Summary
本論文は、TIVA培地にY-27632を添加することで、成人の皮膚組織からのメラノサイトの収率を有意に増加させることができると報告している。
Abstract
皮膚組織からの原発メラノサイトの分離と培養は、生物学的研究にとって非常に重要であり、臨床応用に広く使用されている。従来の方法で皮膚組織から一次メラノサイトを単離することは、通常、十分に通過するのに約3〜4週間かかる。さらに重要なことは、使用される組織は通常新生児の前皮であり、成人組織から原発性メラノサイトを効率的に分離することは依然として課題である。我々は最近、Rhoキナーゼ阻害剤であるY-27632を初期培養培地に48時間添加するメラノサイトの新しい分離法を開発した。我々は、この新しい方法を、一次メラノサイトを効率的に培養するために成体表皮を用いてより詳細に記述する。重要なことは、この新しい方法で調製された成体組織から得られたメラノサイトが正常に機能できることを示す。この新しいプロトコルは、容易にアクセスできる成人皮膚組織から調製された原発性メラノサイトを用いた色素沈着欠陥および黒色腫の研究に大きな利益をもたらす。
Introduction
本研究の目的は、生物学的研究および臨床応用のために、成人皮膚の表皮からメラノサイトを分離するためのシンプルで効果的なプロトコルを開発することであった。皮膚の基底表皮や毛包に位置するメラノサイトは、メラニン1を産生することによって皮膚および毛髪の色素沈着に重要な役割を果たす。表皮メラノサイトから得られた皮膚色素沈着は、皮膚2の下層細胞へのDNA損傷を減少/予防する紫外線照射フィルターとして作用する。皮膚におけるメラノサイトの異常増殖は、良性ネビ(ほくろ)の形成など、メラノサイトが発癌性増殖に変わる可能性があり、その後に細胞老化が続くなど、非常に一般的である。
1957年以来、ヒト原発メラノサイトの分離とその後の培養は4つ可能であったが、1982年以来、表皮5からヒトメラノサイトの培養を再現的に確立できる効率的な方法があった。表皮から一次メラノサイトを分離する従来の方法は、2段階の酵素消化を伴う。簡単に言えば、皮膚は最初に表皮を真皮から分離するためにディスパスで消化され、その後表皮をトリプシンで消化してメラノサイトおよびケラチノサイトを含む懸濁液を産生し、異なる培地で選択的に成長させることができる。現在、初期培養は通常、メラノサイトが従来の方法を用いて合流に達するまでに約3〜4週間かかり、これはそれらの単離の効率が低いためである可能性が高い。したがって、成人の皮膚組織からのメラノサイトの初期産生を増加させることは、実験室での研究と臨床応用の両方に非常に有用であろう。
多くの成長因子は、その大部分が角化細胞(例えば、α-MSH、ACTH、bFGF、NGF、ET-1、GM-CSF、HGF、LIFおよびSCF)によって分泌されることが示されている55-8、8哺乳類メラノサイトの分化および増殖を調節する。フィーダー層がない場合、これらの成長因子の欠如は、メラノサイトの増殖の減少およびそれらの増加したアポトーシス9につながる。ケラチノサイトをフィーダー細胞とメラノサイトとの共培養は、メラノサイトの増殖を加速し、アポトーシスを減少させる可能性がある。しかし、この共培養法は、より多くの皮膚組織を必要とし、ケラチノサイトを調製する必要があるが、これは実用的ではないが、メラノサイトに必要な培養条件がケラチノサイトの成長を好まないため、効率的に働くことができなかった。
これまでの研究では、ROCK阻害剤であるY-27632を成長培地に添加することで、皮膚組織10~14-14からヒト初代表皮細胞の収率を高めることができることが報告されている。したがって、ヒトの原発メラノサイトの単離がY-27632の存在から恩恵を受けるかどうかをテストすることは興味深いであろう。実際に、TpA、IBMX、Na3VO4およびdbcAMPを含む接種TIVA培地15にY-27632を添加すると、初期培養316において包皮組織から分離された一次メラノサイトの収率が有意に増加した。従来のプロトコルと比較して、この新しいプロトコルはメラノサイト16の収率を上げる上でかなり効率的である。したがって、このプロトコルは、基礎的および応用生物学的研究におけるその応用を促進するために、以前の研究16に基づいて成人皮膚組織を用いて新しい方法を詳細に記述する。
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Protocol
この議定書における成人包皮組織の使用は、人間研究倫理委員会(No.2015120401、日付:2015年5月12日)によって承認されています。
注:細胞や培養物の汚染を防ぐために、滅菌環境で次の手順をすべて実行します。
1. 準備
- 10 mLのリン酸緩衝塩水(PBS)を含む15mLチューブで割礼手術から新鮮な成人包皮組織を収集し、4°Cで保存します。
注:切除後24時間以内に、以下の詳細に従って組織を分離してください。 - 試薬および培養培地を準備する。
- 洗浄液として3%P/S(ペニシリン/ストレプトマイシン)を調製します。PBS 50 mL をペニシリン 1.5 mL (100 U/mL) とストレプトマイシン (100 mg/L) (P/S) と混合します。
- 酵素消化の中和のための終了溶液(中和溶液)を準備します。1%P/S、10%ウシ胎児血清(FBS)をDMEM培地に補充する。
- メラノサイトを培養する TIVA 培地を準備します。10%FBS;1x P⁄S⁄グルタミン;50 ng/mL 12-O-テトラポアノイルホルボル-13-アセテート(TPA);1 x 10-4 M 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX);1 μM Na3VO4;1 x 10-3 M N-6,2′-ジブチリラデオシン-3′,5′環状一リン酸(dbcAMP)。
2. 従来の方法
- 皮膚組織前処理
- 各成体の包皮組織を1回、10mLの75%エタノール(アルコール)を30分間リンスし、10mLの洗浄液(3%P/S)で2回洗い流し、それぞれ5分間洗い流します。
注:血液量が多い場合は、最初に10 mLのPBSで包皮組織を洗浄してください。すべての洗い物は100のmm細胞培養皿で準備される。 - 100 mm細胞培養皿のカバーで皮下脂肪組織と緩い結合組織を除去するために外科用ブレードで各包皮組織を掻き取ります。
注:薄い表皮と密真皮が残るまで、脂肪層を削り取るためにメスを使用してください。 - 真皮側を下にして、大人の包皮を別の100mmの培養皿に移します。
注:各大人の包皮組織をメスの刃を使用して3〜4mm幅のストリップに切り、ディスパーゼをより効率的に動作させます。 - 大人の包皮組織を含む各100mm培養皿に2.5mg/mLのディスパーゼを加え、4°Cで16〜20時間インキュベートします。
注:組織の各グラムは、10 mLのディスパゼ溶液で消化されます。
- 各成体の包皮組織を1回、10mLの75%エタノール(アルコール)を30分間リンスし、10mLの洗浄液(3%P/S)で2回洗い流し、それぞれ5分間洗い流します。
- 成人包皮組織からの表皮の分離
- 16〜20時間消化した後、ピンセットを使用して真皮から表皮を分離する。1つのツイーザーと別のトゥイザーと表皮部分の対応する位置で組織の真皮端の片側をつかみ、表皮を穏やかに剥がします。
- 表皮3xを洗浄液(3%P/S)で洗浄し、表皮をチューブに移します。
- 5 mLの0.05%トリプシンをチューブに加えて表皮を水に沈め、37°Cで30分間水浴中にインキュベートします。
注:チューブを振って、インキュベーションの前に表皮が完全に水没していることを確認します。
- プライマリセルの収集と培養
- 等量の終端溶液(10%FBS、DMEMで1%P/S)を加えて、トリプシンを中和し、溶液を上下に10〜15回ピペットして表皮細胞を分離します。
- 100 μm メッシュフィルターを通して新しい 50 mL チューブにセル懸濁液を入れ、残骸を除去します。
- 200 x gで 5 分間遠心分離機。
- 上清を取り除き、10 mLの接種TIVA培地を加えて細胞を再懸濁します。
- 再懸濁した細胞を100mm培養皿に播種します。
- 5%CO2を有する37°Cインキュベーター2での培養.
- 2日ごとにメディアを変更します。
- 彼らは80%合流に達するとパッセージ細胞。
3. 新しい方法
注:新しい方法での組織の調製および消化の手順は、従来の方法について上記と同じであり、唯一の違いは、単離された新鮮な細胞が10μM Y-27632を含むTIVA培地の10 mLに再懸濁されることである。
- シード処理の2日後、Y-27632を使用せずに通常のTIVA培地に交換してください。その後、培養条件は、新しい方法と従来の方法との間で同じである。
4. 細胞の通過
- TIVA培地を取り出し、各培養皿をPBSで2回洗いすます。
- 100mm細胞培養皿あたり0.05%トリプシンを2 mL加えます。
注:消化酵素と皿の底部との間に適切な接触を確保するために皿を振ります。 - 37°Cインキュベーターで2分間消化します。
- 顕微鏡を使用して細胞を確認し、ほとんどの細胞が細胞培養皿から解離していることを確認します。
注:皿を軽くタップしてセルを放出し、溶液中で切り上げて浮かべます。ほとんどの細胞がタップ後に中断しなかった場合、消化時間を延長しますが、5分以下です。 - 2 mLの終了溶液を加えてトリプシン活性を中和した後、メラノサイトを15 mLチューブに移します。200 x gで 5 分間遠心分離機。
- 上清をゆっくり除去した後、TIVA培地の10mLで各細胞ペレットを再懸濁し、メラノサイトの数をカウントする。
- 100mm細胞培養6皿あたり10mLのTIVA培地で約1x106メラノサイトをプレートする。
- 細胞培養培地を48時間ごとに更新する。
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Representative Results
図1は、従来法と新しい方法を比較したスケマティックダイアグラムを示す。新しい方法による組織の調製および消化の手順は、従来法の手順と同じであり、唯一の違いは、単離された細胞が10μM Y-27632の存在下でTIVA培地の10mLで再懸濁されることである。シード処理の2日後、Y-27632を使用せずに通常のTIVA培地に交換してください。皮膚組織から原発性メラノサイトを単離する従来の方法は、通常、メラノサイトが十分な数で増殖するのに約3〜4週間を要するが、さらに重要なことに、組織は通常新生児から来ており、成人の皮膚組織から原発メラノサイトを分離することは非常に困難である。しかし、新しい方法を用いて、成体組織由来のメラノサイトは、従来の方法を用いて単離されたメラノサイトよりも有意に多い数で観察される。従来法と新しい方法を用いて、成体皮膚組織からメラノサイトを単離した場合の顕微鏡的な見解は3日目、6日目および8日目にとられた(図2A)。これらの顕微鏡的な見解では、新しい方法は6日目と8日目にメラノサイトの収率を有意に増加させた。メラノサイトの数は、3日目、6日目、8日目に少なくとも10個の異なる微小フィールドを数えることによって定量化された。その結果、新しい方法を用いて単離されたメラノサイトの数が、6日目および8日目の従来法を用いて分離されたメラノサイトの数よりもはるかに多いことが示された(図2B)。培養の8日後、メラノサイトをトリプシンを用いて収穫し、100mm皿1個1個に自動セルカウンターでカウントし、新しい方法でメラノサイト収量を約5倍に増やしたことを明らかにした(図2C)。9日目に撮影した顕微鏡的な見解は、通過後1日、通過後1日、通過したメラノサイトが正常に増殖することを示した(図2D)、これはKi67染色によって確認された(図2E)。
分離後の初期培養時のY-27632によるメラノサイトの収率の向上は、前の刊行16においてケラチノサイトの調節を通して示されている。図3に示すように、Y-27632は、継代体メラノサイトの増殖および増殖を増加させず(図3A-B)、メラノサイトのアポトーシスを阻害しなかった(図3C-D)。しかし、Y-27632は、ケラチノサイトの付着物(図3E-H)を有意に増加させ、メラノサイト培養TIVA培地においてその生き残り(図3I)も促進した。Y-27632の存在下でケラチノサイトと共培養するか、またはY-27632に由来する調整培地を投与したケラチノサイトは、メラノサイトの増殖を有意に増強することができた(図3J)。
新しい方法を用いて分離したメラノサイトをさらに特徴付けるために、MITFは、特定のメラノサイトマーカーを、免疫蛍光(IF)染色を用いて、初回の合格後のメラノサイトの純度をチェックして分析した。図4Aは、通過1でMITFを発現する細胞の割合が100%近くであったことを示し、新しい方法による第1の通過後に純粋なメラノサイトが得られたことを示し、これは従来法と同様である。新しい方法を用いて分離したメラノサイトが正常に機能できるかどうかを試験するために、彼らは2日間のインビトロでフォルスコリン(FSK)で処理し、メラノサイトの色素沈着のレベルを誘導した(図4B)。これらのデータを組み合わせることで、新しい方法を用いて単離されたメラノサイトが正常に機能し、顔料を産生できることを示唆している。
図1:新しい方法と従来法の比較このスキームは、従来の方法と新しい分離法の比較を示しています。唯一の違いは、10 μM Y-27632の存在下で、単離された新鮮な細胞をTIVA培地の10 mLに再懸濁する点です。播種の2日後、培地はY-27632なしで通常のTIVA培地に置き換えられる。新しい方法は、通常、8日目頃に通過に適したメラノサイトの密度を達成し、従来の方法は通常、過渡のために十分な数のメラノサイトを成長させるために約20日かかる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:新しい分離法により、原発性メラノサイトの産生が増加する。(A)初接種後3日目、6日目、8日目に従来法(上段)と新しい方法(一番下の行)で調製したメラノサイトの代表的な画像。(B)従来法を用いて調製したメラノサイト数の定量化、新しい方法では、3日目、6日目、8日目の少なくとも10種類の微視的なフィールド(細胞数/視力)でメラノサイト数を数える。すべての実験を三重で行い、結果は顕微鏡場当たりの平均細胞数として表される。(C)培養後8日間、トリプシンを用いてメラノサイトを収穫し、従来法を用いて作製したメラノサイトの数を、セルカウントプレートを用いて新しい方法でカウントした。細胞数は三重実験から計算し、その結果、100mm皿当たりの平均細胞数を示した。(D)自動細胞カウンターを用いてメラノサイトの数を数えた後、新しい料理に播種した従来法または新しい方法を用いて調製したメラノサイトを9日目に撮影した。(E)新しい方法を用いて単離されたメラノサイトは、通路0または通路1で、Ki67抗体(赤色)およびDAPI(核、青色)で固定染色した。(B-C), 学生のt-テストは、新しい方法と従来の方法の違いを分析するために使用されました, ** P < 0.01, ***P < 0.005.すべてのスケールバーは100 μmを表します。
図3:Y-27632は、角化細胞の調節を通じてメラノサイトの成長を増強する。(A)純粋なメラノサイト(パッセージ3)を12、24、48、および60時間の10μM Y-27632で処理し、メラノサイトの数をCCK-8アッセイで分析した。(B)純メラノサイト(パッセージ3)を10μM Y-27632で48h処理し、Ki67染色に固定した。DAPI核染色で示された総生細胞中のKi67陽性細胞の割合の定量化。(C-D)純粋なメラノサイト(パッセージ3)を48時間10μM Y-27632で処理した後、アカチンV-FITCおよびプロピジウムヨウ化プロピジウムを用いてFACS分析(C)またはTUNELアッセイのために固定したアポトーシス細胞に染色した。(E)トリプシン消化後の単離された表皮を、Y-27632(10μM)を伴うかどうかにかかわらずTIVA培地でメッキし、2日後に角質細胞の蛍光分析を汎サイトケラチン抗体(pan-ck)で行った。(F) Y-27632処理におけるケラチノサイトの定量化および(E)から管を制御し、合計500個の細胞中のケラチノサイトの割合としてカウントする。(G)純粋な通路3ケラチノサイトは、Y-27632(10 μM)の有無にかかわらずTIVA培地に播種した。表皮細胞の画像は、播種後1日で示される。(H) Y-27632処理における付着ケラチノサイトの定量化および(G)からの管の制御は、合計5000個の細胞に結合した細胞の割合として播種した。(I)純粋な通路3ケラチノサイトは、Y−27632の存在または不在においてTIVA培地でメッキされた。顕微鏡画像は24時間で得られた。(J)左パネル:示された添加物を含む4群のTIVA培地で等数の純通路3メラノサイトをメッキした:1)Y-27632(10μM)単独(グラフではY)、2)通過3角化細胞単独、3)角化細胞およびY-27632(10μM)およびY-27632(10μM))、及びY-27632(10μM))、及び負性(K)を示した。陰性対照と比較してメラノサイト増殖における相対的な折り畳み変化は、めっき後24時間及び48時間でメラノサイトの数を数えることによって決定した。右パネル:調整されたTIVA培地は、48時間で48時間で3個のメラノサイト培養液を3基の通過から得た。次に、同数の通過3メラノサイトを4群にメッキし、それぞれに1つの条件付き培地を付けた。陰性対照と比較してメラノサイト増殖における相対的な折り畳み変化は、めっき後24時間及び48時間でメラノサイトの数を数えることによって決定した。(A-J)すべての実験は 3 回繰り返されています, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005.画像内のすべてのバーは100 μmを表します。この図はMi et al.16から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:新しい方法を用いて単離されたメラノサイトの特性評価(A)新しい方法または従来法を用いて調製したメラノサイトにおけるMITF(赤)の免疫蛍光染色の代表的な画像。DAPIは核(青)を染色する。(B)細胞ペレットを新しい方法を用いて調製したメラノサイトから採取し、フォルスコリン(FSK)またはDMSO車体を対照(con)として2日間処理した。すべてのスケールバーは100 μmを表します。
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、最近の出版物16に基づいていました。新しい方法で最良の結果を得るためには、次の重要な手順に注意を払う必要があります。まず、表皮と真皮の分離が成功することが重要です。メスの刃を使用して大人の包皮組織を3〜4mm幅のストリップに切り、ディスパーゼをより徹底的かつ簡単に作業させ、表皮を真皮から分離します。第二に、これら2層を分離する場合、真皮の汚染は、真皮線維芽細胞がメラノサイト培地においても増殖することができるので避けるべきである。第三に、トリプシン消化ステップは30分未満でなければなりません。さもなければ、分離された細胞の生存率を著しく低下させる。
この新しい方法は、メラノサイトの分離に必要な時間を大幅に短縮します。ヒト表皮メラノサイトはメラニンを産生し、皮膚を日光照射の損傷から守ります。アイジンガーとマルコは、表皮5からヒトメラノサイトの培養のための最初の実用的な方法を提案した。最も重要なことは、使用される組織は通常新生児から来ており、成人の皮膚組織から原発性メラノサイトを分離することは非常に困難である。このRho関連タンパク質キナーゼ阻害剤Y-27632は、表皮幹細胞単離11~13-13の効率を著しく向上させる。また、Y-2763210, 11,の存在下でヒト初表皮細胞を皮膚組織から単離する方法も報告した。このプロトコルでは、Y-27632は、一次メラノサイトの収率を効率的に増加させることが示された。従来の方法を使用すると、低い細胞回収率を有し、メラノサイトが通過するのに十分な数で成長するために培養の約3〜4週間を必要とします。この新しい方法は、TIVA成長培地にY-27632を添加し、メラノサイト収率を約5倍増加させ、得られたメラノサイトが正常に増殖し得る。また、市販の媒体を用いて新しい方法をテストし、同様の結果を見つけました。関連するメカニズムに関して、最近の研究では、Y-27632がメラノサイトの分離の効率を高める効果が主にケラチノサイト16を介して起こることを実証した。
重要なことは、新しい方法を用いて、正常な機能を有する純粋なメラノサイトを得た。このパッセージ1(P1)メラノサイトは、第1の通過後に純粋なメラノサイトが得られていることを示すMITF発現に対してほぼ全て染色した。高成長の可能性を有する原発性メラノサイトは、生物学的研究および臨床応用にとって非常に重要である。新しい方法を用いて単離されたメラノサイトは、環状AMPレベルを増加させるアデニル酸シクラーゼの活性化剤であるフォルスコリンによる処理後に色素に誘導することができ、これらのメラノサイトが正常に機能し得ることを示し、色素沈着欠陥および黒色腫14の研究に有用であろう。
要約すると、成人の皮膚組織から原発性メラノサイトを分離するために、高効率な方法が確立されました。この改善された方法は、生物学的研究と臨床応用のために迅速にメラノサイトの十分な数を提供することに貢献することができます.
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Disclosures
すべての著者は、紛争の利害を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家主要研究開発プログラム(2017YFA0104604)、中国国立自然科学財団の一般プログラム(81772093)、軍事物流研究プロジェクト(AWS17J005)、山東省自然科学財団(ZR2019ZD3)のキープログラムによって支援されました 6)と山東省の主要研究開発プログラム(2019GSF108107)からX.W.広東基礎応用基礎研究財団(2019A1515110833)と山東大学基礎研究基金(2019GN043)からJ.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
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