuneleri çıkarmadan önce soğumayı bekleyin. - Fareleri CO2 boğulma ve boyun omur çıkığı veya Enstitünün hayvan araştırma komitesi tarafından onaylanan herhangi bir yöntemle ötenazi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada kullanılan üçlü duyarlı nanopartikül kabuklu mikrobubbles (NSM' ler) yüzey aktif madde ve UYONP'lerin karışımı ile hazırlanmıştır. İYONP'ler (50 nm), yoğun bir şekilde paketlenmiş bir manyetik kabuk oluşturmak için sıvı ve gaz çekirdeğinin arayüzünde kendi kendine monte edilmiştir. NSM'lerin morfolojisi Şekil 1A'da gösterilmiştir. Elde edilen NSM'ler küresel bir şekil sundu ve ortalama çapı 5.41 ± 1.78 μm (Şekil 1B). Sonuçlar NSM'lerin başarıyla hazırlandığını gösterdi. Suda depolandığında, mikrobubbles 1 yıldan fazla bozulmadan kaldı ve tamponlarda ve hücre kültürü ortamında en az 10 gün boyunca kararlıydı19. Şekil 1D'degösterildiği gibi, uygulanan ultrason döngülerinin sayısını artırarak Fe'nin adım adım serbest bırakılması sağlanmıştır. 10 döngüden sonra Fe'nin yaklaşık %20'si serbest bırakıldı. 50 ultrason döngüsüne kadar, serbest bırakılan Fe miktarı yaklaşık% 80'e ulaştı. Bu sonuçlar, IYONP'lerin harici bir ultrason tetikleyicisi tarafından isteğe bağlı olarak serbest bırakılmasını önerdi.
Sulu çözeltide UYONP aracılı fototermal ölçüm Şekil 2'degösterilmiştir. Şekil 2A,B'degösterildiği gibi artan ışınlama süresi ile İYONP'lerin sıcaklığı hızla artmıştır. 5 mg/mL'lik Fe konsantrasyonda 10 dakika boyunca nir lazere (808 nm,1 W/cm2)maruz kalındığında 30 °C sıcaklık artışı elde edilebilir.
PTT'nin ürettiği ısı kanser hücrelerini öldürebilir. 4T1 hücresinin PTT tarafından uygulanabilirliği NIR lazer (808 nm, 1 W/cm2)tedavisi ile 10 dk değerlendirildi. Şekil 3A,B'de gösterildiği gibi, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, yüksek konsantrasyonda Fe (5 mg/ mL) ile inkübe edildiğinde morfoloji ve canlı hücre sayısında bir fark yoktu, bu da İYONP'lerin iyi biyoyararlanımını düşündürmektedir. NIR lazer ile ışınlandıktan sonra, hücreler apoptoz gösteren yuvarlak bir şekle dönüştü. Canlı hücre sayısının nicelemesi, yani hücrelerin uygulanabilirliği Şekil 3C'degösterilmiştir. NIR ışınlama altında yüksek İYONP konsantrasyonu (3.65 mg/mL ve 5 mg/mL) ile inkübe edilen hücreler sırasıyla %80 ve %100 civarında olan en yüksek ölüm oranına sahipti. Düşük İYONP konsantrasyonu (1.025 mg/mL ve 1.35 mg/mL) tedavi edilen grup yaklaşık %40 ile benzer bir öldürme verimliliği gösterdi. Sonuçlar, NSMS'nin fototermal etkisinin kanseri etkili bir şekilde tedavi edebileceğini göstermektedir.
Şekil 4A,B'de gösterildiği gibi, jelatin enjeksiyon alanının sıcaklığı 5 dakikalık NIR ışınlamadan sonra yaklaşık 20 ° C hızla artmıştır. Farelerde ilgi alanının gerçek yüzey sıcaklığı yaklaşık 57 ° C'ye ulaşılabilir. Şekil 5'tegösterildiği gibi, AFM'ye maruz kaldığında, farklı İYONP konsantrasyonlarının termal görüntülemesi (1.05 mg/mL, 1.35 mg/mL, 3.65 mg/mL, 5 mg/mL) kızılötesi termal kamera (Şekil 5A) tarafından izlendi ve yüksek sıcaklık eğrileri farklı zaman aralıklarında kaydedildi ve çizildi (Şekil 5B). Bunlar arasında, 1.35 mg / mL, 3.65 mg / mL ve 5 mg / mL İYONP çözeltiyi hızlı bir şekilde ısıtabilir ve 10 dakikalık indüksiyondan sonra sıcaklığı (sırasıyla 20 ° C, 30 ° C, 40 ° C) artırabilir. Sonuçlar, NSMS'nin alternatif manyetik alan tepki özelliğini göstermektedir.
In vivo manyetik hipertermi deneyinde fareler 415 kHz frekansında AFM'ye ve 10 dakika boyunca 1,8 kA/m manyetik genlikte maruz kaldı. Isıtma işlemi kızılötesi termal görüntüleme kamerası tarafından gerçek zamanlı olarak izlendi(Şekil 6A, 6B). İlgi alanında önemli sıcaklık değişimleri gözlenmiştir(Şekil 6). Sıcaklık zamanla hızla arttı ve 10 dakikalık indüksiyon için 50 °C'lik bir artış oldu.
Şekil 1: NSM'lerin karakterizasyonu ve kontrollü UYONP'ların serbest bırakılması. (A) NSM'lerin temsili parlak alan mikroskopi görüntüsü. Ölçek çubuğu: 20 μm. (B) NSM'lerin çap dağılımı, n = 200. (C) Deneyde kullanılan ultrasonik ekipmanın şeması. (D) Ultrason stimülasyonu altında NSM'lerden gelen IYONP'lerin kümülatif salınım profilleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Suluda İYONP aracılı fototermal ölçüm. (A) 1 W / cm2için 808 nm'de 10 dakikalık lazer ışınlamadan sonra farklı konsantrasyonlarda IYONP konsantrasyonlarının kızılötesi termal görüntüleri. (B) Farklı İYONP konsantrasyonlarında tipik sıcaklık yükselme eğrileri (808 nm, 1 W/cm2, 10 dk). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 4T1 hücrelerinde İYONP aracılı fototermal ölçüm. (A) Farklı İYONP konsantrasyonlarında (Calcein-AM, yeşil ile lekelenmiş) 24 saat inkübasyondan sonra canlı 4T1 hücrelerinin konfokal floresan mikroskopi görüntüleri. NIR tedavi edilen hücreler 10 dakika boyunca 808 nm lazere maruz kaldı (1 W/cm2). Ölçek çubuğu: 50 μm. (B) 10 dakikalık NIR ışınlama için 4T1 hücrelerini tedavi eden farklı İYONP konsantrasyonlarındaki tipik sıcaklık yükselme eğrileri (1 W/cm2). (C) NIR tedavisi olsun veya olman farklı konsantrasyonlarda IYONP'lerle inkübe edilen 4T1 hücrelerinin canlılığının ölçülmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: IONP aracılı fototermal ölçüm in vivo. (A) Farklı zaman aralıklarında yakalanan NIR lazerine maruz kalan farenin ilgi bölgesinin kızılötesi termal görüntüleri (808 nm, 1 W/cm2, 10 dk). (B) NIR lazer (808 nm, 1 W/cm2,10 dk) tedavisinden sonra farklı zaman aralıklarında yüksek sıcaklık eğrileri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Suluda İYONP aracılı manyetik hipertermi ölçümü. (A) AFM altında 415 kHz frekansta farklı konsantrasyonlarda İYONP çözeltisinin kızılötesi termal görüntüleri ve 10 dakika boyunca 1,8 kA / m manyetik genlik. (B) AFM altında 415 kHz frekansta farklı konsantrasyonlarda İYONP çözeltisinin tipik sıcaklık eğrileri ve 1,8 kA / m manyetik genlik.
Şekil 6: İYONP aracılı manyetik hipertermi in vivo. (A) AFM altında farklı zaman aralıklarında yakalanan farelerin ilgi bölgesinin kızılötesi termal görüntüleri 415 kHz frekansta ve 10 dakika boyunca 1,8 kA/m manyetik genlik. (B) AFM altında 415 kHz frekansta farklı zaman aralıklarında yüksek sıcaklık eğrileri ve 1,8 kA/m manyetik genlik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, demir oksit nanopartikül kabuklu mikrobubbles (NSM' ler) kendi kendine montaj yoluyla, manyetik, akustik ve optik yanıt hızını tek bir nanoterapötik platformda sinerjik hale getirdik. İYONP'ler, hedefleme için harici manyetik alan tarafından kontrol edilebilen manyetik bir kabuk oluşturmak için hava çekirdeğinin etrafına yoğun bir şekilde paketlenmiştir. Teslim edildikten sonra, İYONP'lerin salınımı ultrason tetikleyicisi ile elde edilebilir. Serbest bırakılan UYONP'lar, PTT ve MHT için hem NIR ışığı hem de AFM veya her ikisinin kombinasyonu ile etkinleştirilebilir.
Tüm protokol boyunca, NSM'lerin sentez adımları, tüm protokolün temeli olan önemli bir rol oynar. Aynı zamanda, in vitro İYONP'lerin kontrollü salınımı NSM'lerin akustik tepkisini doğruladı. Sulu çözeltide fototermal ölçüm protokolü ve sulu çözeltide manyetik hipertermi ölçümü de sırasıyla NSM'lerin manyetik ve optik tepkisini doğrulamıştır.
NSM'leri başarıyla hazırlamak için, IONP'lerin çözeltisi, IONP'lerin suya eşit dağılımını sağlamak için kullanımdan önce 20 dakika boyunca sonicated edilmelidir. Ajitasyon yapılırken, homojenizatör probu çözeltiye tamamen daldırılmalıdır. NSM'lerin akustik tepkisini incelerken, örnek tüp doğrudan dönüştürücünün üstüne yerleştirilecek ve ultrason yoğunluğunun zayıflamasını önlemek için NSM'leri mıknatıs tarafından tüpün dibine çekmelidir. Ayrıca, fototermal ölçüm veya manyetik hipertermi ölçümü sırasında sıcaklık artışı önemli değilse, numune ne lazer ışınının odağında ne de su soğutmalı manyetik indüksiyon bakır bobinin merkezinde olduğu için olabilir.
Protokolün hala bazı sınırlamaları olduğu belirtilmelidir. Örneğin, hazırlanan NSM'lerin ortalama çapı klinik olarak kullanılan bazı mikrobubbles22'nin çapına benzer olmasına rağmen (ultrason görüntüleme için), ancak NSMs boyutunun homojenliğinin iyileştirilmesi gerekir. Ek olarak, NSM'lerin kandaki dolaşımı mikrobubble yüzeyinin değiştirilmesiyle iyileştirilmelidir. Bunun dışında, sinerjik tedavi in vivo olarak doğrulanmamıştır ve vivo'daki terapötik etkinliği hala bilinmemektedir.
Önerilen İYONP'ler dağıtım stratejisi sadece İYONP'lerin isteğe bağlı salınımını sağlamakla kalmaz, aynı zamanda İYONP'lerin tümör dokusuna nüfuzunu da teşvik eder. Şu anda, tümördeki artan interstisyel sıvı basıncı ve yoğun tümör stroması nanopartikül iletim verimliliğini büyük ölçüde sınırlar5. Bu nedenle, bu protokol nanotıp doğumu için doku delici bir strateji sağlar ve kanser tedavisinde büyük ilgi görür.
Ayrıca, IONP aracılı PTT ve MHT'nin hem in vitro hem de in vivo etkili olduğunu gösterdik. Sonuçlar, İYONP'lerin iyi bir fototermal dönüşüm ve manyetik termal dönüşüm yeteneklerine sahip olduğunu ve tümörü verimli bir şekilde alevlendirebileceğini göstermiştir. Hem PTT hem de MHT kombinasyonu kanser hücre ölümünün tamamını sağlamak ve antikanser etkinliklerini iyileştirmek için yeterliydi. Gelecekte, NSM'ler tarafından yapılan çift termal terapi (yani PTT ve MHT), kliniklerde derin oturmuş katı tümörün tedavisi için yeni bir seçenek sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81601608) ve NUPTSF (NY216024) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 808 nm laser power | Changchun New Industries Optoelectronics Tech | MDL-F-808-5W-18017023 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher SCIENTIFIC | C3099 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Function generator | Keysight | 33500B series | 20 MHz, 2 channels with arbitrary waveform generation capability |
| Gelatin gel | Sigma | 9000-70-8 | |
| Heating machine | Shuangping | SPG-06- II | |
| Homemade focused transducer | Frequency=855, R-X=36.2W+5.8W, |Z|-θ=37W+8° | ||
| Homogenizer | SCILOGEX | D-160 | 8000-30000 rpm |
| Hydrophone | T&C | NH1000 | |
| ICR male mice | OG Pharmaceutical. Co. Ltd | 8-week-old | |
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry | PerkinElmer | ||
| Infrared thermal imaging camera. | FLIR | E50 | |
| Iron(II,III) oxide | Alfa Aesar | 1317-61-9 | 50-100nm APS Powder |
| Laser power meter | Changchun New Industries Optoelectronics Tech | ||
| Oscilloscope | Keysight | DSOX3054T | Bandwidth 500 MHz, Sampling Rate 5 GS/S, 4 channels |
| RF Power Amplifier | T&C | AG1020 | The signal source can also be connected to an external signal source. The gain can be adjusted from 0 to 100%. It has multiple functions such as frequency sweep, pulse, and triangle. |
| Roswell Park Memorial Institute-1640 | KeyGEN BioTECH | KGM31800 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 151-21-3 |
References
- Kievit, F. M., Zhang, M. Cancer nanotheranostics: improving imaging and therapy by targeted delivery across biological barriers. Advanced Materials. 23 (36), 217-247 (2011).
- Wu, H., et al. Fe3O4-Based Multifunctional Nanospheres for Amplified Magnetic Targeting Photothermal Therapy and Fenton Reaction. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (2), 1045-1056 (2018).
- Thorat, N. D., et al. Physically stimulated nanotheranostics for next generation cancer therapy: Focus on magnetic and light stimulations. Applied Physics Reviews. 6 (4), 041306 (2019).
- Sun, Q., Zhou, Z., Qiu, N., Shen, Y. Design of Cancer Nanomedicine: Nanoproperty Integration and Synchronization. Advanced Materials. 29 (14), 1606628 (2017).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F.
- Anchordoquy, T. J., et al. Mechanisms and Barriers in Cancer Nanomedicine: Addressing Challenges, Looking for Solutions. ACS Nano. 11 (1), 12-18 (2017).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the "hot-spot" effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. of Iron Oxide Nanoparticles in Cancer Therapy: Amplification of Heating Efficiency by Magnetic Hyperthermia and Photothermal Bimodal Treatment. ACS Nano. 10 (2), 2436-2446 (2016).
- Rastinehad, A. R., et al. Gold nanoshell-localized photothermal ablation of prostate tumors in a clinical pilot device study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (37), 18590-18596 (2019).
- Sharma, S. K., Shrivastava, N., Rossi, F., Tung, L. D., Thanh, N. T. K. Nanoparticles-based magnetic and photo induced hyperthermia for cancer treatment. Nano Today. 29, 100795 (2019).
- Das, R., Rinaldi-Montes, N. Boosted Hyperthermia Therapy by Combined AC Magnetic and Photothermal Exposures in Ag/Fe3O4 Nanoflowers. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (38), 25162-25169 (2016).
- Yang, Y., et al. 1D Coordination Polymer Nanofibers for Low-Temperature Photothermal Therapy. Advanced Materials. 29 (40), 1703588 (2017).
- Curcio, A., et al. Iron Oxide Nanoflowers CuS Hybrids for Cancer Tri-Therapy: Interplay of Photothermal Therapy, Magnetic Hyperthermia and Photodynamic Therapy. Theranostics. 9 (5), 1288-1302 (2019).
- Espinosa, A., et al. Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and In Vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Xu, C., et al. Magnetic Hyperthermia Ablation of Tumors Using Injectable Fe(3)O(4)/Calcium Phosphate Cement. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (3), 13866-13875 (2015).
- Wilhelm, S., et al. Analysis of nanoparticle delivery to tumours. Nature Reviews Materials. 1, 16014 (2016).
- Chen, H., Zhang, W., Zhu, G., Xie, J., Chen, X.
- Rapoport, N. Y., Kennedy, A. M., Shea, J. E., Scaife, C. L., Nam, K. H. Controlled and targeted tumor chemotherapy by ultrasound-activated nanoemulsions/microbubbles. Journal of Controlled Release : The Official Journal of the Controlled Release Society. 138 (3), 268-276 (2009).
- Gao, Y., et al. Controlled nanoparticle release from stable magnetic microbubble oscillations. NPG Asia Materials. 8 (4), 260 (2016).
- Bao, B., et al. Mussel-inspired functionalization of semiconducting polymer nanoparticles for amplified photoacoustic imaging and photothermal therapy. Nanoscale. 11 (31), 14727-14733 (2019).
- Wu, H., et al. Enhanced Tumor Synergistic Therapy by Injectable Magnetic Hydrogel Mediated Generation of Hyperthermia and Highly Toxic Reactive Oxygen Species. ACS Nano. 13 (12), 14013-14023 (2019).
- Alzaraa, A., et al. Targeted microbubbles in the experimental and clinical setting. American Journal of Surgery. 204 (3), 355-366 (2012).
