Summary
נייר זה מדווח כי התוספת של Y-27632 כדי בינונית הגוף יכול להגדיל באופן משמעותי את התשואה של מלנוציטים מרקמות העור למבוגרים.
Abstract
הבידוד והתרבות של מלנוציטים הראשי מרקמות העור הוא מאוד חשוב עבור מחקר ביולוגי השתמשו באופן נרחב עבור יישומים קליניים. בידוד מלנוציטים הראשי מרקמות העור על ידי השיטה המקובלת בדרך כלל לוקח כ 3 עד 4 שבועות למעבר מספיק. חשוב יותר, הרקמות המשמשות בדרך כלל היילוד עורלות וזה עדיין אתגר כדי לבודד ביעילות מלנוציטים הראשי מרקמות למבוגרים. פיתחנו לאחרונה שיטת בידוד חדשה עבור מלנוציטים המוסיפה Y-27632, מעכבי Rho קינאז, למדיום התרבות הראשונית עבור 48 h. לעומת הפרוטוקול המקובל, זו שיטה חדשה מגדילה באופן דרמטי את התשואה של מלנוציטים ומקצרת את הזמן הנדרש כדי לבודד מלנוציטים מרקמות העורלה. עכשיו אנחנו מתארים את השיטה החדשה הזאת בפירוט רב יותר באמצעות אפידרמיס למבוגרים לתרבות ביעילות מלנוציטים הראשי. חשוב מכך, אנו מראים כי מלנוציטים שהתקבלו מרקמות למבוגרים שהוכנו על ידי שיטה חדשה זו יכולה לתפקד כרגיל. פרוטוקול חדש זה יועיל באופן משמעותי למחקרים של פגמים פיגמנטציה ומלנומה באמצעות מלנוציטים הראשי מוכן בקלות לגשת רקמות עור למבוגרים.
Introduction
המטרה של מחקר זה היה לפתח פרוטוקול פשוט ואפקטיבי כדי לבודד מלנוציטים מן האפידרמיס של העור המבוגר למחקר ביולוגי ויישומים קליניים. מלנוציטים, אשר ממוקמים באפידרמיס הבזליים של העור ובזקיקי השיער, לשחק תפקיד חשוב בפיגמנטציה של העור והשיער על ידי הפקת מלנין1. העור שנוצר פיגמנטציה מתוך מלנומה באפידרמיס מעשים כמו מסנן קרינה אולטרה סגולה המפחית/מונע נזק DNA לתאים הבסיסיים בעור2. התפשטות חריגה של מלנוציטים בעור הוא די נפוץ, כמו בהיווצרות nevi שפיר (שומות) שבו מלנוציטים בפוטנציאל להפוך לצמיחה אונגניים ואחריו הזדקנות הסלולר3.
מאז 1957, הבידוד והתרבות הבאה של מלנוציטים הראשי האנושי היה אפשרי4, אבל רק מאז 1982 יש כבר שיטה יעילה שיכולה ליצור תרבויות של מלנוציטים אנושייםמתוךהאפידרמיס 5. השיטה המקובלת לבודד מלנוציטים הראשי מתוך האפידרמיס כרוכה בעיכול שני שלבים אנזימטיות. בקצרה, העור מתעכל בתחילה עם בעיות כדי להפריד את האפידרמיס מן dermis, לאחר שאפידרמיס מתעכל עם טריפסין לייצר השעיות המכילות מלנוציטים ו keratinocytes, אשר יכול להיות באופן סלקטיבי גדל במדיה שונים. כיום, התרבות הראשונית אורכת בדרך כלל 3 עד 4 שבועות עבור מלנוציטים כדי להגיע לשטף באמצעות השיטה המקובלת, אשר צפוי בשל היעילות הנמוכה של הבידוד שלהם. לכן, הגדלת הייצור הראשוני של מלנוציטים מרקמות העור למבוגרים יהיה מועיל למדי עבור שני מחקר מעבדה ויישומים קליניים.
גורמי גדילה רבים, שרובם הוכחו להיות מופרש על ידי keratinocytes (למשל, α-msh, acth, bfgf, ngf, ET-1, GM-שדרתי, hgf, אבל scf)5-8, להסדיר את הבידול והתפשטות של מלנוציטים היונקים. בהיעדר שכבות ממזין, חוסר גורמי גדילה אלה מוביל את התפשטות ירידה של מלנוציטים ואפופטוזיס מוגברת שלהם9. שיתוף התרבות של keratinocytes כמו תאים מאכיל ומלנוציטים עלול להוביל להאצת מלנוציט התפשטות ואפופטוזיס מופחת. עם זאת, שיטת שיתוף התרבות לא רק דורש רקמות העור יותר כדי להכין keratinocytes, אשר אינו מעשי, אבל גם לא יכול לעבוד ביעילות כי תנאי התרבות הנדרשים על ידי מלנוציטים אינו מעדיף צמיחה keratinocytes, ולהיפך.
מחקרים קודמים דיווחו כי תוספת של Y-27632, מעכב סלע, לתוך המדיום צמיחה יכול לשפר את התשואה של התאים האנושיים באפידרמיס העיקרי מרקמות העור10-14. לכן, זה יהיה מעניין לבדוק אם הבידוד של המלנוציטים הראשי האנושי יועיל מנוכחותם של Y-27632. אכן, תוספת של Y-27632 לתוך בינונית החיסון15, אשר מכיל הסברתי, Ibmx, Na3VO4 ו dbcamp, הגדילה באופן משמעותי את התשואה של מלנוציטים הראשי מבודד רקמות העורלה בתרבויות הראשוניות16. בהשוואה לפרוטוקול המקובל, פרוטוקול חדש זה הוא יעיל יותר באופן משמעותי בהגדלת התשואה של מלנוציטים16. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר את השיטה החדשה בפירוט באמצעות רקמות עור למבוגרים המבוססות על מחקר קודם16 על מנת לקדם את יישומו במחקר ביולוגי בסיסי ומיושם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השימוש ברקמות העורלה הבוגרת בפרוטוקול זה אושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי (No 2015120401, תאריך: 12 במאי 2015).
הערה: בצע את כל ההליכים הבאים בסביבה סטרילית כדי למנוע זהום של תאים ותרבויות.
1. ההכנות
- לאסוף רקמות מבוגרים טריים העורלה מתוך ניתוחים מילה ב 15 צינורות mL המכיל 10 מ ל של מלח מאגר פוספט (PBS) ולאחסן 4 ° c.
הערה: הפרד בין הרקמות כמפורט להלן בתוך 24 שעות לאחר כריתה. - הכינו ריאגנטים ומדיום לתרבות.
- הכינו 3% P/S (פניצילין/סטרפטומיצין) כפתרון כביסה. לערבב 50 mL של PBS עם 1.5 מ ל של פניצילין (100 U/mL) ו סטרפטומיצין (100 mg/L) (P/S).
- הכן את פתרון הסיום (פתרון ניטרול) לנטרול העיכול האנזימטי. תוספת 1% P/S, 10% סרום של שור עוברי (FBS) לתוך מדיום Dמאמ.
- הכנת בינונית-מית לתרבות מלנוציטים: האם F12; 10% FBS; 1x P ⁄ S ⁄ גלוטמין; 50 ng/mL 12-O-טטרדאנואיל פורבול-13-אצטט (הסברתי); 1 x 10-4 M 3-איזובוטיל-1-מתיל קסנלך (ibmx); 1 μM Na3VO4; 1 x 10-3 M N-6, 2 ′-O-dibutyryladenosine-3 ′, 5 ′ מחזורית Monophosphate (dbcamp).
2. השיטה המקובלת
- טיפול מקדים ברקמת עור
- לשטוף כל רקמת עורלה למבוגרים פעם עם 10 מ ל של 75% אתנול (אלכוהול) עבור 30 s, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 10 מ ל של פתרון כביסה (3% P/S), עבור 5 דקות כל אחד.
הערה: לשטוף את רקמות העורלה עם 10 מ ל של PBS בהתחלה אם יש הרבה דם. כל שוטף מוכנים בשנת 100 מ"מ מנות תרבות התא. - מגרדים כל רקמת עורלה עם להב כירורגי כדי להסיר רקמות השומן התת עורית ורקמות חיבור רופף בשער של 100 מ"מ צלחת תרבות התא.
הערה: השתמשו באזמל כדי לגרד את שכבות השומן משם עד שרק האפידרמיס הדק והדאמיס הצפופים יישארו. - להעביר כל עורלה למבוגרים לתוך מאכל אחר 100 mm התרבות עם הקצה למטה.
הערה: חותכים כל רקמת עורלה מבוגרת לתוך 3-4 מילימטר רחב רצועות באמצעות להב אזמל כדי להפוך את dispase לעבוד ביעילות רבה יותר. - הוסף 2.5 mg/mL dispase כדי כל מאכל 100 mm התרבות עם רקמות עורלה למבוגרים ו דגירה עבור 16 עד 20 h ב 4 ° c.
הערה: כל גרם של רקמה מתעכל עם 10 מ ל של פתרון dispase.
- לשטוף כל רקמת עורלה למבוגרים פעם עם 10 מ ל של 75% אתנול (אלכוהול) עבור 30 s, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 10 מ ל של פתרון כביסה (3% P/S), עבור 5 דקות כל אחד.
- הפרדת האפידרמיס מרקמת העורלה הבוגרת
- לאחר העיכול עבור 16 כדי 20 h, להפריד את האפידרמיס מן דרמיס באמצעות מלקחיים. תפוס צד אחד של הקצה העורי של הרקמה עם פינצטה אחד ואת המיקום המקביל של החלק באפידרמיס עם פינצטה אחר ולקלף בעדינות את האפידרמיס.
- לשטוף את האפידרמיס 3x עם פתרון כביסה (3% P/S), ולאחר מכן להעביר את האפידרמיס לתוך צינור.
- לטבול את האפידרמיס על ידי הוספת 5 מ ל של 0.05% טריפסין לתוך הצינור ומכבית באמבט מים 30 דקות ב 37 ° c.
הערה: לנער את הצינור כדי להבטיח את האפידרמיס הוא שקוע לחלוטין לפני הדגירה.
- איסוף ותרבות של תאים ראשוניים
- הוסף נפח שווה של פתרון הפסקת (10% FBS, 1% P/S ב-DMEM) כדי לנטרל את טריפסין ופיפטה את הפתרון למעלה ולמטה 10-15 פעמים כדי להפריד את התאים באפידרמיס.
- להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור חדש 50 mL באמצעות מסנן שינוי 100 יקרומטר להסיר פסולת.
- צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות.
- הסר את הסופרנטאנט והוסף 10 mL של אמצעי החיסון כדי להשעות מחדש את התאים.
- הזרע את התאים מחדש לתוך צלחת התרבות 100 מ"מ.
- תרבות בחממה 37 ° C עם 5% CO2.
- . להחליף את המדיום כל יומיים
- מעבר תאים כאשר הם מגיעים 80% המפגש.
3. השיטה החדשה
הערה: ההליך להכנת רקמות ועיכול בשיטה החדשה זהה כמתואר לעיל עבור השיטה המקובלת, ההבדל היחיד להיות כי תאים טריים מבודדים מושעה ב 10 מ ל של מדיום ממוצע המכיל 10 μM Y-27632.
- יומיים לאחר זריעת, להחליף את המדיה עם בינוני המצב נורמלי ללא Y-27632. לאחר מכן, תנאי התרבות זהים בין השיטה החדשה לבין השיטות המקובלות.
4. הפסד תא
- הסר את המדיום של החטיבה ושטוף כל מנה תרבותית פעמיים עם PBS.
- הוסף 2 מ ל של 0.05% טריפסין לצלחת תרבות התא 100 מ"מ.
הערה: לנער את הצלחת כדי להבטיח קשר הולם בין אנזימי העיכול והחלק התחתון של המנה. - לעכל בחממה 37 ° c עבור 2 דקות.
- השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק את התאים, וודא כי רוב התאים התעברו מתוך הצלחת תרבות התא.
הערה: הקש בעדינות על הצלחת כדי לשחרר את התאים כדי לעגל ולצוף בפתרון. הארך את זמן העיכול אם רוב התאים לא הושהה לאחר הקשה, אך לא יותר מ -5 דקות נוספות. - העבירו את המלנוציטים לצינור של 15 מ ל לאחר נטרול פעילות טריפסין באמצעות הוספת 2 מ ל של פתרון סיום. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות.
- השהה מחדש כל גלולה תא עם 10 מ ל של מדיום של החטיבה לאחר לאט הסרת supernatant, ולאחר מכן לספור את מספר מלנוציטים.
- צלחת על 1 x 106 מלנוציטים ב 10 מ ל של מדיום בינונית לכל 100 מ"מ צלחת תרבות התא.
- חדש את המדיום תרבות התא כל 48 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג דיאגרמה סכמטית המשווה את השיטות הקונבנציונליות והחדשות. ההליך להכנת רקמות ועיכול עם השיטה החדשה הוא זהה ההליך עבור השיטה המקובלת, ההבדל היחיד להיות כי התאים המבודדים מושעה מחדש 10 מ ל של מדיום של החטיבה בנוכחות של 10 μM Y-27632. יומיים לאחר זריעת, להחליף את המדיה עם בינוני המצב נורמלי ללא Y-27632. השיטה המקובלת של בידוד מלנוציטים הראשי מרקמות העור בדרך כלל דורש כ 3 כדי 4 שבועות עבור מלנוציטים לגדול במספרים מספיקים למעבר, אבל חשוב יותר, הרקמות בדרך כלל באים מתינוקות היילוד וזה קשה מאוד לבודד מלנוציטים הראשי מרקמות העור למבוגרים. עם זאת, שימוש בשיטה החדשה, מלנוציטים מרקמות למבוגרים נצפו במספרים יותר משמעותית מאשר מלנוציטים מבודדים באמצעות השיטה המקובלת. צפיות מיקרוסקופיים נלקחו בימים 3, 6 ו 8 כאשר בידוד המלנוציטים מרקמת העור למבוגרים באמצעות השיטה המקובלת ואת השיטה החדשה (איור 2A). בתצוגות מיקרוסקופיים אלה, השיטה החדשה הגדילה באופן משמעותי את תפוקת המלנוציטים בימים 6 ו-8. מספרים של מלנוציט לאחר מכן בכמת על ידי ספירת לפחות 10 שדות מיקרוסקופיים שונים בימים 3, 6 ו-8. התוצאות הראו כי מספר המלנוציטים מבודדים בשיטה החדשה הוא גבוה בהרבה ממספר הבודדים של מלנוציטים בשיטה המקובלת בימים 6 ו-8 (איור 2B). לאחר שמונה ימים של תרבות, המלנוציטים נקצרו באמצעות טריפסין ולאחר מכן נספרו עם מונה תאים אוטומטי בכל מנה 100 מ"מ אחת, שגילתה שהשיטה החדשה הגדילה את התשואה המלנוציט בחמש פעמים (איור 2C). תצוגות מיקרוסקופיים שצולמו ביום 9, יום אחד לאחר מעבר, הראו כי מלנומה הפסציטים מתרבים בדרך כלל (איור 2D), אשר אושרה על ידי Ki67 צביעת (איור 2d).
התשואה המשופרת של מלנוציטים על ידי Y-27632 במהלך התרבות הראשונית לאחר בידוד הוצגה באמצעות התקנה של keratinocytes בפרסום הקודם16. כפי שמוצג באיור 3, Y-27632 לא הגדילו את הצמיחה וההתפשטות של מלנוציטים (איור 3א-ב) ולא לעכב את האפופטוזיס של מלנוציטים (איור 3C-D). עם זאת, Y-27632 הגדילה באופן משמעותי keratinocyte מצורף (איור 3E-H) וגם קידם שלה ששרדו (איור 3i) בתקשורת מלנומה-תרבות מלנוציט. עם שיתוף תרבות עם keratinocytes בנוכחות Y-27632 או בינוני ממוזג נגזר Y-27632 keratinocytes מטופלים יכול לשפר באופן משמעותי את הצמיחה של מלנוציטים (איור 3J).
כדי לאפיין עוד מבודד מלנוציטים באמצעות השיטה החדשה, MITF, סמן מלנוציט מסוים, נותחו באמצעות immunofluorescence כתמים (IF) לבדוק את טוהר המלנוציטים לאחר מעבר הראשונית. איור 4A מראה כי אחוז התאים המבטא mitf במעבר 1 היה כמעט 100%, המציין כי מלנוציטים טהור הושגו לאחר המעבר הראשון על ידי השיטה החדשה, הדומה לשיטה המקובלת. כדי לבדוק אם מלנוציטים מבודדים בשיטה החדשה יכול לתפקד כרגיל, הם טופלו forskolin (FSK) עבור 2 ימים בתוך מבחנה, אשר המושרה את רמות פיגמנטציה של מלנוציטים (איור 4B). יחד, נתונים אלה מראים כי המלנוציטים מבודדים באמצעות השיטה החדשה יכולה לתפקד כרגיל יכול לייצר פיגמנט.
איור 1: השוואת השיטה החדשה והשיטה המקובלת. ערכה זו מציגה השוואה בין השיטה המקובלת לשיטת הבידוד החדשה. ההבדל היחיד הוא כי תאים טריים מבודדים מושעה מחדש 10 מ ל של מדיום של החטיבה בנוכחות של 10 μM Y-27632. יומיים לאחר הזריעה, המדיום מוחלף בינונית-מית נורמלית ללא Y-27632. השיטה החדשה משיגה בדרך כלל צפיפות של מלנוציטים מתאים לפאסאייג ' בסביבות יום 8, בעוד השיטה המקובלת לוקח בדרך כלל 20 ימים כדי לגדול מספר מספיק של מלנוציטים לקראת הזדקנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שיטת הבידוד החדשה מגבירה את ייצור המלנוציטים הראשיים. (א) דמויות מייצגות של מלנוציטים שהוכנו על ידי השיטה המקובלת (השורה העליונה) ועל ידי השיטה החדשה (השורה התחתונה) בימים 3, 6 ו 8 אחרי החיסון הראשוני. (ב) כימות של מספרים מלנוציט שהוכנו באמצעות השיטה המקובלת והשיטה החדשה על ידי ספירת מספרים מלנוציט בלפחות 10 שדות מיקרוסקופיים שונים (מספר תא/חזון) בימים 3, 6 ו-8. כל הניסויים בוצעו בטרילקאט ותוצאות מבוטא כמספר הממוצע של תאים לכל תחום מיקרוסקופי. (ג) לאחר התרבות במשך 8 ימים, נקצרו מלנוציטים באמצעות טריפסין ומספר מלנוציטים שהוכנו בשיטה המקובלת והשיטה החדשה נספרו באמצעות צלחת ספירת תאים. מספר התאים שחושבו מניסויי מטריפליאט, והתוצאות מציגות את המספר הממוצע של תאים לכל 100 מ"מ. (ד) לאחר ספירת מספר המלנוציטים באמצעות מונה תאים אוטומטי, מלנוציטים שהוכנו בשיטה המקובלת או השיטה החדשה הופרה במנות חדשות ותמונות מיקרוסקופיים צולמו ביום 9. (ה) מלנוציטים מבודדים בשיטה החדשה במעבר 0 או במעבר 1 היו קבועים ומוכתמים בנוגדן Ki67 (אדום) ו-dapi (גרעינים, כחול). (ב-C), מבחן tשל סטודנט שימש לניתוח הבדלים בין החדש לבין השיטה המקובלת, * * P ≪ 0.01, * * *p < 0.005. כל פסי הסרגל מייצגים 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: Y-27632 משפר את הצמיחה מלנוציט באמצעות רגולציה של keratinocytes. (א) טהור מלנוציטים (מעבר3) טופלו 10 Μm Y-27632 עבור 12, 24, 48, ו 60 h ואת מספר מלנוציטים נותחו על ידי שיטת cck-8. (ב) טהור מלנוציטים (מעבר 3) טופלו 10 Μm Y-27632 עבור 48h ולאחר מכן תוקנו עבור Ki67 כתמים. כימות האחוז של תאים חיוביים Ki67 בקרב תאים חיים כולל שצוין עם כתמים גרעיניים DAPI. (C-D) טהור מלנוציטים (מעבר 3) טופלו 10 μM Y-27632 עבור 48 h ולאחר מכן היו מוכתמים עבור תאים האפוטוטיים עם הגרסה המאפיקסין V-FITC ו propidium יודיד ואחריו ניתוח FACS (C) או קבוע עבור שיטת tunel. (ה) אפידרמיס מבודדים אחרי טריפסין העיכול היה מצופה עם בינונית-מדיום עם או בלי Y-27632 (10 μm) ו-2 ימים מאוחר יותר ניתוח של מחלת מחלת keratinocytes בוצע עם נוגדן פאן ציטוקרטין (פאן-ck). (ו) קוונפיקציה של keratinocytes ב-Y-27632 מנות שטופלו ובקרה מ (E) כאחוז של keratinocytes ב סך של 500 תאים שנספרו. (ז) מעבר טהור 3 keratinocytes הופרה במדיום החטיבה עם או בלי Y-27632 (10 μm). תמונות של תאים באפידרמיס מוצגים יום אחד לאחר זריעה. (ח) כימות של keratinocytes מצורף ב-Y-27632 מטופלים ומנות בקרה מ (G) כמו אחוז התאים המצורפים בסך הכל של 5000 תאים שנזרע. (I) מעבר טהור 3 keratinocytes היו מצופים במדיום מדיום בנוכחות או היעדרות של Y-27632. התמונות המיקרוסקופית הושגו ב -24 בבוקר (J) הפאנל השמאלי: מספרים שווים של מעבר טהור 3 מלנוציטים היו מצופים במדיום מדיום ב 4 קבוצות עם הוספה (ים) כפי שצוין: 1) Y-27632 (10 μm) לבד (Y בגרף), 2) מעבר 3 keratinocytes בלבד, 3) keratinocytes ו-Y-27632 (10 μm) (K + Y), ו-4) אין תוספת (שלילי שליטה, con). שינויים בקיפול יחסי בהתפשטות מלנוציט בהשוואה לשליטה השלילית נקבעו על ידי ספירת מספר מלנוציטים ב 24 h ו 48 h לאחר ציפוי. הפאנל הימני: מדיה ממוזגת של החטיבה הושגה מ 4 קבוצות של מעבר 3 תרבויות מלנוציט (פאנל שמאל) ב 48 h לאחר ציפוי. אז, מספר שווה של מעבר 3 מלנוציטים היו מצופים 4 קבוצות, כל אחד עם אחד המדיה הממוזגת. שינויים בקיפול יחסי בהתפשטות מלנוציט בהשוואה לשליטה השלילית נקבעו על ידי ספירת מספר מלנוציטים ב 24 h ו 48 h לאחר ציפוי. (א-י) כל הניסויים חזרו על עצמם 3 פעמים, *p< 0.05, * *p< 0.01, * * *p< 0.005. כל הברים בתמונות מייצגים 100 μm. הדמות השתנתה ממי ואח '16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אפיון של מלנוציטים מבודדים בשיטה החדשה. (א) דמויות מייצגות של כתמים immunofluorescence של mitf (אדום) במלנוציטים שהוכנו באמצעות השיטה החדשה או המקובלת. כתמי גרעיני DAPI (כחול). (ב) כדורי תא נאספו מ מלנוציטים שהוכנו באמצעות השיטה החדשה וטופלו עבור 2 ימים עם forskolin (fsk) או הרכב dmso כפקד (con). כל פסי הסרגל מייצגים 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן התבסס על פרסום16שנערך לאחרונה. יש לשלם תשומת לב מסוימת לשלבים הקריטיים הבאים כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר בשיטה החדשה. ראשית, הפרדה מוצלחת של האפידרמיס והדרמיס היא חיונית. חותכים את הרקמות העורלה למבוגרים לתוך 3-4 mm רצועות רחב באמצעות להב אזמל כדי להפוך את העבודה dispase יותר ביסודיות ובקלות כדי להפריד את האפידרמיס מן dermis. שנית, כאשר הפרדת שתי שכבות אלה, זיהום של דרמיס יש להימנע מאז העור פיברותקיעות יכול גם לצמוח במדיום התרבות מלנוציט. שלישית, הטריפסין משלב העיכול צריך להיות פחות מ -30 דקות; אחרת, היא תפחית באופן משמעותי את הכדאיות של התאים המבודדים.
שיטה חדשה זו מקצרת באופן משמעותי את הזמן הדרוש לבידוד מלנוציט. האדם מלנוציטים באפידרמיס לייצר מלנין, אשר מגן על העור מפני נזק הקרנה סולארית. אייזנגר ומרקו הציעו את השיטה המעשית הראשונה לתרבות של מלנוציטים אנושייםמתוךהאפידרמיס 5. החשוב ביותר, הרקמות המשמשות בדרך כלל באים תינוקות היילוד וזה קשה מאוד לבודד מלנוציטים הראשי מרקמות העור למבוגרים. החלבון המקושר Rho של קינאז מעכב Y-27632 משפר באופן משמעותי את היעילות של בידוד תא גזע באפידרמיס11-13. בנוסף, אנו דיווחו גם על שיטה לבידוד תאים באפידרמיס של האדם העיקרי מרקמות העור בנוכחות Y-2763210,11. בפרוטוקול זה, Y-27632 הוכח ביעילות להגדיל את התשואה של המלנוציטים הראשוניים. באמצעות השיטה המקובלת יש שחזור נמוך ההתאוששות התאים והוא זקוק סביב 3 כדי 4 שבועות של תרבות עבור מלנוציטים לגדול במספרים מספיקים למעבר. זו שיטה חדשה, שבה Y-27632 מתווסף למדיום הצמיחה של ה-מית, הגדילה מלנוציט תשואה על ידי כחמש פעמים, ואת המלנוציטים שהתקבלו יכול להתרבות באופן רגיל. בדקנו גם את השיטה החדשה באמצעות בינוני מסחרי ומצאנו תוצאות דומות. לגבי המנגנון המעורב, מחקר שנערך לאחרונה הוכיחה כי ההשפעה של Y-27632 כדי לשפר את היעילות של בידוד מלנוציט מתרחשת בעיקר באמצעות keratinocytes16.
חשוב מכך, הצלחנו להשיג מלנוציטים טהורים עם תפקוד תקין בשיטה החדשה. מעבר 1 (P1) מלנוציטים היו כמעט מוכתמות עבור ביטוי MITF המציין כי מלנוציטים טהור מתקבלים לאחר המעבר הראשון. מלנוציטים ראשוניים עם פוטנציאל גדילה גבוה מאוד חשוב עבור מחקר ביולוגי יישומים קליניים. מלנוציטים מבודדים באמצעות שיטה חדשה יכול להיגרם פיגמנט לאחר הטיפול עם forskolin, activator של cyclase אדנילאט המגביר רמות מחזורי AMP, המציין אלה מלנוציטים יכול לתפקד בדרך כלל, אשר יהיה שימושי עבור לימוד ליקויים פיגמנטציה ומלנומה14.
לסיכום, שיטה יעילה מאוד הוקמה בהצלחה כדי לבודד מלנוציטים הראשי מרקמות העור המבוגר. שיטה משופרת זו עשויה לתרום לאספקת מספר מספיק של מלנוציטים באופן מהיר למחקר ביולוגי וליישומים קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים מצהירים על שום עניין של קונפליקט.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (2017YFA0104604), התוכנית הכללית של הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81772093), פרויקט מחקר לוגיסטיקה צבאית (AWS17J005), התוכנית המפתח של מחוז שאנדונג המדע הטבעי הקרן (ZR2019ZD36) ואת מחקר מפתח תוכנית פיתוח של מחוז שאנדונג (2019GSF108107) כדי X.W. גואנג-דונג בסיסי מחקר היסוד (2019A1515110833) ואת קרנות המחקר הבסיסי של אוניברסיטת שאנדונג (2019GN043) ל J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
- Costin, G. E., Hearing, V. J. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).
- Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P.
- Eisinger, M., Marko, O. Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).
- Hirobe, T. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).
- Halaban, R., et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).
- Kunisada, T., et al. Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis. Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).
- Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor. Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Yokoyama, S., et al. Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage. Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).
- Mi, J., et al. A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).
