Summary
Dieses Papier berichtet, dass die Zugabe von Y-27632 zu TIVA Medium kann die Ausbeute von Melanozyten aus erwachsenen Hautgewebe deutlich erhöhen.
Abstract
Die Isolierung und Kultur von primären Melanozyten aus Hautgeweben ist sehr wichtig für die biologische Forschung und wurde häufig für klinische Anwendungen verwendet. Die Isolierung von primären Melanozyten aus Hautgewebe nach der herkömmlichen Methode dauert in der Regel etwa 3 bis 4 Wochen, um ausreichend zu durchgehen. Noch wichtiger ist, dass die verwendeten Gewebe in der Regel neugeborene Vorhaut sind und es ist immer noch eine Herausforderung, primäre Melanozyten effizient aus erwachsenen Geweben zu isolieren. Wir haben vor kurzem eine neue Isolationsmethode für Melanozyten entwickelt, die Y-27632, einen Rho-Kinase-Inhibitor, zum ursprünglichen Kulturmedium für 48 h hinzufügt. Im Vergleich zum herkömmlichen Protokoll erhöht diese neue Methode dramatisch die Ausbeute von Melanozyten und verkürzt die Zeit, die erforderlich ist, um Melanozyten aus Vorhautgeweben zu isolieren. Wir beschreiben diese neue Methode nun ausführlicher mit Erwachsenenepidermis, um primäre Melanozyten effizient zu kulturieren. Wichtig ist, dass wir zeigen, dass Melanozyten aus erwachsenen Geweben, die mit dieser neuen Methode hergestellt werden, normal funktionieren können. Dieses neue Protokoll wird Studien zu Pigmentdefekten und Melanomen mit primären Melanozyten, die aus leicht zugänglichen erwachsenen Hautgeweben hergestellt werden, erheblich zugute kommen.
Introduction
Ziel dieser Studie war es, ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung von Melanozyten aus der Epidermis der erwachsenen Haut für biologische Forschung und klinische Anwendungen zu entwickeln. Melanozyten, die sich in der Basalepidermis der Haut und in Haarfollikel befinden, spielen eine wichtige Rolle bei der Pigmentierung von Haut und Haaren durch die Produktion von Melanin1. Die daraus resultierende Hautpigmentierung aus epidermalen Melanozyten wirkt als ultravioletter Strahlungsfilter, der DNA-Schäden an darunter liegenden Zellen in der Haut reduziert/verhindert2. Die abnorme Proliferation von Melanozyten in der Haut ist durchaus üblich, wie bei der Bildung von gutartigen Nevi (Molen), bei denen Melanozyten potenziell zu onkogenem Wachstum transformieren können, gefolgt von zellulärer Seneszenz3.
Seit 1957 ist die Isolation und nachfolgende Kultur menschlicher Primärmelanozyten möglich4, aber erst seit 1982 gibt es eine effiziente Methode, die Reproduzierbar Kulturen menschlicher Melanozyten aus der Epidermisetablierenkann 5 . Die herkömmliche Methode, primäre Melanozyten von der Epidermis zu isolieren, beinhaltet eine zweistufige enzymatische Verdauung. Kurz gesagt, die Haut wird zunächst mit Dispase verdaut, um die Epidermis von der Dermis zu trennen, danach wird die Epidermis mit Trypsin verdaut, um Suspensionen zu produzieren, die Melanozyten und Keratinozyten enthalten, die dann selektiv in verschiedenen Medien angebaut werden können. Derzeit dauert die Anfangskultur in der Regel etwa 3 bis 4 Wochen für Melanozyten, um die Konfluenz mit der herkömmlichen Methode zu erreichen, die wahrscheinlich auf die geringe Effizienz ihrer Isolierung zurückzuführen ist. Daher wäre die Erhöhung der erstmaligen Produktion von Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben sowohl für die Laborforschung als auch für klinische Anwendungen sehr hilfreich.
Viele Wachstumsfaktoren, von denen die meisten nachweislich durch Keratinozyten abgesondert werden (z.B. S-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF und SCF)5-8, regulieren die Differenzierung und Proliferation von Säugetiermelanozyten. In Ermangelung von Feederschichten führt das Fehlen dieser Wachstumsfaktoren zu einer verminderten Proliferation von Melanozyten und ihrer erhöhten Apoptose9. Die Kokultur der Keratinozyten als Feederzellen und Melanozyten könnte zu einer beschleunigten Melanozytenproliferation und reduzierter Apoptose führen. Die Co-Kultur-Methode verlangt jedoch nicht nur mehr Hautgewebe, um Keratinozyten zuzubereiten, was nicht praktikabel ist, sondern konnte auch nicht effizient arbeiten, weil die von Melanozyten geforderten Kulturbedingungen das Keratinozytenwachstum nicht begünstigen und umgekehrt.
Frühere Studien haben berichtet, dass die Zugabe von Y-27632, einem ROCK-Hemmer, in das Wachstumsmedium die Ausbeute menschlicher primärer epidermaler Zellen aus Hautgeweben10-14verbessern kann. Daher wäre es interessant zu testen, ob die Isolierung menschlicher Primärmelanozyten von der Anwesenheit von Y-27632 profitieren würde. Tatsächlich erhöhte die Zugabe von Y-27632 in das Inokulations-TIVA-Medium15, das TPA, IBMX, Na3VO4 und dbcAMP enthält, die Ausbeute von primären Melanozyten, die aus Vorhautgeweben in den Ausgangskulturen isoliert sind, signifikant16. Im Vergleich zum herkömmlichen Protokoll ist dieses neue Protokoll deutlich effizienter bei der Erhöhung der Ausbeute an Melanozyten16. Daher beschreibt dieses Protokoll die neue Methode im Detail unter Verwendung von erwachsenen Hautgeweben auf der Grundlage einer früheren Studie16, um ihre Anwendung in der Grundlagen- und angewandten biologischen Forschung zu fördern.
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Protocol
Die Verwendung von erwachsenen Vorhautgewebeinteilen in diesem Protokoll wurde von der Human Research Ethics Committee (Nr.2015120401, Datum: 12. Mai 2015) genehmigt.
HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Verfahren in einer sterilen Umgebung durch, um Kontaminationen von Zellen und Kulturen zu verhindern.
1. Vorbereitungen
- Sammeln Sie frisches vorhauthaltiges Gewebe aus Beschneidungsoperationen in 15 ml-Röhrchen, die 10 ml Phosphatpuffer-Saline (PBS) enthalten, und lagern Sie es in 4 °C.
HINWEIS: Trennen Sie die Gewebe, wie unten beschrieben, innerhalb von 24 h nach ihrer Exzision. - Bereiten Sie Reagenzien und Kulturmedium.
- Bereiten Sie 3% P/S (Penicillin/Streptomycin) als Waschlösung vor. Mischen Sie 50 ml PBS mit 1,5 ml Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 mg/L) (P/S).
- Bereiten Sie die Terminlösung (Neutralisationslösung) zur Neutralisierung der enzymatischen Verdauung vor. Zuschlag 1% P/S, 10% fetales Rinderserum (FBS) in DMEM medium.
- Bereiten Sie TIVA Medium-zu-Kultur-Melanozyten vor: Ham s F12; 10% FBS; 1x P-S-Glutamin; 50 ng/mL 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetat (TPA); 1 x 10-4 M 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX); 1 M Na3VO4; 1 x 10-3 M N-6,2-O-Dibutyryladenosin-3,5-zyklisches Monophosphat (dbcAMP).
2. Die konventionelle Methode
- Hautgewebe-Vorbehandlung
- Spülen Sie jedes erwachsene Vorhautgewebe einmal mit 10 ml 75% Ethanol (Alkohol) für 30 s, und spülen Sie dann zweimal mit 10 ml Waschlösung (3% P/S), für jeweils 5 min.
HINWEIS: Waschen Sie Vorhautgewebe mit 10 ml PBS am Anfang, wenn es viel Blut gibt. Alle Wässer werden in 100 mm Zellkulturschalen zubereitet. - Zerkleinern Sie jedes Vorhautgewebe mit einer chirurgischen Klinge, um subkutane Fettgewebe und lose Bindegewebe in der Abdeckung einer 100 mm Zellkulturschale zu entfernen.
HINWEIS: Verwenden Sie ein Skalpell, um die Fettschichten wegzukratzen, bis nur die dünne Epidermis und die dichte Dermis übrig bleiben. - Übertragen Sie jede erwachsene Vorhaut in eine weitere 100 mm Kulturschale mit der Dermisseite nach unten.
HINWEIS: Schneiden Sie jedes erwachsene Vorhautgewebe in 3-4 mm breite Streifen mit einer Skalpellklinge, damit die Dispase effizienter funktioniert. - Fügen Sie 2,5 mg/ml Dispase zu jeder 100 mm Kulturschale mit erwachsenen Vorhautgewebe und inkubieren für 16 bis 20 h bei 4 °C.
HINWEIS: Jedes Gramm Gewebe wird mit 10 ml Dispase-Lösung verdaut.
- Spülen Sie jedes erwachsene Vorhautgewebe einmal mit 10 ml 75% Ethanol (Alkohol) für 30 s, und spülen Sie dann zweimal mit 10 ml Waschlösung (3% P/S), für jeweils 5 min.
- Trennung der Epidermis vom erwachsenen Vorhautgewebe
- Nach der Verdauung für 16 bis 20 h, trennen Sie die Epidermis von der Dermis mit einer Pinzette. Schnappen Sie sich eine Seite der dermalen Kante des Gewebes mit einer Pinzette und die entsprechende Position des epidermalen Teils mit einer anderen Pinzette und schälen Sie die Epidermis sanft ab.
- Die Epidermis 3x mit Waschlösung (3% P/S) waschen und dann in ein Rohr geben.
- Untertauchen Sie die Epidermis, indem Sie 5 ml 0,05% Trypsin in die Röhre geben und in einem Wasserbad 30 min bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Schütteln Sie das Rohr, um sicherzustellen, dass die Epidermis vor der Inkubation vollständig untergetaucht ist.
- Sammlung und Kultur von Primärzellen
- Fügen Sie ein gleiches Volumen der Terminlösung (10% FBS, 1% P/S in DMEM) hinzu, um das Trypsin und die Pipette 10-15 Mal nach oben und unten zu neutralisieren, um die epidermalen Zellen zu trennen.
- Übergeben Sie die Zellsuspension in ein neues 50 ml-Rohr durch einen 100-m-Netzfilter, um Schmutz zu entfernen.
- Zentrifuge bei 200 x g für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml Impf-TIVA-Medium hinzu, um die Zellen wieder auszusetzen.
- Säen Sie die resuspendierten Zellen in eine 100 mm Kulturschale.
- Kultur in einem 37° C Inkubator mit 5%CO2.
- Ändern Sie das Medium alle 2 Tage.
- Durchgangszellen, wenn sie 80% Zusammenfluss erreichen.
3. Die neue Methode
ANMERKUNG: Das Verfahren zur Gewebeaufbereitung und -verdauung in der neuen Methode ist das gleiche wie oben für die herkömmliche Methode beschrieben, wobei der einzige Unterschied darin besteht, dass die isolierten frischen Zellen in 10 ml TIVA-Medium resuspendiert werden, das 10 m Y-27632 enthält.
- Ersetzen Sie das Medium zwei Tage nach dem Aussaat durch ein normales TIVA-Medium ohne Y-27632. Danach sind die Kulturbedingungen zwischen den neuen und den konventionellen Methoden gleich.
4. Zellpassaging
- Entfernen Sie das TIVA-Medium und spülen Sie jedes Kulturgericht zweimal mit PBS.
- Fügen Sie 2 ml 0,05% Trypsin pro 100 mm Zellkulturschale hinzu.
HINWEIS: Schütteln Sie die Schale, um einen ausreichenden Kontakt zwischen Verdauungsenzymen und dem Boden der Schale zu gewährleisten. - In einem 37 °C-Inkubator für 2 min verdauen.
- Verwenden Sie ein Mikroskop, um die Zellen zu überprüfen, und stellen Sie sicher, dass sich die meisten Zellen von der Zellkulturschale getrennt haben.
HINWEIS: Tippen Sie vorsichtig auf die Schale, um die Zellen freizugeben, um sich aufzurunden und in der Lösung zu schweben. Verlängern Sie die Verdauungszeit, wenn die meisten Zellen nach dem Tippen nicht aussetzen, aber nicht mehr als 5 min. - Übertragen Sie die Melanozyten in ein 15 ml Rohr nach der Neutralisierung der Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 2 ml Terminlösung. Zentrifuge bei 200 x g für 5 min.
- Setzen Sie jedes Zellpellet mit 10 ml TIVA Medium nach dem langsamen Entfernen des Überstandes aus, und zählen Sie dann die Anzahl der Melanozyten.
- Platte ca. 1 x 106 Melanozyten in 10 ml TIVA medium pro 100 mm Zellkulturschale.
- Erneuern Sie das Zellkulturmedium alle 48 h.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt ein schematisches Diagramm, in dem die herkömmlichen und die neuen Methoden verglichen werden. Das Verfahren zur Gewebeaufbereitung und -verdauung mit der neuen Methode ist das gleiche wie das Verfahren für die herkömmliche Methode, wobei der einzige Unterschied darin besteht, dass die isolierten Zellen in 10 ml TIVA-Medium in Gegenwart von 10 M Y-27632 resuspendiert werden. Ersetzen Sie das Medium zwei Tage nach dem Aussaat durch ein normales TIVA-Medium ohne Y-27632. Die herkömmliche Methode der Isolierung von primären Melanozyten aus Hautgewebe erfordert in der Regel etwa 3 bis 4 Wochen für Melanozyten in ausreichender Anzahl zu durchgehen wachsen, aber noch wichtiger ist, das Gewebe in der Regel von Neugeborenen kommen und es ist sehr schwierig, primäre Melanozyten aus erwachsenen Hautgewebe zu isolieren. Jedoch, mit der neuen Methode, Melanozyten aus erwachsenen Geweben werden in deutlich größeren Zahlen als Melanozyten isoliert mit der herkömmlichen Methode beobachtet. Mikroskopische Ansichten wurden an den Tagen 3, 6 und 8 bei der Isolierung der Melanozyten aus erwachsenen Hautgewebe mit der herkömmlichen Methode und der neuen Methode(Abbildung 2A) aufgenommen. In diesen mikroskopischen Ansichten erhöhte die neue Methode die Ausbeute von Melanozyten an den Tagen 6 und 8 signifikant. Melanozytenzahlen wurden dann quantifiziert, indem mindestens 10 verschiedene mikroskopische Felder an den Tagen 3, 6 und 8 gezählt wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anzahl der mit der neuen Methode isolierten Melanozyten viel höher ist als die Anzahl der Melanozyten, die nach der herkömmlichen Methode an den Tagen 6 und 8 isoliert wurden (Abbildung 2B). Nach 8 Tagen Kultur wurden die Melanozyten mit Trypsin geerntet und dann mit einem automatisierten Zellzähler in jeder einzelnen 100-mm-Schale gezählt, was zeigte, dass die neue Methode den Melanozytenertrag um etwa das Fünffache erhöhte(Abbildung 2C). Mikroskopische Ansichten, die an Tag 9, einen Tag nach der Passierung, aufgenommen wurden, zeigten, dass sich die durchgehenden Melanozyten normal vermehrten (Abbildung 2D), was durch Ki67-Färbung bestätigt wurde (Abbildung 2E).
Die erhöhte Ausbeute von Melanozyten durch Y-27632 während der Anfangskultur nach Isolation wurde durch die Regulierung von Keratinozyten in einer früheren Publikation16gezeigt. Wie in Abbildung 3dargestellt, hat Y-27632 das Wachstum und die Verbreitung von durchdrungenen Melanozyten nicht erhöht ( Abbildung3A-B) und die Apoptose von Melanozyten nicht hemmte (Abbildung 3C-D). Y-27632 erhöhte jedoch signifikant die Keratinozyten-Anhaftung (Abbildung 3E-H) und förderte auch seine Überlebensfähigkeit ( Abbildung3I) in den Melanozyten-Kultur TIVA-Medien. Entweder die Kokultur mit Keratinozyten in Gegenwart von Y-27632 oder das konditionierte Medium, das von Y-27632 behandelten Keratinozyten abgeleitet wurde, könnten das Wachstum von Melanozyten signifikant verbessern (Abbildung 3J).
Um die mit der neuen Methode isolierten Melanozyten weiter zu charakterisieren, wurde MITF, ein spezifischer Melanozytenmarker, mittels Immunfluoreszenz (IF)-Färbung analysiert, um die Reinheit von Melanozyten nach anfänglicher Passierung zu überprüfen. Abbildung 4A zeigt, dass der Prozentsatz der Zellen, die MITF in Durchgang 1 exzessizieren, fast 100% betrug, was darauf hindeutet, dass nach der ersten Passage durch die neue Methode reine Melanozyten erhalten wurden, die der herkömmlichen Methode ähneln. Um zu testen, ob mit der neuen Methode isolierte Melanozyten normal funktionieren können, wurden sie 2 Tage lang in vitro mit Forskolin (FSK) behandelt, was die Pigmentierung von Melanozyten induzierte (Abbildung 4B). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die mit der neuen Methode isolierten Melanozyten normal funktionieren und Pigmente produzieren können.
Abbildung 1: Vergleich der neuen Methode mit der herkömmlichen Methode. Dieses Schema zeigt einen Vergleich der konventionellen Methode mit der neuen Isolationsmethode. Der einzige Unterschied besteht darin, dass die isolierten frischen Zellen in 10 ml TIVA-Medium in Gegenwart von 10 m Y-27632 resuspendiert werden. Zwei Tage nach der Aussaat wird das Medium ohne Y-27632 durch ein normales TIVA-Medium ersetzt. Die neue Methode erreicht in der Regel eine Dichte von Melanozyten geeignet für die Passierung um Tag 8, während die konventionelle Methode in der Regel dauert etwa 20 Tage, um ausreichende Anzahl von Melanozyten für die Passierung wachsen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die neue Isolationsmethode erhöht die Produktion von primären Melanozyten. (A) Repräsentative Bilder von Melanozyten, die nach der herkömmlichen Methode (obere Reihe) und nach der neuen Methode (untere Reihe) an den Tagen 3, 6 und 8 nach der ersten Impfung hergestellt wurden. (B) Quantifizierung von Melanozytenzahlen, die nach der herkömmlichen Methode und der neuen Methode hergestellt wurden, indem Melanozytenzahlen in mindestens 10 verschiedenen mikroskopischen Feldern (Zellzahl/Vision) an den Tagen 3, 6 und 8 gezählt werden. Alle Experimente wurden in Dreifacharbeit durchgeführt und die Ergebnisse werden als die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro mikroskopischem Feld ausgedrückt. (C) Nach der Kultur für 8 Tage wurden Melanozyten mit Trypsin geerntet und die Anzahl der Melanozyten, die nach der herkömmlichen Methode und der neuen Methode hergestellt wurden, wurden mit einer Zellzählplatte gezählt. Die Anzahl der Zellen wurde aus dreifachen Experimenten berechnet, und die Ergebnisse zeigen die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro 100 mm Schale. (D) Nach Zählung der Anzahl der Melanozyten mit einem automatisierten Zellzähler wurden Melanozyten, die nach der herkömmlichen Methode oder der neuen Methode hergestellt wurden, in neue Gerichte gesetzt und mikroskopische Fotos wurden an Tag 9 aufgenommen. (E) Melanozyten, die nach der neuen Methode in Durchgang 0 oder in Durchgang 1 isoliert wurden, wurden fixiert und mit Ki67-Antikörpern (rot) und DAPI (Kerne, blau) befleckt. (B-C), Student es t-test wurde verwendet, um Unterschiede zwischen der neuen und der konventionellen Methode zu analysieren, ** P < 0.01, ***P < 0.005. Alle Maßstabsleisten repräsentieren 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Y-27632 verbessert das Melanozytenwachstum durch Regulierung von Keratinozyten. (A) Reine Melanozyten (Durchgang 3) wurden mit 10 M Y-27632 für 12, 24, 48 und 60 h behandelt und die Anzahl der Melanozyten wurde mit CCK-8-Assay analysiert. (B) Reine Melanozyten (Durchgang 3) wurden 48h lang mit 10 m Y-27632 behandelt und dann für ki67-Färbung fixiert. Quantifizierung des Prozentsatzes der Ki67-positiven Zellen unter den gesamten lebenden Zellen, die mit DAPI-Kernfärbung angezeigt werden. (C-D) Reine Melanozyten (Durchgang 3) wurden mit 10 'M Y-27632 für 48 h behandelt und dann entweder für apoptotische Zellen mit Annexin V-FITC und Propidiumiodid, gefolgt von FACS-Analyse (C) oder fixiert für TUNEL-Assay. (E) Isolierte Epidermis nach Trypsin-Verdauung wurde mit TIVA-Medium mit oder ohne Y-27632 (10 M) und 2 Tage später Immunfluoreszenzanalyse von Keratinozyten mit einem Pan-Cytokeratin-Antikörper (pan-ck) plattiert. (F) Quantifizierung von Keratinozyten in den Y-27632-behandelten und Kontrollgeschirr aus (E) als Prozentsatz der Keratinozyten in insgesamt 500 gezählten Zellen. (G) Reine Passage 3 Keratinozyten wurden im TIVA-Medium mit oder ohne Y-27632 (10 m) gesät. Bilder von epidermalen Zellen werden an einem Tag nach der Aussaat gezeigt. (H) Quantifizierung der angebauten Keratinozyten in den Y-27632-behandelten und Kontrollschalen aus (G) als Prozentsatz der angeschlossenen Zellen in insgesamt 5000 ausgesäten Zellen. (I) Reine Passage 3 Keratinozyten wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von Y-27632 mit TIVA-Medium überzogen. Die mikroskopischen Bilder wurden bei 24 h erhalten. (J) Linkes Panel: Gleich viele reine Durchgang3-Melanozyten wurden mit TIVA-Medium in 4 Gruppen mit Addition(en) wie angegeben: 1) Y-27632 (10 m) allein (Y in Graph), 2) Durchgang 3 Keratinozyten allein, 3) Keratinozyten und Y-27632 (10 m) (K+Y) und 4) keine Zugabe (Kontrolle, Con). Relative Faltenveränderungen in der Melanozytenproliferation im Vergleich zur Negativkontrolle wurden durch Zählen der Anzahl der Melanozyten bei 24 h und 48 h nach der Beschichtung bestimmt. Rechtes Panel: Konditionierte TIVA-Medien wurden aus den 4 Gruppen von Passage 3 Melanozytenkulturen in (linkem Panel) bei 48 h nach der Beschichtung erhalten. Dann wurden gleiche Anzahl von Durchgang 3 Melanozyten in 4 Gruppen plattiert, jede mit einem der konditionierten Medien. Relative Faltenveränderungen in der Melanozytenproliferation im Vergleich zur Negativkontrolle wurden durch Zählen der Anzahl der Melanozyten bei 24 h und 48 h nach der Beschichtung bestimmt. (A-J) Alle Experimente wurden 3 Mal wiederholt, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005. Alle Balken in den Bildern stellen 100 m dar. Die Figur wurde von Mi et al.16geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Charakterisierung von Melanozyten isoliert mit der neuen Methode. (A) Repräsentative Bilder der Immunfluoreszenzfärbung von MITF (rot) in Melanozyten, die nach der neuen oder konventionellen Methode hergestellt werden. DAPI färbt Kerne (blau). (B) Zellpellets wurden aus Melanozyten gesammelt, die nach dem neuen Verfahren hergestellt wurden, und wurden 2 Tage lang mit Forskolin (FSK) oder DMSO-Fahrzeug als Kontrollfahrzeug (con) behandelt. Alle Maßstabsleisten repräsentieren 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll basiert auf einer kürzlichveröffentlichten 16. Den folgenden kritischen Schritten sollte einige Aufmerksamkeit geschenkt werden, um mit der neuen Methode die besten Ergebnisse zu erzielen. Erstens ist eine erfolgreiche Trennung der Epidermis und der Dermis entscheidend. Schneiden Sie das erwachsene Vorhautgewebe mit einer Skalpellklinge in 3-4 mm breite Streifen, damit die Dispase gründlicher und einfacher wirken, um die Epidermis von der Dermis zu trennen. Zweitens sollte bei der Trennung dieser beiden Schichten eine Kontamination der Dermis vermieden werden, da dermale Fibroblasten auch im Melanozytenkulturmedium wachsen können. Drittens sollte der Trypsin-Verdauungsschritt weniger als 30 min betragen; andernfalls wird die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen erheblich verringert.
Diese neue Methode verkürzt die Zeit, die für die Melanozytenisolation benötigt wird, erheblich. Menschliche epidermale Melanozyten produzieren Melanin, das die Haut vor Sonneneinstrahlungsschäden schützt. Eisinger und Marko schlugen die erste praktische Methode für die Kultur der menschlichen Melanozyten aus der Epidermis5vor. Am wichtigsten ist, dass die verwendeten Gewebe in der Regel von Neugeborenen stammen und es ist sehr schwierig, primäre Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben zu isolieren. Der Rho-assoziierte Proteinkinase-Inhibitor Y-27632 verbessert die Effizienz der epidermalen Stammzellisolierung11-13signifikant. Zusätzlich berichteten wir auch über eine Methode zur Isolierung menschlicher primärer epidermaler Zellen aus Hautgeweben in Gegenwart von Y-2763210,11. In diesem Protokoll, Y-27632 wurde gezeigt, dass effizient die Ausbeute von primären Melanozyten zu erhöhen. Mit der konventionellen Methode hat eine niedrige Zellrückgewinnungsrate und benötigt etwa 3 bis 4 Wochen Kultur für Melanozyten in ausreichender Anzahl zu wachsen. Diese neue Methode, bei der Y-27632 dem TIVA-Wachstumsmedium zugesetzt wird, erhöhte die Melanozytenausbeute um etwa das Fünffache, und die erhaltenen Melanozyten können sich normal vermehren. Wir haben die neue Methode auch mit einem kommerziellen Medium getestet und ähnliche Ergebnisse gefunden. In Bezug auf den mechanismus beteiligt, eine aktuelle Studie zeigte, dass die Wirkung von Y-27632 zur Verbesserung der Effizienz der Melanozytenisolation vor allem durch Keratinozyten16auftritt.
Wichtig ist, dass wir reine Melanozyten mit normaler Funktion mit der neuen Methode erhalten haben. Die Passage 1 (P1) Melanozyten wurden fast alle für DEN MITF-Ausdruck gefärbt, was darauf hindeutet, dass nach dem ersten Durchgang reine Melanozyten erhalten werden. Primäre Melanozyten mit hohem Wachstumspotenzial sind für die biologische Forschung und klinische Anwendungen sehr wichtig. Die mit der neuen Methode isolierten Melanozyten können nach der Behandlung mit Forskolin, einem Aktivator der Adenylatcyclase, der den zyklischen AMP-Spiegel erhöht, zum Pigment induziert werden, was darauf hindeutet, dass diese Melanozyten normal funktionieren können, was für die Untersuchung von Pigmentierungsdefekten und Melanom14nützlich sein wird.
Zusammenfassend wurde erfolgreich eine hocheffiziente Methode eingeführt, um primäre Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben zu isolieren. Diese verbesserte Methode könnte dazu beitragen, eine ausreichende Anzahl von Melanozyten in schneller Weise für die biologische Forschung und für klinische Anwendungen bereitzustellen.
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Disclosures
Alle Autoren erklären kein Konfliktinteresse.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), the Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD3 6) und das Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramm der Provinz Shandong (2019GSF108107) an die X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) und die Fundamental Research Funds der Shandong University (2019GN043) an J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
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