Summary
Dette papir rapporterer, at tilsætningen af Y-27632 til TIVA medium kan øge udbyttet af melanocytter fra voksne hudvæv.
Abstract
Isolering og kultur af primære melanocytter fra hudvæv er meget vigtigt for biologisk forskning og har været meget udbredt til kliniske anvendelser. Isoler primære melanocytter fra hudvæv ved den konventionelle metode tager normalt omkring 3 til 4 uger at passage tilstrækkeligt. Endnu vigtigere, det anvendte væv er normalt nyfødte forskind og det er stadig en udfordring at effektivt isolere primære melanocytter fra voksne væv. Vi har for nylig udviklet en ny isolationsmetode for melanocytter, der tilføjer Y-27632, en Rho kinase hæmmer, til den oprindelige kultur medium for 48 h. Sammenlignet med den konventionelle protokol, denne nye metode dramatisk øger udbyttet af melanocytter og forkorter den tid, der kræves for at isolere melanocytter fra forhud væv. Vi beskriver nu denne nye metode mere detaljeret ved hjælp af voksen epidermis til effektivt at dyrke primære melanocytter. Vigtigere er det, vi viser, at melanocytter fremstillet af voksne væv fremstillet ved denne nye metode kan fungere normalt. Denne nye protokol vil i væsentlig grad gavne undersøgelser af pigmenteringsdefekter og melanomer ved hjælp af primære melanocytter fremstillet af let tilgængelige voksne hudvæv.
Introduction
Målet med denne undersøgelse var at udvikle en enkel og effektiv protokol til at isolere melanocytter fra epidermis af voksen hud til biologisk forskning og kliniske anvendelser. Melanocytter, som er placeret i den basale epidermis af huden og i hårsækkene, spiller en vigtig rolle i pigmentering af hud og hår ved at producere melanin1. Den resulterende hudpigmentering fra epidermale melanocytter fungerer som et ultraviolet strålingsfilter, der reducerer/forhindrer DNA-skader på underliggende celler i huden2. Den unormale spredning af melanocytter i huden er ret almindelig, såsom i dannelsen af godartede nevi (modermærker), hvor melanocytter potentielt omdanne til onkogen vækst efterfulgt af cellulære senescence3.
Siden 1957 har isolation og efterfølgende kultur af menneskelige primære melanocytter været muligt4, men først siden 1982 har der været en effektiv metode, der reproducerbart kan etablere kulturer af menneskelige melanocytter fra epidermis5. Den konventionelle metode til at isolere primære melanocytter fra epidermis indebærer en to-trins enzymatisk fordøjelse. Kort, huden er i første omgang fordøjet med dispase at adskille epidermis fra dermis, hvorefter epidermis er fordøjet med trypsin at producere suspensioner, der indeholder melanocytter og keratinocytter, som derefter kan selektivt dyrkes i forskellige medier. I øjeblikket tager den oprindelige kultur normalt omkring 3 til 4 uger for melanocytter at nå sammenløbet ved hjælp af den konventionelle metode, hvilket sandsynligvis skyldes den lave effektivitet af deres isolation. Derfor ville en forøgelse af den oprindelige produktion af melanocytter fra voksent hudvæv være ganske nyttigt for både laboratorieforskning og kliniske anvendelser.
Mange vækstfaktorer, hvoraf de fleste har vist sig at blive udskædt af keratinocytter (f.eks. α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF og SCF)5-8-8, regulerer differentiering og spredning af pattedyrsmelanocytter. I mangel af feeder lag, manglen på disse vækstfaktorer fører til nedsat spredning af melanocytter og deres øgede apoptose9. Co-kultur keratinocytter som feeder celler og melanocytter kunne føre til accelereret melanocyt spredning og reduceret apoptose. Men co-kultur metode ikke kun kræver mere hudvæv til at forberede keratinocytter, hvilket ikke er praktisk, men også kunne ikke arbejde effektivt, fordi de kulturbetingelser, der kræves af melanocytter ikke favoriserer keratinocyt vækst, og vice-versa.
Tidligere undersøgelser har rapporteret, at tilsætning af Y-27632, en ROCK-hæmmer, i vækstmediet kan øge udbyttet af menneskelige primære epidermale celler fra hudvæv10-14. Derfor ville det være interessant at teste, om isolering af menneskelige primære melanocytter ville drage fordel af tilstedeværelsen af Y-27632. Tilføjelsen af Y-27632 til inokulering TIVA medium15, som indeholder TPA, IBMX, Na3VO4 og dbcAMP, øgede faktisk udbyttet af primære melanocytter isoleret fra forhudvæv i de oprindelige kulturer16. Sammenlignet med den konventionelle protokol, denne nye protokol er betydeligt mere effektiv til at øge udbyttet af melanocytter16. Derfor beskriver denne protokol den nye metode i detaljer ved hjælp af voksen hudvæv baseret på en tidligere undersøgelse16 for at fremme dens anvendelse i grundlæggende og anvendt biologisk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brugen af voksenskindskind væv i denne protokol er blevet godkendt af Human Research Ethics Committee (Nr. 2015120401, dato: Maj 12, 2015).
BEMÆRK: Udfør alle følgende procedurer i et sterilt miljø for at forhindre forurening af celler og kulturer.
1. Forberedelser
- Friske voksenhudevæv fra omskæringsoperationer i 15 ml rør indeholdende 10 ml fosfatstødpudesalt (PBS) og opbevares i 4 °C.
BEMÆRK: Udskæn noget af vævene som beskrevet nedenfor inden for 24 timer efter deres excision. - Forbered reagenser og dyrkningsmedium.
- Klargør 3% P/S (penicillin/streptomycin) som vaskeopløsning. Der blandes 50 ml PBS med 1,5 ml penicillin (100 U/ml) og streptomycin (100 mg/l) (P/S).
- Klargør termineringsopløsningen (neutraliseringsopløsning) til neutralisering af enzymatisk fordøjelse. Tillæg 1% P/S, 10% føtalt kvægserum (FBS) til DMEM medium.
- Forbered TIVA medium til kultur melanocytter: Ham's F12; 10% FBS; 1x P⁄S⁄glutamin; 50 ng/ml 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetat (TPA); 1 x 10-4 M 3-isobutyl-1-methyl xanthin (IBMX); 1 μM Na3VO4; 1 x 10-3 M N-6,2′-O-dibutyryladenosin-3′,5′-cyklisk monophosphat (dbcAMP).
2. Den konventionelle metode
- Forbehandling af hudvæv
- Skyl hvert voksent forhudvæv én gang med 10 ml 75% ethanol (alkohol) i 30 s, og skyl derefter to gange med 10 ml vaskeopløsning (3% P/S) i 5 min. hver.
BEMÆRK: Vask forhudvæv med 10 ml PBS i begyndelsen, hvis der er meget blod. Alle vasker tilberedes i 100 mm cellekulturretter. - Skrab hvert forhudsvæv med et kirurgisk blad for at fjerne subkutane fedtvæv og løst bindevæv i omslaget til en 100 mm cellekulturskål.
BEMÆRK: Brug en skalpel til at skrabe fedtlagene væk, indtil kun den tynde epidermis og den tætte dermis forbliver. - Overfør hver voksen forhuden til en anden 100 mm kulturskål med dermissiden nedad.
BEMÆRK: Skær hver voksen forhud væv i 3-4 mm brede strimler ved hjælp af en skalpel klinge for at gøre dispase arbejde mere effektivt. - Der tilsættes 2,5 mg/ml dispase til hver 100 mm dyrkningsskål med voksent forhudsvæv og inkuberes i 16 til 20 timer ved 4 °C.
BEMÆRK: Hvert gram væv fordøjes med 10 ml dispaseopløsning.
- Skyl hvert voksent forhudvæv én gang med 10 ml 75% ethanol (alkohol) i 30 s, og skyl derefter to gange med 10 ml vaskeopløsning (3% P/S) i 5 min. hver.
- Adskillelse af epidermis fra det voksne forhudvæv
- Efter fordøjelsen i 16 til 20 timer, adskille epidermis fra dermis ved hjælp af pincet. Tag fat i den ene side af vævsden med en pincet og den tilsvarende placering af den epidermale del med en anden pincet og skræl forsigtigt over epidermisen.
- Epidermis 3x vaskes med vaskeopløsning (3% P/S), og overfør derefter epidermisen i et rør.
- Epidermis nedsænkes ved at tilsætte 5 ml 0,05% trypsin i røret og inkuberes i et vandbad i 30 min ved 37 °C.
BEMÆRK: Ryst røret for at sikre, at epidermis er helt nedsænket før inkubation.
- Indsamling og kultur af primærceller
- Tilføj en tilsvarende mængde termineringsopløsning (10% FBS, 1% P/S i DMEM) for at neutralisere trypsin og pipette opløsningen op og ned 10-15 gange for at adskille de epidermale celler.
- Celleophænget kommer ind i et nyt 50 ml rør gennem et 100 μm maskefilter for at fjerne snavs.
- Centrifuge ved 200 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten, og tilsæt 10 ml inokulering af TIVA-medium for at opslæmme cellerne igen.
- De resuspenderede celler frøs til en 100 mm kulturskål.
- Kultur i en 37° C inkubator med 5% CO2.
- Skift mediet hver anden dag.
- Passage celler, når de når 80% sammenløb.
3. Den nye metode
BEMÆRK: Proceduren for vævsfrembret og fordøjelsen i den nye metode er den samme som beskrevet ovenfor for den konventionelle metode, idet den eneste forskel er, at de isolerede friske celler opslæmmes i 10 ml TIVA-medium, der indeholder 10 μM Y-27632.
- To dage efter såning, erstatte medierne med normal TIVA medium uden Y-27632. Derefter er kulturforholdene de samme mellem de nye og de konventionelle metoder.
4. Cellepassaging
- TIVA-mediet fjernes, og hver dyrkningsskål skylles to gange med PBS.
- Tilsæt 2 ml 0,05% trypsin pr. 100 mm cellekulturskål.
BEMÆRK: Ryst skålen for at sikre tilstrækkelig kontakt mellem fordøjelsesenzymer og bunden af skålen. - Fordøjes i en 37 °C inkubator i 2 min.
- Brug et mikroskop til at kontrollere cellerne, og sørg for, at de fleste celler har adskilt sig fra cellekulturskålen.
BEMÆRK: Bank forsigtigt på skålen for at frigøre cellerne for at runde op og flyde i opløsningen. Forlænge fordøjelsestiden, hvis de fleste celler ikke suspendere efter tapning, men ikke mere end 5 mere min. - Melanocytterne overføres til et 15 ml rør efter neutralisering af trypsinaktiviteten ved at tilsætte 2 ml termineringsopløsning. Centrifuge ved 200 x g i 5 min.
- Opslæmm hver cellepille med 10 ml TIVA-medium efter langsomt at have fjernet supernatanten, og derefter tælle antallet af melanocytter.
- Plade ca. 1 x 106 melanocytter i 10 ml TIVA medium pr. 100 mm cellekulturskål.
- Forny cellekulturmediet hver 48 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et skematisk diagram, der sammenligner de konventionelle og de nye metoder. Proceduren for vævsfrembræmning og fordøjelse med den nye metode er den samme som proceduren for den konventionelle metode, idet den eneste forskel er, at de isolerede celler opslæmmes i 10 ml TIVA-medium i nærvær af 10 μM Y-27632. To dage efter såning, erstatte medierne med normal TIVA medium uden Y-27632. Den konventionelle metode til isolering primære melanocytter fra hudvæv kræver normalt omkring 3 til 4 uger for melanocytter at vokse i tilstrækkeligt antal til passage, men endnu vigtigere, væv normalt kommer fra nyfødte babyer, og det er meget vanskeligt at isolere primære melanocytter fra voksne hudvæv. Men ved hjælp af den nye metode, melanocytter fra voksne væv er observeret i betydeligt større antal end melanocytter isoleret ved hjælp af den konventionelle metode. Mikroskopiske synspunkter blev taget på dag 3, 6 og 8, når isolere melanocytter fra voksne hudvæv ved hjælp af den konventionelle metode og den nye metode (Figur 2A). I disse mikroskopiske visninger øgede den nye metode signifikant udbyttet af melanocytter på dag 6 og 8. Melanocytnumre blev derefter kvantificeret ved at tælle mindst 10 forskellige mikroskopiske felter på dag 3, 6 og 8. Resultaterne viste, at antallet af melanocytter, der er isoleret ved hjælp af den nye metode, er meget højere end antallet af melanocytter, der isoleres ved hjælp af den konventionelle metode på dag 6 og 8 (figur 2B). Efter 8 dages kultur blev melanocytterne høstet ved hjælp af trypsin og derefter talt med en automatiseret celletæller i hver enkelt 100 mm skål, hvilket viste, at den nye metode øgede melanocytudbyttet med omkring fem gange (figur 2C). Mikroskopiske synspunkter taget på dag 9, en dag efter passaging, viste, at de passerede melanocytter spredte sig normalt (Figur 2D), som blev bekræftet af Ki67 farvning (Figur 2E).
Det øgede udbytte af melanocytter af Y-27632 i den oprindelige kultur efter isolation er blevet påvist gennem regulering af keratinocytter i en tidligere publikation16. Som vist i figur 3øgede Y-27632 ikke væksten og spredningen af passagersmelanocytter (figur 3A-B) og hæmmede ikke apoptose af melanocytter (figur 3C-D). Men Y-27632 øget keratinocyt fastgørelse (Figur 3E-H) og også fremmet sin overlevende (Figur 3I) i melanocyt-kultur TIVA medier. Enten co-kultur med keratinocytter i nærværelse af Y-27632 eller det betingede medium stammer fra Y-27632 behandlede keratinocytter kunne øge væksten af melanocytter (Figur 3J).
For yderligere at karakterisere melanocytter isoleret ved hjælp af den nye metode, MITF, en specifik melanocyt markør, blev analyseret ved hjælp af immunofluorescens (IF) farvning for at kontrollere renheden af melanocytter efter indledende passaging. Figur 4A viser, at procentdelen af celler, der udtrykker MITF ved passage 1, var næsten 100 %, hvilket indikerer, at rene melanocytter blev opnået efter den første passage ved den nye metode, hvilket svarer til den konventionelle metode. For at teste, om melanocytter isoleret ved hjælp af den nye metode kan fungere normalt, blev de behandlet med forskolin (FSK) i 2 dage in vitro, hvilket inducerede niveauerne af pigmentering af melanocytter (Figur 4B). Tilsammen tyder disse data på, at de melanocytter, der er isoleret ved hjælp af den nye metode, kan fungere normalt og kan producere pigment.
Figur 1: Sammenligning af den nye metode og den konventionelle metode. Denne ordning viser en sammenligning af den konventionelle metode med den nye isolationsmetode. Den eneste forskel er, at de isolerede friske celler opslæmmes i 10 ml TIVA-medium i nærvær af 10 μM Y-27632. To dage efter såningen erstattes mediet med normalt TIVA-medium uden Y-27632. Den nye metode normalt opnår en tæthed af melanocytter egnet til passaging på omkring dag 8, mens den konventionelle metode normalt tager omkring 20 dage til at vokse tilstrækkeligt antal melanocytter til passaging. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Den nye isolationsmetode øger produktionen af primære melanocytter. (A) Repræsentative billeder af melanocytter, der er udarbejdet efter den konventionelle metode (øverste række) og efter den nye metode (nederste række) på dag 3, 6 og 8 efter den første vaccination. (B) Kvantificering af melanocytnumre, der er fremstillet ved hjælp af den konventionelle metode og den nye metode ved at tælle melanocytnumre i mindst 10 forskellige mikroskopiske felter (cellenummer/syn) på dag 3, 6 og 8. Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer, og resultaterne udtrykkes som det gennemsnitlige antal celler pr. mikroskopisk felt. (C) Efter dyrkning i 8 dage blev melanocytter høstet ved hjælp af trypsin, og antallet af melanocytter fremstillet ved hjælp af den konventionelle metode, og den nye metode blev optalt ved hjælp af en celletællingsplade. Antallet af celler blev beregnet ud fra tre eksemplarforsøg, og resultaterne viser det gennemsnitlige antal celler pr. 100 mm skål. (D) Efter at have talt antallet af melanocytter ved hjælp af en automatiseret celletæller, blev melanocytter fremstillet ved hjælp af den konventionelle metode eller den nye metode seedet i nye retter og mikroskopiske billeder blev taget på dag 9. (E) Melanocytter isoleret ved hjælp af den nye metode ved passage 0 eller ved passage 1 blev fastgjort og plettet med Ki67 antistof (rød) og DAPI (kerner, blå). (B-C), Student's t-testblev brugt til at analysere forskelle mellem den nye og den konventionelle metode, ** P < 0,01, ***P < 0,005. Alle skalalinjer repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Y-27632 øger melanocyt vækst gennem regulering af keratinocytter. (A) Rene melanocytter (passage 3) blev behandlet med 10 μM Y-27632 for 12, 24, 48 og 60 timer, og antallet af melanocytter blev analyseret af CCK-8-analysen. (B) Rene melanocytter (passage 3) blev behandlet med 10 μM Y-27632 for 48h og derefter blev fastsat for Ki67 farvning. Kvantificering af procentdelen af Ki67 positive celler blandt de samlede levende celler, der er angivet med DAPI-nuklear farvning. (C-D) Rene melanocytter (passage 3) blev behandlet med 10 μM Y-27632 i 48 timer og blev derefter enten plettet for apoptotiske celler med annexin V-FITC og propidium iodid efterfulgt af FACS-analyse (C) eller fastsat for TUNEL-analyse. (E) Isoleret epidermis efter trypsin fordøjelse blev belagt med TIVA medium med eller uden Y-27632 (10 μM) og 2 dage senere immunofluorescens analyse af keratinocytter blev udført med en pan-cytoktratin antistof (pan-ck). ( F) Kvantificering af keratinocytter i Y-27632-behandlede og kontrollerende retter fra (E) som procentdel af keratinocytter i i alt 500 celler tælles. (G) Ren passage 3 keratinocytter blev sået i TIVA medium med eller uden Y-27632 (10 μM). Billeder af epidermale celler vises en dag efter såning. (H) Kvantificering af tilsluttede keratinocytter i Y-27632-behandlede og kontrollerende retter fra (G) som procentdelen af vedlagte celler i i alt 5000 såede celler. (I) Ren passage 3 keratinocytter blev belagt med TIVA medium i nærvær eller fravær af Y-27632. De mikroskopiske billeder blev opnået ved 24 timer (J) Venstre panel: Lige antal rene passage 3 melanocytter blev belagt med TIVA medium i 4 grupper med addition (r) som angivet: 1) Y-27632 (10μM) alene (Y i grafen), 2) passage 3 keratinocytter alene, 3) keratinocytter og Y-27632 (10 μM) (K+Y) og 4) ingen tilsætning (negativ kontrol, con). Relative fold ændringer i melanocyt spredning i forhold til den negative kontrol blev bestemt ved at tælle antallet af melanocytter på 24 h og 48 timer efter plating. Højre panel: Betinget TIVA medier blev indhentet fra de 4 grupper af passage 3 melanocyt kulturer i (venstre panel) på 48 timer efter plating. Derefter blev lige mange passage 3 melanocytter belagt i 4 grupper, hver med et af de betingede medier. Relative fold ændringer i melanocyt spredning i forhold til den negative kontrol blev bestemt ved at tælle antallet af melanocytter på 24 h og 48 timer efter plating. (A-J) Alle forsøg er blevet gentaget i 3 gange, *p<0,05, **p<0.01, ***p<0.005. Alle søjler i billederne repræsenterer 100 μm. Tallet er blevet ændret fra Mi et al.16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Karakterisering af melanocytter isoleret ved hjælp af den nye metode. (A) Repræsentative billeder af immunfluorescensfarvning af MITF (rød) i melanocytter, der er fremstillet ved hjælp af den nye eller den konventionelle metode. DAPI pletter kerner (blå). (B) Cellepiller blev indsamlet fra melanocytter fremstillet ved hjælp af den nye metode og blev behandlet i 2 dage med forskolin (FSK) eller DMSO køretøj som en kontrol (con). Alle skalalinjer repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet her , var baseret på en nylig publikation16. Der bør lægges vægt på følgende kritiske trin for at opnå de bedste resultater med den nye metode. For det første, vellykket adskillelse af epidermis og dermis er afgørende. Skær den voksne forhud væv i 3-4 mm brede strimler ved hjælp af en skalpel klinge for at gøre dispase arbejde mere grundigt og nemt at adskille epidermis fra dermis. For det andet, når de adskiller disse to lag, forurening af dermis bør undgås, da dermal fibroblaster også kan vokse i melanocyt kultur medium. For det tredje bør trypsin fordøjelsestrin være mindre end 30 min; Ellers vil det reducere de isolerede cellers levedygtighed betydeligt.
Denne nye metode væsentligt forkorter den tid, der er nødvendig for melanocyt isolation. Human epidermal melanocytter producere melanin, som beskytter huden mod solbestråling skader. Eisinger og Marko foreslog den første praktiske metode til kultur af menneskelige melanocytter fra epidermis5. Vigtigst er det, det anvendte væv normalt kommer fra nyfødte, og det er meget vanskeligt at isolere primære melanocytter fra voksne hudvæv. Den Rho-associerede proteinkinasehæmmer Y-27632 forbedrer effektiviteten af epidermal stamcelleisolation11-13betydeligt. Derudover rapporterede vi også en metode til at isolere menneskelige primære epidermale celler fra hudvæv i nærvær af Y-2763210,11. I denne protokol viste Y-27632 sig at øge udbyttet af primære melanocytter effektivt. Ved hjælp af den konventionelle metode har en lav celle opsving sats og har brug for omkring 3 til 4 ugers kultur for melanocytter til at vokse i tilstrækkeligt antal til passage. Denne nye metode, hvor Y-27632 føjes til TIVA vækstmedium, øget melanocyt udbytte med omkring fem gange, og melanocytter opnået kan formere sig normalt. Vi har også testet den nye metode ved hjælp af et kommercielt medie og fundet lignende resultater. Med hensyn til den involverede mekanisme viste en nylig undersøgelse, at virkningen af Y-27632 til at øge effektiviteten af melanocytisolation hovedsageligt sker gennem keratinocytter16.
Vigtigt er det, at vi opnåede rene melanocytter med normal funktion ved hjælp af den nye metode. Passage 1 (P1) melanocytter var næsten alle plettet for MITF udtryk angiver, at ren melanocytter opnås efter den første passage. Primære melanocytter med stort vækstpotentiale er meget vigtige for biologisk forskning og kliniske anvendelser. De melanocytter isoleret ved hjælp af den nye metode kan induceres til pigment efter behandling med forskolin, en aktivator af adenylat cyclase, der øger cyklisk AMP niveauer, hvilket indikerer disse melanocytter kan fungere normalt, hvilket vil være nyttigt for at studere pigmenteringsdefekter og melanom14.
Sammenfattende blev en meget effektiv metode med succes etableret for at isolere primære melanocytter fra voksent hudvæv. Denne forbedrede metode kan bidrage til at give et tilstrækkeligt antal melanocytter hurtigt til biologisk forskning og til kliniske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer ingen interesse i konflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af The National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) og Key Research and Development Program i Shandong-provinsen (2019GSF108107) til X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) og The Fundamental Research Funds of Shandong University (2019GN043) til J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
- Costin, G. E., Hearing, V. J. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).
- Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P.
- Eisinger, M., Marko, O. Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).
- Hirobe, T. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).
- Halaban, R., et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).
- Kunisada, T., et al. Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis. Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).
- Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor. Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Yokoyama, S., et al. Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage. Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).
- Mi, J., et al. A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).
