Summary
Présenté ici est un protocole pour la fabrication de microbulles à coquille de nanoparticules d’oxyde de fer (NSM) par auto-assemblage, synergie magnétique, acoustique et réactivité optique dans une plate-forme nanothérapeutique pour l’hyperthermie magnétique et la thérapie du cancer combinée photothermique.
Abstract
L’administration précise d’agents anticancéreux qui visent un accouchement ciblé et pénétré en profondeur ainsi qu’une libération contrôlée sur le site tumoral a été remise en question. Ici, nous fabriquons des microbulles à enveloppe de nanoparticules d’oxyde de fer (NSM) grâce à l’auto-assemblage, à la synergie magnétique, acoustique et réactive optique dans une plate-forme nanothérapeutique. Les nanoparticules d’oxyde de fer servent à la fois d’agents magnétiques et photothermiques. Une fois injectés par voie intraveineuse, les NSM peuvent être guidés magnétiquement vers le site tumoral. Les ultrasons déclenchent la libération de nanoparticules d’oxyde de fer, facilitant la pénétration des nanoparticules profondément dans la tumeur en raison de l’effet de cavitation des microbulles. Par la suite, l’hyperthermie magnétique et la thérapie photothermique peuvent être effectuées sur la tumeur pour le traitement combiné du cancer, une solution pour la résistance au cancer en raison de l’hétérogénéité tumorale. Dans ce protocole, la synthèse et la caractérisation des NSM, y compris les propriétés structurelles, chimiques, magnétiques et acoustiques, ont été effectuées. En outre, l’efficacité anticancéreuse par thérapie thermique a été étudiée à l’aide de cultures cellulaires in vitro. La stratégie d’administration proposée et la thérapie combinée sont très prometteuses dans le traitement du cancer pour améliorer l’efficacité de l’administration et de l’anticancéreux.
Introduction
Le cancer est l’une des maladies les plus mortelles, causant des millions de décès chaque année dans le monde et d’énormes pertes économiques1. Dans les cliniques, les thérapies anticancéreuses conventionnelles, telles que la résection chirurgicale, la radiothérapie et la chimiothérapie, ne peuvent toujours pas fournir une efficacité thérapeutique satisfaisante2. Les limites de ces thérapies sont des effets secondaires toxiques élevés, un taux de récidive élevé et un taux de métastases élevé3. Par exemple, la chimiothérapie est subie de la faible efficacité d’administration des médicaments de chimiothérapie précisément au sitetumoral 4. L’incapacité des médicaments à pénétrer profondément dans le tissu tumoral à travers les barrières biologiques, y compris la matrice extracellulaire et la pression élevée du liquide interstitiel tumoral, est également responsable de la faible efficacité thérapeutique5. En outre, la résistance tumorale se produit généralement chez les patients qui ont reçu un traitement par chimiothérapie unique6. Par conséquent, les techniques où l’ablation thermique de la tumeur se produit, telles que la thérapie photothermique (PTT) et la thérapie d’hyperthermie magnétique (MHT), ont montré des résultats prometteurs pour réduire la résistance tumorale et ont émergé dans les essais cliniques7,8,9.
Les PTT déclenchent l’ablation thermique des cellules cancéreuses par l’action d’agents de conversion photothermiques sous l’irradiation de l’énergie laser. La température élevée générée (supérieure à 50 °C) induit une nécrose cellulaire complète10. Très récemment, il a été démontré que les nanoparticules d’oxyde de fer (IRP) sont un agent de conversion photothermique pouvant être activé par la lumière proche infrarouge (NIR)11. Malgré le faible coefficient d’absorption molaire dans la région proche infrarouge, les IONP sont candidats à la thérapie photothermique à basse température (43 °C), une thérapie modifiée pour réduire les dommages causés par l’exposition à la chaleur des tissus normaux et pour initier une immunité antitumorale contre les métastases tumorales12. L’une des limites du PTT est la faible profondeur de pénétration du laser. Pour les tumeurs profondes, le chauffage induit par le champ magnétique alternatif (AFM) des nanoparticules d’oxyde de fer, également appelé hyperthermie magnétique, est une thérapie alternative pour PTT13,14. Le principal avantage de MHT est la forte pénétration du champ magnétique15. Cependant, la concentration relativement élevée requise d’IRP reste un inconvénient majeur pour son application clinique. L’efficacité de la nanomédecine (ou nanoparticules) aux tumeurs solides chez les animaux a été de 1 à 10% en raison d’une série d’obstacles, notamment la circulation, l’accumulation et la pénétration16,17. Par conséquent, une stratégie d’administration contrôlée et ciblée des ITP avec la capacité d’atteindre une pénétration tissulaire élevée est d’un grand intérêt dans le traitement du cancer.
L’administration de nanoparticules médiées par ultrasons a montré sa capacité à faciliter la pénétration des nanoparticules profondément dans le tissu tumoral, en raison du phénomène appelé cavitation des microbulles18,19. Dans la présente étude, nous fabriquons des microbulles à coque d’IOP (NSM) grâce à l’auto-assemblage, à la synergie de la réactivité magnétique, acoustique et optique dans une plate-forme nanothérapeutique. Le NSM contient un noyau d’air et une coquille de nanoparticules d’oxyde de fer, d’un diamètre d’environ 5,4 μm. Les NSM peuvent être guidés magnétiquement vers le site de la tumeur. Ensuite, la libération d’IONPs est déclenchée par ultrasons, accompagnée d’une cavitation de microbulles et d’un microstreaming. L’élan reçu du microstreaming facilite la pénétration des ITP dans le tissu tumoral. Le PTT et le MHT peuvent être obtenus par irradiation laser NIR ou application AFM, ou avec la combinaison des deux.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par les lignes directrices d’OG Pharmaceutical pour les soins aux animaux et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les protocoles suivaient les directives du comité d’éthique pour les animaux de laboratoire d’OG Pharmaceutical.
1. Synthèse de microbulles à coque de nanoparticules (NSM)
- Disperser des nanoparticules magnétiques (Fe3O4,oxyde de fer) dans de l’eau désionisée pour former une solution type de 10 mg/mL.
- Placez le tube contenant la solution d’IONPs dans une machine de nettoyage à ultrasons pendant 20 min. Obtenir une solution d’ITP uniformément dispersée avant utilisation.
- Ajouter 150 μL d’eau désionisée, 150 μL de dodécylsulfate de sodium (FDS) de 10 mM et 400 μL d’une solution mère d’IONP de l’étape 1.1. dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.
- Fixez l’homogénéisateur avec un échafaudage dans un bain de glace.
- Placez le tube du mélange dans un bain de glace et positionnez la sonde d’homogénéisateur précisément pour être immergée dans la solution du mélange.
- Réglez la vitesse de l’homogénéisateur à 20 000 tr/min et allumez l’homogénéisateur pendant 3 minutes.
- Éteignez l’homogénéisateur et retirez le tube du bain de glace.
- Placez le tube sur le rack à tubes pour une stabilisation de 12 h à température ambiante.
- Adsorbez les NSM résultants sur la paroi du tube par un aimant et retirez le surnageant. Ensuite, reconstituez-vous avec 1 mL d’eau fraîche désionisée.
- Répétez le processus de lavage trois fois et re-suspendez les NSM dans 1 mL d’eau distillée fraîche.
- Transférer 10 μL de suspension de NSM sur une lame de verre propre après avoir légèrement secoué.
- Utilisez un microscope à fluorescence à un grossissement de 20x pour visualiser la morphologie des NSM. Assurez-vous de prendre des photos au hasard.
- Mesurez le diamètre des NSM à partir des photos à l’aide d’un logiciel Nano Measurer 1.2 en libre accès. Comptez au moins 200 microbulles.
- Cliquez sur "Fichier" et "Ouvrir" pour sélectionner le fichier image à traiter. Une fois l’image importée, appuyez surlarègle " . Tracez une ligne rouge de la même longueur que la règle.
- Appuyez ensuite sur "Paramètres" | «Règle" et entrez la longueur de la règle. Tracez des lignes de la même longueur que les diamètres des microbulles individuelles de l’image. Complétez toutes les mesures, puis cliquez sur "Rapport" | » Voir le rapport« .
2. Réponse acoustique des NSM
- Diluer 200 μL de NSM avec 800 μL d’eau désionisée, puis transférer dans un tube centrifuge de 1,5 mL pour former une solution mère.
- Connectez le générateur de fonctions, l’amplificateur, la correspondance d’impédance et le transducteur focalé fait maison. Placez le transducteur au centre au fond de l’évier cuboïde artificiel et connectez l’hydrophone à un oscilloscope pour surveiller l’intensité des ultrasons de sortie (Figure 1). Ajouter de l’eau désionisée dans l’évier pour immerger le transducteur.
- Réglez le générateur de fonctions sur le mode balayage, réglez la plage de fréquences de 10 kHz à 900 kHz et réglez l’amplitude sur 20 Vpp (crête de tension). Ajustez la puissance des ultrasons à 0,1% par l’amplificateur. La durée de chaque cycle est de 4 s avec un intervalle de temps de 1 s.
- Préparez des échantillons de solution mère de 1 mL NSM dans le tube et fixez le tube avec un échafaudage sur le dessus du transducteur focalé fait maison. Fixez l’aimant au fond du tube et attirez les NSM.
- Allumez la puissance du générateur de fonctions et de l’amplificateur. Éteignez le générateur de fonction après l’application de 5 cycles (25 s) d’ultrasons. Retirez l’aimant et collectez 1 mL de la solution contenant les IONP libérés. Ajouter 1 mL d’eau désionisée dans le tube de centrifugeuse.
- Répétez l’étape 2.5. jusqu’à ce que les NSM dans le tube s’effondrent complètement.
- Quantifier tous les IOP libérés par spectrométrie d’émission optique à plasma à couplage inductif (ICP-OES) comme décrit précédemment13.
3. Réponse optique des NSM
REMARQUE: Dans ce travail, un système laser contenant une puissance laser de 808 nm et une caméra thermique infrarouge précédemment décrite par Xu et al. est utilisé20.
- Préparation du système laser
- Allumez l’alimentation du laser et laissez-le se réchauffer pendant plusieurs minutes. Fixez une diode laser 808 nm couplée à une fibre sur un support d’atteau.
- Dirigez le faisceau laser vers l’étage d’échantillonnage à travers une fibre optique et concentrez-vous sur l’étage d’échantillonnage pour obtenir une tache lumineuse de 6 mm (en diamètre) par une lentille convexe.
- Mesurez la puissance de sortie avec un capteur de puissance laser et ajustez la puissance à 1 W/cm2.
- Fixez la caméra thermique infrarouge sur le trépied. Allumez l’appareil photo et vérifiez si elle fonctionne (par exemple, surveillez la température de la région d’intérêt focalisation (ROI)). Éteignez l’alimentation et la caméra thermique infrarouge.
- Mesure photothermique en solution aqueuse
- Préparer l’échantillon de 1 mL à différentes concentrations d’IONP (1,05 mg/mL, 1,35 mg/mL, 3,65 mg/mL, 5 mg/mL) dans un tube centrifuge de 1,5 mL.
- Placez le tube d’intérêt dans la région focalise du faisceau laser et enregistrez la température de base de l’échantillon.
- Allumez l’alimentation laser et la caméra thermique infrarouge et irradiez l’échantillon pendant 10 minutes en continu. Dans le même temps, enregistrez la température en temps réel.
- Éteignez l’alimentation laser et la caméra thermique infrarouge après 10 minutes d’irradiation. Attendez que la température de la région revienne à la ligne de base.
- Répétez les 3.2.2 à 3.2.4 pour la mesure d’autres échantillons.
REMARQUE: Utilisez de l’eau désionisée à 20 ° C comme contrôle pour la mesure photothermique.
- Mesure photothermique dans des cellules cultivées
REMARQUE: Les cellules cancéreuses du sein murin (4T1) ont été sélectionnées comme modèle pour étudier l’effet d’inhibition par traitement photothermique.- Nourrissez les cellules avec le milieu Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 1% de pénicilline. Réglez l’environnement de culture à 37 °C et 5 % de CO2.
- Culture de cellules 4T1 dans des flacons de T25 et passage des cellules dans un rapport de 1:2 lorsque la confluence de 90% est atteinte.
REMARQUE: Le ratio de sous-culture peut être ajusté en fonction des conditions cellulaires spécifiques dans différents laboratoires. - Retirez et jetez le milieu de culture. Rincez la couche cellulaire avec 1x solution de PBS pour éliminer le sérum résiduel contenant un inhibiteur de la trypsine.
- Ajouter 2 mL de solution de trypsine-EDTA (0,25 %) à la fiole pour le détachement. Ajoutez ensuite 3 mL de milieu 1640 et aspirez les cellules en pipetant doucement.
- Prélever 5 mL de la suspension cellulaire et centrifuger à 500 x g pendant 3 min.
- Retirez le surnageant et ajoutez 1 mL de milieu frais 1640 pour former une suspension cellulaire.
- Ajouter 100 μL de la suspension cellulaire dans une boîte confocale contenant 1 mL du milieu de culture. Assurez-vous que la concentration de la suspension cellulaire est de 9 x10 5/mL et que la concentration cellulaire finale dans la boîte confocale de culture cellulaire est de 8,1 x 104/mL.
- Placez la boîte confocale de culture cellulaire inoculée dans un incubateur pendant 24 h.
- Diluer différentes concentrations (1,05 mg/mL, 1,35 mg/mL, 3,65 mg/mL, 5 mg/mL) de l’échantillon d’ITP pour en faire une solution de 1 mL avec un milieu 1640 sans sérum.
- Aspirer le milieu de culture du plat confocal et ajouter la solution d’échantillon préparée.
- Allumez l’alimentation laser. Focalisation du faisceau laser au centre de la parabole et réglage de la puissance de sortie à 1 W/cm2. Allumez la caméra thermique infrarouge, irradiez les cellules de la parabole confocale pendant 10 minutes en continu. Enregistrez la température en temps réel pour la région ciblée.
- Éteignez le laser et la caméra thermique infrarouge. Transférer le plat irradié dans l’incubateur pendant encore 24 heures.
- Retirer et jeter le milieu de culture, ajouter 1 mL du milieu de culture frais dans le plat confocal. Ajouter 5 μL de solution de calcéine-AM (1 mg/mL) dans le plat.
- Incuber le plat confocal à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 15 min. Rincez la couche cellulaire avec 1x solution pbS deux fois.
- Observez et imagez les cellules à l’aune d’un microscope à fluorescence confocale avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et une longueur d’onde d’émission de 500-540 nm.
- Choisissez 5 zones dans les images confocales au hasard et comptez manuellement le nombre de cellules 4T1 vivantes dans chaque zone. Quantifier la viabilité des cellules 4T1 en comparant le nombre de cellules vivantes dans tous les groupes expérimentaux avec le groupe témoin.
REMARQUE: Utilisez le milieu 1640 sans sérum à 20 ° C comme contrôle pour la mesure photothermique. Utilisez l’échantillon sans irradiation laser comme groupe témoin de la viabilité cellulaire.
- Mesure photothermique in vivo
- Préparez 3 des souris mâles ICR âgées de 8 semaines d’un poids moyen de 25 ± 2 g.
- Ajouter 2 g de poudre de gélatine à 20 mL d’eau désionisée. Chauffer la solution à 40 - 50 °C, dissoudre complètement le gel de gélatine pour former une solution transparente et limpides.
- Ajouter 100 mg d’IONP à la solution à partir du 3.4.2.
- Chauffer le gel à 40 – 50 °C, injecter immédiatement 500 μL de la solution de gélatine dans le coussinet mammaire droit de la souris.
- Allumez la puissance laser et concentrez le faisceau laser sur la région d’intérêt (coussinet mammaire droit des souris). Réglez la puissance de sortie à 1 W/cm2. Allumez la caméra thermique infrarouge, irradiez la région d’intérêt pendant 10 minutes en continu. Enregistrez la température de la région d’intérêt en temps réel.
- Éteignez le laser et la caméra thermique infrarouge.
- Euthanasier des souris par asphyxie au CO2 et luxation des vertèbres cervicales ou toute autre méthode approuvée par le comité de recherche animale de l’Institut.
4. Mesure de l’hyperthermie magnétique
REMARQUE: Ici, un système d’hyperthermie magnétique précédemment décrit par Wu et al. est utilisé (21).
- Préparez un système d’hyperthermie magnétique avec un générateur de champ magnétique alternatif (AFM) et une caméra thermique infrarouge.
- Allumez le refroidisseur pendant 10 minutes, puis mettez sous tension la machine de chauffage par radiofréquence modérée (c.-à-d. générateur AFM).
- Réglez les paramètres de la machine comme suit : fréquence (f) = 415 kHz, intensité du champ magnétique = 1,8 kA/m.
- Mesure de l’hyperthermie magnétique en solution aqueuse
- Préparer 1 mL de l’échantillon à différentes concentrations d’IONPs (1,05 mg/mL, 1,35 mg/mL, 3,65 mg/mL, 5 mg/mL) dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.
- Placez le tube au centre d’une bobine de cuivre à induction magnétique refroidie à l’eau.
- Allumez le champ magnétique alternatif (AFM) et la caméra thermique infrarouge. Induisez l’échantillon pendant 10 min en continu et enregistrez la température en temps réel.
REMARQUE: La caméra est située en haut de l’échantillon, fournissant une vue en coupe transversale de l’échantillon. - Éteignez l’AFM et la caméra thermique infrarouge. Attendez que la température de la bobine de cuivre revienne à la ligne de base pendant 10 min.
REMARQUE: Faites attention aux températures élevées, évitez le contact direct avec les mains et attendez le refroidissement avant de prélever les échantillons. - Répéter les 4.2.2 à 4.2.4 pour la mesure des autres échantillons.
- Éteignez la machine de chauffage par radiofréquence modérée (AFM) et le refroidisseur.
REMARQUE: Utilisez l’eau désionisée à 20 ° C comme contrôle pour la mesure de l’hyperthermie magnétique.
- Mesure de l’hyperthermie magnétique in vivo
- Préparez 3 des souris mâles ICR âgées de 8 semaines d’un poids moyen de 25 ± 2 g.
- Préparer 20 mL de gel de gélatine à 10 % contenant 5 mg/mL de solution d’IONPs.
- Chauffer le gel de gélatine à 40 - 50 °C, injecter immédiatement 500 μL de la solution de gélatine dans le coussinet mammaire droit de l’animal.
REMARQUE: Des expériences d’hyperthermie induite magnétique ont été menées avec la machine de chauffage en utilisant les mêmes paramètres que le test in vitro. - Allumez le champ magnétique alternatif (AFM) et la caméra thermique infrarouge. Placez le coussinet mammaire droit des souris au centre d’une bobine de cuivre à induction magnétique refroidie à l’eau.
- Allumez la caméra thermique infrarouge, imagez la région d’intérêt (coussinet mammaire droit des souris) pendant 10 minutes en continu et enregistrez la température de la région d’intérêt en temps réel.
- Éteignez l’interrupteur d’alimentation de la machine et de la caméra thermique infrarouge après 10 minutes d’induction. Attendez que la température de la bobine de cuivre revienne à la ligne de base pendant 10 min.
- Répétez les 4.3.4 à 4.3.6 pour la mesure d’autres échantillons.
- Éteignez la machine de chauffage par radiofréquence modérée (AFM) et le refroidisseur.
REMARQUE: Faites attention aux températures élevées, évitez le contact direct avec les mains et attendez le refroidissement avant de prélever les échantillons. - Euthanasier des souris par asphyxie au CO2 et luxation des vertèbres cervicales ou toute autre méthode approuvée par le comité de recherche animale de l’Institut.
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Representative Results
Les microbulles à coque de nanoparticules (NSM) à triple réactivité utilisées dans cette étude ont été préparées en agitant le mélange du tensioactif et des INP. Les IONPs (50 nm) se sont auto-assemblés à l’interface du noyau liquide et gazeux, pour former une coque magnétique densément emballée. La morphologie des NSM est illustrée à la figure 1A. Les NSM résultants présentaient une forme sphérique et un diamètre moyen de 5,41 ± 1,78 μm(figure 1B). Les résultats indiquent que les MSN ont été préparés avec succès. Lorsqu’elles sont stockées dans l’eau, les microbulles sont restées intactes pendant plus de 1 an et ont été stables dans les tampons et le milieu de culture cellulaire pendant au moins 10 jours19. Comme le montre la figure 1D,une libération progressive de Fe a été obtenue en augmentant le nombre de cycles d’échographie appliquée. Après 10 cycles, environ 20 % du Fe a été libéré. Jusqu’à 50 cycles d’échographie, la quantité de Fe libérée a atteint un plateau d’environ 80%. Ces résultats suggèrent la libération à la demande d’IONPs par un déclencheur d’échographie externe.
La mesure photothermique médiée par les IONPs en solution aqueuse est illustrée à la figure 2. La température des IONP augmentait rapidement avec l’augmentation du temps d’irradiation comme le montre la figure 2A,B. Une augmentation de 30 °C de la température pourrait être obtenue en étant exposé à un laser NIR (808 nm,1W/cm2)pendant 10 min à la concentration de Fe de 5 mg/mL.
La chaleur générée par les PTT pourrait tuer les cellules cancéreuses. La viabilité de la cellule 4T1 par PTT a été évaluée par laser NIR (808 nm, 1W/cm2)pendant 10 min. Comme le montre la figure 3A,B,par rapport au groupe témoin, il n’y avait aucune différence dans la morphologie et le nombre de cellules vivantes lorsqu’elles étaient incubées avec une concentration élevée de Fe (5 mg / mL), suggérant la bonne biodisponibilité des IRP. Une fois irradiées par laser NIR, les cellules sont devenues de forme ronde, indiquant une apoptose. La quantification du nombre de cellules vivantes, c’est-à-dire la viabilité des cellules, est illustrée à la figure 3C. Les cellules incubées avec une concentration élevée d’IONPs (3,65 mg / mL et 5 mg / mL) sous irradiation NIR avaient le taux de mortalité le plus élevé, qui est d’environ 80% et 100% respectivement. La faible concentration d’ITP (1,025 mg/mL et 1,35 mg/mL) du groupe traité a montré une efficacité de mise à mort similaire à environ 40 %. Les résultats démontrent que l’effet photothermique du NSMS peut traiter efficacement le cancer.
Comme le montre la figure 4A,B,la température de la zone d’injection de gélatine a rapidement augmenté d’environ 20 °C après 5 minutes d’irradiation NIR. La température de surface réelle de la zone d’intérêt chez la souris pourrait être atteinte à environ 57 ° C. Comme le montre la figure 5, lorsqu’elle est exposée à l’AFM, l’imagerie thermique de différentes concentrations d’IONP (1,05 mg/mL, 1,35 mg/mL, 3,65 mg/mL, 5 mg/mL) est surveillée par une caméra thermique infrarouge(figure 5A),et les courbes de température élevée sont enregistrées et tracées à différents intervalles de temps(figure 5B). Parmi eux, les IONP de 1,35 mg/mL, 3,65 mg/mL et 5 mg/mL pourraient rapidement chauffer la solution et augmenter la température (20 °C, 30 °C, 40 °C, respectivement) après 10 min d’induction. Les résultats démontrent une réponse au champ magnétique alternatif caractéristique du NSMS.
Dans l’expérience d’hyperthermie magnétique in vivo, des souris ont été exposées à l’AFM à la fréquence de 415 kHz et à l’amplitude magnétique de 1,8 kA/ m pendant 10 min. Le processus de chauffage a été surveillé par une caméra thermique infrarouge en temps réel(Figure 6A, 6B). Des changements de température significatifs de la zone d’intérêt ont été observés (Figure 6). La température a augmenté rapidement avec le temps, avec un incrément de 50 °C pendant 10 min d’induction.
Figure 1 : Caractérisation et libération contrôlée des ITP des NSM. (A) Image microscopique représentative en champ lumineux des NSM. Barre d’échelle : 20 μm. (B) La distribution du diamètre des NSM, n = 200. (C) Le schéma de l’équipement à ultrasons utilisé dans l’expérience. (D) Profils cumulatifs de rejet d’IRP provenant de MSN sous stimulation échographique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Mesure photothermique médiée par les IONPs en aqueux. (A) Images thermiques infrarouges de différentes concentrations d’IONPs après 10 min d’irradiation laser à 808 nm pour 1 W/cm2. (B) Courbes d’élévation de température typiques de différentes concentrations d’IONP (808 nm, 1 W/cm2, 10 min). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Mesure photothermique médiée par les ITP dans les cellules 4T1. (A) Images de microscopie à fluorescence confocale de cellules 4T1 vivantes après 24h d’incubation avec différentes concentrations d’IRP (colorées avec de la calcéine-AM, vert). Les cellules traitées NIR ont été exposées au laser 808 nm pendant 10 min (1 W/cm2). Barre d’échelle: 50 μm. (B) Courbes typiques d’élévation de température de différentes concentrations de cellules 4T1 traitées par IONP pendant 10 min d’irradiation NIR (1 W/cm2). (C) Quantification de la viabilité des cellules 4T1 incubées avec des IONP à différentes concentrations avec ou sans traitement NIR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Mesure photothermique in vivo médiée par les IONP. (A) Images thermiques infrarouges de la région d’intérêt de la souris exposée au laser NIR (808 nm, 1 W/cm2,10 min) capturées à différents intervalles de temps. (B) Courbes de température élevées à différents intervalles de temps après traitement au laser NIR (808 nm, 1 W/cm2,10 min). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Mesure de l’hyperthermie magnétique médiée par les ITP en aqueuse. (A) Images thermiques infrarouges de différentes concentrations de solution d’IONPs sous l’AFM à la fréquence de 415 kHz et de l’amplitude magnétique de 1,8 kA/m pendant 10 min. (B) Courbes de température typiques de différentes concentrations de solution d’IONPs sous aFM à la fréquence de 415 kHz et à l’amplitude magnétique de 1,8 kA/m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6 : Hyperthermie magnétique in vivo médiée par les ITP. (A) Images thermiques infrarouges de la région d’intérêt des souris capturées à différents intervalles de temps sous l’AFM à la fréquence de 415 kHz et à l’amplitude magnétique de 1,8 kA/m pendant 10 min. (B) Courbes de température élevée à différents intervalles de temps sous AFM à la fréquence de 415 kHz et à l’amplitude magnétique de 1,8 kA/m. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici, nous avons présenté un protocole de fabrication de microbulles à enveloppe de nanoparticules d’oxyde de fer (NSM) par auto-assemblage, synergie magnétique, acoustique et réactivité optique dans une plate-forme nanothérapeutique. Les IAP étaient densément emballés autour du noyau d’air pour former une coquille magnétique, qui peut être contrôlée par le champ magnétique externe pour le ciblage. Une fois délivrés, la libération d’IONP peut être obtenue par déclenchement par ultrasons. Les ITP libérés peuvent être activés à la fois par la lumière NIR et l’AFM pour PTT et MHT, ou la combinaison des deux.
Pendant tout le protocole, les étapes de synthèse des NSM jouent un rôle important, qui est la base de l’ensemble du protocole. Dans le même temps, la libération contrôlée d’INP in vitro a validé la réponse acoustique des NSM. Le protocole de mesure photothermique en solution aqueuse et de mesure de l’hyperthermie magnétique en solution aqueuse a également validé la réponse magnétique et optique des NSM respectivement.
Afin de préparer les NSM avec succès, la solution d’IONPs doit être sonique pendant 20 minutes avant utilisation pour assurer la dispersion uniforme des IONPs dans l’eau. Lorsque l’agitation a été effectuée, la sonde d’homogénéisateur doit être complètement immergée dans la solution. Lors de l’étude de la réponse acoustique des NSM, le tube d’échantillonnage doit être placé directement sur le dessus du transducteur et attirer les NSM vers le bas du tube par l’aimant pour éviter l’atténuation de l’intensité des ultrasons. En outre, si l’augmentation de la température n’était pas significative pendant la mesure photothermique ou la mesure de l’hyperthermie magnétique, cela peut être dû au fait que l’échantillon n’était ni au centre du faisceau laser ni au centre d’une bobine de cuivre à induction magnétique refroidie à l’eau.
Il convient de noter que le protocole présente encore certaines limites. Par exemple, bien que le diamètre moyen des NSM préparés soit similaire au diamètre de certaines microbulles cliniquement utilisées22 (pour l’imagerie par ultrasons), cependant, l’uniformité de la taille des NSM doit être améliorée. En outre, la circulation des NSM dans le sang doit être améliorée par la modification de la surface des microbulles. En dehors de cela, la thérapie synergique n’a pas été vérifiée in vivo, et l’efficacité thérapeutique in vivo est encore inconnue.
La stratégie d’administration d’ITP proposée permet non seulement d’obtenir la libération à la demande d’IONPs, mais favorise également la pénétration des IONPs dans le tissu tumoral. Actuellement, l’augmentation de la pression du liquide interstitiel dans la tumeur et le stroma tumoral dense limitent considérablement l’efficacité de livraison des nanoparticules5. Par conséquent, ce protocole fournit une stratégie de pénétration tissulaire pour l’administration de nanomédecine et présente un grand intérêt dans le traitement du cancer.
Nous avons également démontré que les PTT et les MHT médiés par les ITP sont efficaces à la fois in vitro et in vivo. Les résultats ont montré que les ITP avaient une bonne conversion photothermique et des capacités de conversion thermique magnétique et pouvaient ablater la tumeur efficacement. La combinaison des PTT et du MHT était suffisante pour assurer la mort complète des cellules cancéreuses et améliorer l’efficacité des anticancéreux. À l’avenir, la double thérapie thermique (ptt et MHT) par les NSM offrira une nouvelle option pour le traitement des tumeurs solides profondes dans les cliniques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81601608) et NUPTSF (NY216024).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 808 nm laser power | Changchun New Industries Optoelectronics Tech | MDL-F-808-5W-18017023 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher SCIENTIFIC | C3099 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Function generator | Keysight | 33500B series | 20 MHz, 2 channels with arbitrary waveform generation capability |
| Gelatin gel | Sigma | 9000-70-8 | |
| Heating machine | Shuangping | SPG-06- II | |
| Homemade focused transducer | Frequency=855, R-X=36.2W+5.8W, |Z|-θ=37W+8° | ||
| Homogenizer | SCILOGEX | D-160 | 8000-30000 rpm |
| Hydrophone | T&C | NH1000 | |
| ICR male mice | OG Pharmaceutical. Co. Ltd | 8-week-old | |
| Inductively coupled plasma optical emission spectrometry | PerkinElmer | ||
| Infrared thermal imaging camera. | FLIR | E50 | |
| Iron(II,III) oxide | Alfa Aesar | 1317-61-9 | 50-100nm APS Powder |
| Laser power meter | Changchun New Industries Optoelectronics Tech | ||
| Oscilloscope | Keysight | DSOX3054T | Bandwidth 500 MHz, Sampling Rate 5 GS/S, 4 channels |
| RF Power Amplifier | T&C | AG1020 | The signal source can also be connected to an external signal source. The gain can be adjusted from 0 to 100%. It has multiple functions such as frequency sweep, pulse, and triangle. |
| Roswell Park Memorial Institute-1640 | KeyGEN BioTECH | KGM31800 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 151-21-3 |
References
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