Summary
इस पत्र में बताया गया है कि टीवीए माध्यम में वाई-27632 के अलावा वयस्क त्वचा ऊतकों से मेलानोसाइट्स की उपज में काफी वृद्धि हो सकती है।
Abstract
अलगाव और त्वचा के ऊतकों से प्राथमिक मेलानोसाइट्स की संस्कृति जैविक अनुसंधान के लिए बहुत महत्वपूर्ण है और व्यापक रूप से नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है। पारंपरिक विधि द्वारा त्वचा के ऊतकों से प्राथमिक मेलानोसाइट्स को अलग करने में आमतौर पर पर्याप्त रूप से पारित होने में लगभग 3 से 4 सप्ताह लगते हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात, उपयोग किए जाने वाले ऊतक आमतौर पर नवजात पूर्वेखाल होते हैं और वयस्क ऊतकों से प्राथमिक मेलानोसाइट्स को कुशलतापूर्वक अलग करना अभी भी एक चुनौती है। हमने हाल ही में मेलानोसाइट्स के लिए एक नई अलगाव विधि विकसित की है जो पारंपरिक प्रोटोकॉल की तुलना में 48 एच के लिए प्रारंभिक संस्कृति माध्यम में वाई-27632, एक रो किनेज़ अवरोधक जोड़ती है, यह नई विधि नाटकीय रूप से मेलानोसाइट्स की उपज को बढ़ाती है और फोरस्किन ऊतकों से मेलानोसाइट्स को अलग करने के लिए आवश्यक समय को कम करती है। अब हम प्राथमिक मेलानोसाइट्स को कुशलतापूर्वक संस्कृति के लिए वयस्क एपिडर्मिस का उपयोग करके इस नई विधि का वर्णन करते हैं। महत्वपूर्ण बात, हम बताते हैं कि इस नई विधि द्वारा तैयार वयस्क ऊतकों से प्राप्त मेलानोसाइट्स सामान्य रूप से कार्य कर सकते हैं। इस नए प्रोटोकॉल से आसानी से एक्सेस किए गए वयस्क त्वचा ऊतकों से तैयार प्राथमिक मेलानोसाइट्स का उपयोग करके पिगमेंटेशन दोषों और मेलानोमा के अध्ययनों को काफी लाभ होगा।
Introduction
इस अध्ययन का लक्ष्य जैविक अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए वयस्क त्वचा के एपिडर्मिस से मेलानोसाइट्स को अलग करने के लिए एक सरल और प्रभावी प्रोटोकॉल विकसित करना था। मेलानोसाइट्स, जो त्वचा के बेसल एपिडर्मिस और बालों के रोम में स्थित हैं, मेलेनिन1का उत्पादन करके त्वचा और बालों के पिगमेंटेशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एपिडर्मल मेलानोसाइट्स से परिणामस्वरूप त्वचा का पिगमेंटेशन एक पराबैंगनी विकिरण फिल्टर के रूप में कार्य करता है जो त्वचा में अंतर्निहित कोशिकाओं को डीएनए क्षति को कम/रोकता है2। त्वचा में मेलानोसाइट्स का असामान्य प्रसार काफी आम है, जैसे सौम्य नेवी (मॉल) के गठन में, जिसमें मेलानोसाइट्स संभावित रूप से ऑन्कोजेनिक विकास में बदल जाते हैं जिसके बाद सेलुलर सेनेसेंस3होता है।
1957 के बाद से, मानव प्राथमिक मेलानोसाइट्स का अलगाव और बाद की संस्कृति4संभव हो गई है, लेकिन 1982 के बाद से ही एक कुशल तरीका रहा है जो एपिडर्मिस5से मानव मेलानोसाइट्स की संस्कृतियों को पुन: स्थापित कर सकता है। एपिडर्मिस से प्राथमिक मेलानोसाइट्स को अलग करने की पारंपरिक विधि में दो-चरण एंजाइमेटिक पाचन शामिल है। संक्षेप में, त्वचा को शुरू में डर्मिस से एपिडर्मिस को अलग करने के लिए डिस्पास के साथ पचाया जाता है, जिसके बाद एपिडर्मिस को मेलानोसाइट्स और केराटिनोसाइट्स युक्त निलंबन का उत्पादन करने के लिए ट्रिप्सिन के साथ पचाया जाता है, जिसे फिर चुनिंदा मीडिया में उगाया जा सकता है। वर्तमान में, प्रारंभिक संस्कृति आमतौर पर पारंपरिक विधि का उपयोग करके मेलानोसाइट्स तक पहुंचने में लगभग 3 से 4 सप्ताह लगती है, जो उनके अलगाव की कम दक्षता के कारण होने की संभावना है। इसलिए, वयस्क त्वचा ऊतकों से मेलानोसाइट्स के प्रारंभिक उत्पादन में वृद्धि प्रयोगशाला अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों दोनों के लिए काफी मददगार होगी।
कई विकास कारक, जिनमें से अधिकांश को केराटिनोसाइट्स (उदाहरण के लिए, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF और एससीएफ)5-8-8द्वारा स्रावित दिखाया गया है, जो स्तनधारी मेलानोसाइट्स के भेदभाव और प्रसार को विनियमित करता है। फीडर परतों के अभाव में, उन विकास कारकों की कमी से मेलानोसाइट्स का प्रसार कम हो जाता है और उनके बढ़े हुए एपोप्टोसिस9। फीडर कोशिकाओं और मेलानोसाइट्स के रूप में केराटिनोसाइट्स की सह-संस्कृति त्वरित मेलानोसाइट प्रसार और कम एपोप्टोसिस का कारण बन सकती है। हालांकि, सह-संस्कृति विधि न केवल केराटिनोसाइट्स तैयार करने के लिए अधिक त्वचा ऊतकों की मांग करती है, जो व्यावहारिक नहीं है, बल्कि कुशलता से काम नहीं कर सकती है क्योंकि मेलानोसाइट्स द्वारा आवश्यक संस्कृति की स्थिति केराटिनोसिटे विकास के पक्ष में नहीं है, और इसके विपरीत।
पिछले अध्ययनों से पता चला है कि विकास माध्यम में वाई-27632, एक रॉक अवरोधक के अलावा त्वचा के ऊतकों10--14से मानव प्राथमिक एपिडर्मल कोशिकाओं की उपज को बढ़ा सकते हैं। इसलिए, यह परीक्षण करना दिलचस्प होगा कि क्या मानव प्राथमिक मेलानोसाइट्स के अलगाव को वाई-27632 की उपस्थिति से लाभ होगा। दरअसल, टीका TIVA माध्यम15में वाई-27632 के अलावा, जिसमें टीपीए, आईबीएमएक्स,एनए 3वीओ4 और डीबीएएमपी शामिल हैं, ने प्रारंभिक संस्कृतियों में चमड़ी ऊतकों से अलग प्राथमिक मेलानोसाइट्स की उपज में काफी वृद्धि की16। पारंपरिक प्रोटोकॉल की तुलना में, यह नया प्रोटोकॉल मेलानोसाइट्स16की उपज बढ़ाने में काफी अधिक कुशल है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल बुनियादी और लागू जैविक अनुसंधान में अपने आवेदन को बढ़ावा देने के लिए पिछले अध्ययन16 के आधार पर वयस्क त्वचा ऊतकों का उपयोग करके विस्तार से नई विधि का वर्णन करता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
इस प्रोटोकॉल में वयस्क चमड़ी ऊतकों के उपयोग को मानव अनुसंधान आचार समिति (संख्या 2015120401, तिथि: 12 मई, 2015) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
नोट: कोशिकाओं और संस्कृतियों के संदूषण को रोकने के लिए बाँझ वातावरण में निम्नलिखित सभी प्रक्रियाओं को करें।
1. तैयारी
- 15 एमएल ट्यूबों में खतना सर्जरी से ताजा वयस्क चमड़ी ऊतकों को इकट्ठा करें जिसमें फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 10 एमएल होते हैं और 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करते हैं।
नोट: ऊतकों को उनके उत्तेजन के बाद 24 घंटे के भीतर नीचे विस्तृत रूप में अलग करें। - रिएजेंट्स और कल्चर मीडियम तैयार करें।
- वॉशिंग सॉल्यूशन के रूप में 3% पी/एस (पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन) तैयार करें। पीबीएस के 50 एमएल को पेनिसिलिन (100 यू/एमएल) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 मिलीग्राम/एल) (पी/एस) के 1.5 एमएल के साथ मिलाएं।
- एंजाइमेटिक पाचन को बेअसर करने के लिए समाप्ति समाधान (बेअसर समाधान) तैयार करें। डीएमईएम माध्यम में 1% पी/एस, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) का पूरक।
- संस्कृति मेलानोसाइट्स के लिए TIVA माध्यम तैयार करें: हैम के F12; 10% एफबीएस; 1x P/S/ग्लूटामाइन; ५० एनजी/एमएल 12-ओ-टेट्राडेकैनोइल फोर्बोल-13-एसीटेट (टीपीए); 1 x 10-4 एम 3-आइसोब्यूटिल-1-मिथाइल जांथिन (आईबीएमएक्स); 1 माइक्रोन एनए3वीओ4; 1 x 10-3 एम एन-6, 2'-ओ-डिब्यूटिरिनेनोसिन-3′, 5′-चक्रीय मोनोफॉस्फेट (dbcAMP)।
2. पारंपरिक विधि
- त्वचा के ऊतकों का पूर्व उपचार
- प्रत्येक वयस्क चमड़ी ऊतक को एक बार 30 एस के लिए 75% इथेनॉल (अल्कोहल) के 10 एमएल के साथ कुल्लाएं, और फिर 5 मिनट के लिए 10 एमएल वाशिंग सॉल्यूशन (3% पी/एस) के साथ दो बार कुल्ला।
नोटः अगर बहुत सारा खून है तो शुरुआत में पीबीएस के 10 एमएल के साथ चमड़ी के ऊतकों को धोएं। सभी वॉश 100 मिमी सेल कल्चर व्यंजन में तैयार किए जाते हैं। - एक 100 मिमी सेल संस्कृति पकवान के कवर में चमड़े के नीचे एडीपोज ऊतकों और ढीले संयोजी ऊतकों को हटाने के लिए एक शल्य ब्लेड के साथ प्रत्येक चमड़ी ऊतक परिमार्जन।
नोट: वसा परतों को दूर करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें जब तक कि केवल पतली एपिडर्मिस और घने डर्मिस ही रहें। - प्रत्येक वयस्क चमड़ी को डर्मिस साइड के साथ एक और 100 मिमी संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें।
नोट: प्रत्येक वयस्क चमड़ी ऊतक को 3-4 मिमी चौड़ी स्ट्रिप्स में काट लें ताकि डिस्पॉज़ काम को अधिक कुशलता से काम किया जा सके। - वयस्क चमड़ी ऊतकों के साथ प्रत्येक 100 मिमी संस्कृति पकवान में 2.5 मिलीग्राम/एमएल डिस्पास जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 से 20 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: ऊतक के प्रत्येक ग्राम dispase समाधान के 10 मिलीएल के साथ पचा जाता है ।
- प्रत्येक वयस्क चमड़ी ऊतक को एक बार 30 एस के लिए 75% इथेनॉल (अल्कोहल) के 10 एमएल के साथ कुल्लाएं, और फिर 5 मिनट के लिए 10 एमएल वाशिंग सॉल्यूशन (3% पी/एस) के साथ दो बार कुल्ला।
- वयस्क चमड़ी ऊतक से एपिडर्मिस का पृथक्करण
- 16 से 20 घंटे के लिए पाचन के बाद, चिमटी का उपयोग करके एपिडर्मिस को डर्मिस से अलग करें। एक चिमटी के साथ ऊतक के डर्मल किनारे के एक तरफ पकड़ो और एक और चिमटी के साथ एपिडर्मल भाग की इसी स्थिति और धीरे से एपिडर्मिस छील ।
- एडिकर्मिस 3x को वॉशिंग सॉल्यूशन (3% पी/एस) के साथ धोएं और फिर एपिडर्मिस को एक ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- पॉर्न में 0.05% ट्राइप्सिन के 5 मिलील जोड़कर एपिडर्मिस को जलमग्न करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें।
नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब हिलाएं कि एपिडर्मिस इनक्यूबेशन से पहले पूरी तरह से जलमग्न हो गया है।
- प्राथमिक कोशिकाओं का संग्रह और संस्कृति
- ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए टर्मिनेशन सॉल्यूशन (10% एफबीएस, 1% पी/एस) की बराबर मात्रा जोड़ें और एपिडर्मल कोशिकाओं को अलग करने के लिए समाधान को 10-15 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
- मलबे को हटाने के लिए 100 माइक्रोन मेश फिल्टर के माध्यम से एक नए 50 एमएल ट्यूब में सेल निलंबन पास करें।
- 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
- सुपरनेट निकालें और कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए टीका तिवीवी माध्यम के 10 एमएल जोड़ें।
- एक 100 मिमी संस्कृति पकवान में पुनः निलंबित कोशिकाओं बीज।
- 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृति।
- हर 2 दिन में माध्यम बदलें।
- मार्ग कोशिकाओं जब वे 80% संगम तक पहुँचने.
3. नई विधि
नोट: नई विधि में ऊतक तैयारी और पाचन के लिए प्रक्रिया पारंपरिक विधि के लिए ऊपर वर्णित के रूप में ही है, फर्क सिर्फ इतना है कि अलग ताजा कोशिकाओं TIVA माध्यम के 10 एमएल में फिर से निलंबित कर रहे है 10 μM Y-२७६३२ युक्त ।
- सीडिंग के दो दिन बाद, वाई-27632 के बिना सामान्य तिवीवी माध्यम से मीडिया को बदलें। उसके बाद, संस्कृति की स्थिति नए और पारंपरिक तरीकों के बीच एक ही हैं।
4. सेल पासेजिंग
- TIVA माध्यम निकालें और PBS के साथ दो बार प्रत्येक संस्कृति पकवान कुल्ला ।
- 100 मिमी सेल कल्चर डिश में 0.05% ट्राइपसिन का 2 मिलियनल जोड़ें।
नोट: पाचन एंजाइमों और पकवान के नीचे के बीच पर्याप्त संपर्क सुनिश्चित करने के लिए पकवान हिलाएं। - 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पचाें।
- कोशिकाओं की जांच करने के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, और सुनिश्चित करें कि अधिकांश कोशिकाओं सेल संस्कृति पकवान से अलग हो गया है ।
नोट: धीरे से कोशिकाओं को जारी करने के लिए दौर और समाधान में नाव पकवान नल । पाचन समय को लम्बा करें यदि अधिकांश कोशिकाओं ने टैप करने के बाद निलंबित नहीं किया था, लेकिन 5 से अधिक मिनट नहीं। - टर्मिनेशन सॉल्यूशन के 2 मिलील जोड़कर ट्राइप्सिन गतिविधि को बेअसर करने के बाद मेलानोसाइट्स को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
- धीरे-धीरे सुपरनैंट को हटाने के बाद टीवीए माध्यम के 10 एमएल के साथ प्रत्येक सेल पेलेट को फिर से रीसस्ट करें, और फिर मेलानोसाइट्स की संख्या गिनें।
- प्लेट प्रति 100 मिमी सेल कल्चर डिश तिवीवीए माध्यम के 10 एमएल में लगभग 1 x 106 मेलानोसाइट्स।
- सेल कल्चर मीडियम को हर 48 घंटे में रिन्यू करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
चित्रा 1 पारंपरिक और नए तरीकों की तुलना में एक योजनाबद्ध आरेख दिखाता है। नई विधि के साथ ऊतक तैयारी और पाचन के लिए प्रक्रिया पारंपरिक विधि के लिए प्रक्रिया के समान है, फर्क सिर्फ इतना है कि अलग कोशिकाओं को 10 μM Y-27632 की उपस्थिति में TIVA माध्यम के 10 एमएल में फिर से निलंबित कर रहे हैं । सीडिंग के दो दिन बाद, वाई-27632 के बिना सामान्य तिवीवी माध्यम से मीडिया को बदलें। त्वचा के ऊतकों से प्राथमिक मेलानोसाइट्स को अलग करने की पारंपरिक विधि आमतौर पर मेलानोसाइट्स को पारित होने के लिए पर्याप्त संख्या में बढ़ने के लिए लगभग 3 से 4 सप्ताह की आवश्यकता होती है, लेकिन इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि ऊतक आमतौर पर नवजात शिशुओं से आते हैं और वयस्क त्वचा ऊतकों से प्राथमिक मेलानोसाइट्स को अलग करना बहुत मुश्किल होता है। हालांकि, नई विधि का उपयोग करके, वयस्क ऊतकों से मेलानोसाइट्स पारंपरिक विधि का उपयोग करके अलग किए गए मेलानोसाइट्स की तुलना में काफी अधिक संख्या में देखे जाते हैं। पारंपरिक विधि और नई विधि(चित्रा 2 ए)का उपयोग करके वयस्क त्वचा के ऊतकों से मेलानोसाइट्स को अलग करते समय 3, 6 और 8 दिनों में सूक्ष्म विचार लिए गए थे। इन सूक्ष्म विचारों में, नई विधि ने 6 और 8 दिनों में मेलानोसाइट्स की उपज में काफी वृद्धि की। इसके बाद 3, 6 और 8 दिनों में कम से कम 10 विभिन्न सूक्ष्म क्षेत्रों की गणना करके मेलानोटेट संख्या की मात्रा निर्धारित की गई थी। परिणामों से पता चला है कि नई विधि का उपयोग करके अलग किए गए मेलानोसाइट्स की संख्या 6 और 8(चित्रा 2B)में पारंपरिक विधि का उपयोग करके अलग किए गए मेलानोसाइट्स की संख्या से बहुत अधिक है। संस्कृति के 8 दिनों के बाद, मेलानोसाइट्स को ट्राइप्सिन का उपयोग करके काटा गया और फिर प्रत्येक 100 मिमी डिश में एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ गिना गया, जिससे पता चला कि नई विधि ने मेलानोसिट यील्ड को लगभग पांच गुना(चित्रा 2C)तक बढ़ा दिया। पासिंग के एक दिन बाद 9 दिन में लिए गए सूक्ष्म विचारों से पता चला कि पारित मेलानोसाइट्स सामान्य रूप से(चित्रा 2D)पैदा हो गए, जिसकी पुष्टि Ki67 स्टेनिंग(चित्रा 2E)द्वारा की गई थी ।
अलगाव के बाद प्रारंभिक संस्कृति के दौरान वाई-27632 द्वारा मेलानोसाइट्स की बढ़ी हुई उपज को पिछले प्रकाशन16में केराटिनोसाइट्स के नियमन के माध्यम से दिखाया गया है। जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, वाई-27632 ने पारित मेलानोसाइट्स(चित्रा 3ए-बी)के विकास और प्रसार में वृद्धि नहीं की और मेलानोसाइट्स(चित्र 3सी-डी)के एपोप्टोसिस को बाधित नहीं किया। हालांकि, वाई-27632 ने केराटिनसाइट अटैचमेंट(चित्रा 3ई-एच)में काफी वृद्धि की और मेलानोसिट-कल्चर टीवीए मीडिया में इसके जीवित(चित्रा 3आई)को भी बढ़ावा दिया। या तो वाई-27632 की उपस्थिति में केराटिनोसाइट्स के साथ सह-संस्कृति या वाई-27632 उपचारित केराटिनोसाइट्स से प्राप्त वातानुकूलित माध्यम मेलानोसाइट्स(चित्रा 3जे)के विकास को काफी बढ़ा सकता है।
नई विधि का उपयोग करके अलग किए गए मेलानोसाइट्स को आगे चित्रित करने के लिए, एमआईटीएफ, एक विशिष्ट मेलानोसिट मार्कर, प्रारंभिक पासेज के बाद मेलानोसाइट्स की शुद्धता की जांच करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। चित्रा 4A से पता चलता है कि 1 मार्ग पर MITF व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिशत लगभग १००% था, यह दर्शाता है कि शुद्ध मेलानोसाइट्स नई विधि है, जो पारंपरिक विधि के समान है द्वारा पहले मार्ग के बाद प्राप्त किए गए थे । यह परीक्षण करने के लिए कि क्या नई विधि का उपयोग करके मेलानोसाइट्स अलग-थलग पड़ जाते हैं, वे विट्रो में 2 दिनों के लिए फोर्स्कोलिन (एफके) के साथ इलाज किया गया, जिसने मेलानोसाइट्स(चित्रा 4B)के पिगमेंटेशन के स्तर को प्रेरित किया। एक साथ लिया, इन आंकड़ों का सुझाव है कि नई विधि का उपयोग कर अलग मेलानोसाइट्स सामान्य रूप से कार्य कर सकते हैं और वर्णक का उत्पादन कर सकते हैं।
चित्रा 1: नई विधि और पारंपरिक विधि की तुलना। यह योजना नई अलगाव विधि के साथ पारंपरिक विधि की तुलना दिखाती है। फर्क सिर्फ इतना है कि अलग ताजा कोशिकाओं को 10 μM Y-27632 की उपस्थिति में TIVA माध्यम के 10 एमएल में फिर से निलंबित कर रहे हैं । सीडिंग के दो दिन बाद, माध्यम को वाई-27632 के बिना सामान्य तिवीवी माध्यम से बदल दिया जाता है। नई विधि आमतौर पर लगभग 8 दिन में पासिंग के लिए उपयुक्त मेलानोसाइट्स का घनत्व प्राप्त करती है, जबकि पारंपरिक विधि आमतौर पर पासिंग के लिए पर्याप्त संख्या में मेलानोसाइट्स विकसित करने में लगभग 20 दिन लेती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: नई अलगाव विधि प्राथमिक मेलानोसाइट्स के उत्पादन को बढ़ाती है। (A)पारंपरिक विधि (शीर्ष पंक्ति) द्वारा तैयार मेलानोसाइट्स की प्रतिनिधि छवियां और प्रारंभिक टीका के बाद 3, 6 और 8 दिनों में नई विधि (निचली पंक्ति) द्वारा। (ख)3, 6 और 8 दिनों में कम से कम 10 विभिन्न सूक्ष्म क्षेत्रों (सेल नंबर/दृष्टि) में मेलानोसिट संख्या की गणना करके पारंपरिक विधि और नई विधि का उपयोग करके तैयार किए गए मेलानोसिट नंबरों का मात्राकरण । सभी प्रयोगों को ट्रिपलीकेट में किया गया था और परिणाम प्रति सूक्ष्म क्षेत्र कोशिकाओं की औसत संख्या के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। (ग)8 दिनों तक संस्कृति के बाद, मेलानोसाइट्स को ट्राइप्सिन का उपयोग करके काटा गया था और पारंपरिक विधि का उपयोग करके तैयार किए गए मेलानोसाइट्स की संख्या और नई विधि को सेल काउंटिंग प्लेट का उपयोग करके गिना गया था। कोशिकाओं की संख्या ट्रिपलिकेट प्रयोगों से गणना की गई थी, और परिणाम प्रति 100 मिमी पकवान कोशिकाओं की औसत संख्या दिखाते हैं। (घ)एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर मेलानोसाइट्स की संख्या की गिनती के बाद, पारंपरिक विधि या नई विधि का उपयोग कर तैयार मेलानोसाइट्स नए व्यंजनों में वरीयता प्राप्त थे और 9 दिन में सूक्ष्म तस्वीरें ली गई थीं । (ई)मेलानोसाइट्स 0 या मार्ग 1 पर नई विधि का उपयोग करके अलग-थलग कर दिया गया था और Ki67 एंटीबॉडी (लाल) और DAPI (नाभिक, नीला) के साथ दाग दिया गया था। (बी-सी),छात्र के टी-टेस्टका उपयोग नए और पारंपरिक विधि के बीच मतभेदों का विश्लेषण करने के लिए किया गया था, ** पी एंड एलटी; 0.01, ***पी एंड एलटी; 0.005। सभी पैमाने पर सलाखों के 100 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 3: वाई-27632 केराटिनसाइट्स के विनियमन के माध्यम से मेलानोसिट विकास को बढ़ाता है। (A)शुद्ध मेलानोसाइट्स (मार्ग 3) 12, 24, 48, और 60 घंटे के लिए 10 μM Y-27632 के साथ इलाज किया गया और मेलानोसाइट्स की संख्या CCK-8 परख द्वारा विश्लेषण किया गया था। (ख)शुद्ध मेलानोसाइट्स (मार्ग 3) 48h के लिए 10 μM Y-27632 के साथ इलाज किया गया और फिर Ki67 धुंधला के लिए तय किया गया । DAPI परमाणु धुंधला के साथ संकेत दिया कुल जीवित कोशिकाओं के बीच Ki67 सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत का परिमाणीकरण । (सी-डी) शुद्ध मेलानोसाइट्स (मार्ग 3) को 48 एच के लिए 10 माइक्रोन वाई-27632 के साथ इलाज किया गया था और फिर या तो एनेक्सटिन वी-फिटसी और प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ एपोप्टिक कोशिकाओं के लिए दाग दिया गया था जिसके बाद एफएएफएस विश्लेषण(सी)या ट्यूनल परख के लिए तय किया गया था। (ई)ट्रिप्सिन पाचन के बाद अलग एपिडर्मिस को वाई-27632 (10 माइक्रोन) के साथ या बिना टीवीए माध्यम के साथ चढ़ाया गया था और 2 दिन बाद केराटिनोसाइट्स का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण पैन-साइटोकेराटिन एंटीबॉडी (पैन-सीक) के साथ किया गया था। (F)वाई-27632-उपचारित और नियंत्रण व्यंजनों में केराटिनोसाइट्स का परिमाणीकरण(ई)कुल 500 कोशिकाओं में कीराटिनोसाइट्स के प्रतिशत के रूप में गिना जाता है। (जी)शुद्ध मार्ग 3 केराटिनोसाइट्स को टीवीए माध्यम में वाई-27632 (10 माइक्रोएम) के साथ या उसके बिना वरीयता दी गई थी। सीडिंग के बाद एक दिन में एपिडर्मल कोशिकाओं की छवियां दिखाई जाती हैं। (ज)वाई-27632-उपचारित और नियंत्रण व्यंजनों में संलग्न केराटिनोसाइट्स का परिमाणीकरण(जी)से कुल 5000 कोशिकाओं में संलग्न कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में वरीयता प्राप्त है। (I)शुद्ध मार्ग 3 केराटिनोसाइट्स को वाई-27632 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में टीवीए माध्यम के साथ चढ़ाया गया था। सूक्ष्म छवियों को 24 घंटे(जे)लेफ्ट पैनल में प्राप्त किया गया था: शुद्ध मार्ग की समान संख्या 3 मेलानोसाइट्स को अतिरिक्त (एस) के साथ 4 समूहों में TIVA माध्यम के साथ चढ़ाया गया था जैसा कि संकेत दिया गया था: 1) वाई-27632 (10 μM) अकेले (ग्राफ में वाई), 2) मार्ग 3 keratinocytes अकेले, 3) keratinocytes और Y-27632 (10 μM) (K + Y), और 4) कोई अतिरिक्त (नकारात्मक नियंत्रण, कांग्रेस) । नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में मेलानोसिट प्रसार में सापेक्ष गुना परिवर्तन चढ़ाना के बाद 24 घंटे और 48 घंटे में मेलानोसाइट्स की संख्या की गणना करके निर्धारित किए गए थे। राइट पैनल: वातानुकूलित TIVA मीडिया चढ़ाना के बाद 48 घंटे में (बाएं पैनल) में मार्ग 3 melanocyte संस्कृतियों के 4 समूहों से प्राप्त किया गया। फिर, मार्ग 3 मेलानोसाइट्स की बराबर संख्या 4 समूहों में चढ़ाया गया था, प्रत्येक वातानुकूलित मीडिया में से एक के साथ । नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में मेलानोसिट प्रसार में सापेक्ष गुना परिवर्तन चढ़ाना के बाद 24 घंटे और 48 घंटे में मेलानोसाइट्स की संख्या की गणना करके निर्धारित किए गए थे। (ए-जे) सभी प्रयोगों को 3 बार दोहराया गया है, *पी &0.05, ** पी <0.01, ***pपी<0.005। छवियों में सभी बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े को एमआई एट अल16से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: नई विधि का उपयोग करके अलग-थलग मेलानोसाइट्स का लक्षण वर्णन। (A)नई या पारंपरिक विधि का उपयोग करके तैयार किए गए मेलानोसाइट्स में एमआईटीएफ (लाल) की इम्यूनोफ्लोरेसेंस की प्रतिनिधि छवियां । दापी दाग नाभिक (नीला) । (ख)सेल छर्रों को नई विधि का उपयोग करके तैयार किए गए मेलानोसाइट्स से एकत्र किया गया था और उन्हें 2 दिनों के लिए फोरस्कोलिन (एफएसके) या डीएमएसओ वाहन के साथ नियंत्रण (कॉन) के रूप में इलाज किया गया था। सभी पैमाने पर सलाखों के 100 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल हाल ही में16के प्रकाशन पर आधारित था । नई विधि के साथ सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित महत्वपूर्ण चरणों पर कुछ ध्यान दिया जाना चाहिए। सबसे पहले, एपिडर्मिस और डर्मिस का सफल अलगाव महत्वपूर्ण है। वयस्क चमड़ी ऊतकों को एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके 3-4 मिमी चौड़ी स्ट्रिप्स में काट लें ताकि डिस्पास काम को अधिक अच्छी तरह से और आसानी से डर्मिस से एपिडर्मिस को अलग करने के लिए किया जा सके। दूसरा, उन दो परतों को अलग करते समय, डर्मिस के प्रदूषण से बचा जाना चाहिए क्योंकि डर्मल फाइब्रोब्लास्ट भी मेलानोसाइट संस्कृति माध्यम में विकसित हो सकते हैं। तीसरा, ट्राइप्सिन पाचन कदम 30 मिनट से कम होना चाहिए; अन्यथा, यह अलग कोशिकाओं की व्यवहार्यता को काफी कम कर देगा।
यह नई विधि मेलानोसिट अलगाव के लिए आवश्यक समय को काफी छोटा करती है। मानव एपिडर्मल मेलानोसाइट्स मेलेनिन का उत्पादन करते हैं, जो त्वचा को सौर विकिरण क्षति से बचाता है। ईसिंगर और मार्को ने एपिडर्मिस5से मानव मेलानोसाइट्स की संस्कृति के लिए पहली व्यावहारिक विधि का प्रस्ताव किया । सबसे महत्वपूर्ण बात, उपयोग किए जाने वाले ऊतक आमतौर पर नवजात शिशुओं से आते हैं और वयस्क त्वचा ऊतकों से प्राथमिक मेलानोसाइट्स को अलग करना बहुत मुश्किल है। Rho से जुड़े प्रोटीन kinase अवरोधक Y-27632 काफी एपिडर्मल स्टेम सेल अलगाव11--13की दक्षता में सुधार । इसके अतिरिक्त, हमने वाई-2763210, 11,11की उपस्थिति में त्वचा के ऊतकों से मानव प्राथमिक एपिडर्मल कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विधि की भी सूचना दी। इस प्रोटोकॉल में, प्राथमिक मेलानोसाइट्स की उपज को कुशलतापूर्वक बढ़ाने के लिए वाई-27632 दिखाया गया था। पारंपरिक विधि का उपयोग करने में कम सेल रिकवरी दर होती है और मेलानोसाइट्स को पारित होने के लिए पर्याप्त संख्या में बढ़ने के लिए लगभग 3 से 4 सप्ताह की संस्कृति की आवश्यकता होती है। यह नई विधि, जिसमें वाई-27632 को तिव विकास माध्यम में जोड़ा जाता है, लगभग पांच गुना तक मेलानोसिट यील्ड में वृद्धि होती है, और प्राप्त मेलानोसाइट्स सामान्य रूप से पैदा हो सकते हैं। हमने वाणिज्यिक माध्यम का उपयोग करके नई विधि का भी परीक्षण किया और इसी तरह के परिणाम पाए। इसमें शामिल तंत्र के बारे में, हाल ही में हुए एक अध्ययन से पता चला है कि मेलानोसिट अलगाव की दक्षता बढ़ाने के लिए वाई-27632 का प्रभाव मुख्य रूप से केराटिनोसाइट्स16के माध्यम से होता है।
महत्वपूर्ण बात, हमने नई विधि का उपयोग करके सामान्य कार्य के साथ शुद्ध मेलानोसाइट्स प्राप्त किए। मार्ग 1 (P1) मेलानोसाइट्स लगभग सभी एमआईटीएफ अभिव्यक्ति के लिए दाग थे जो यह दर्शाता है कि पहले मार्ग के बाद शुद्ध मेलानोसाइट्स प्राप्त किए जाते हैं। उच्च विकास क्षमता वाले प्राथमिक मेलानोसाइट्स जैविक अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। नई विधि का उपयोग करके अलग किए गए मेलानोसाइट्स को फोर्स्कोलिन के साथ उपचार के बाद वर्णक के लिए प्रेरित किया जा सकता है, जो चक्रीय एएमपी स्तर को बढ़ाता है, जो इन मेलानोसाइट्स को सामान्य रूप से कार्य कर सकता है, जो पिगमेंटेशन दोषों और मेलानोमा14का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होगा।
संक्षेप में, वयस्क त्वचा ऊतकों से प्राथमिक मेलानोसाइट्स को अलग करने के लिए एक अत्यधिक कुशल विधि सफलतापूर्वक स्थापित की गई थी। यह बेहतर विधि जैविक अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए तेजी से मेलानोसाइट्स की पर्याप्त संख्या प्रदान करने में योगदान दे सकती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
सभी लेखक संघर्ष का कोई हित घोषित नहीं करते ।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2017YFA0104604), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81772093), सैन्य रसद अनुसंधान परियोजना (AWS17J005), शेंडोंग प्रांत प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ZR2019ZD36) के प्रमुख कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था और शेंडोंग प्रांत के प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (२०१९GSF108107) X.W. गुआंगदोंग बेसिक और एप्लाइड बेसिक रिसर्च फाउंडेशन (2019A151110833) और शेंडोंग विश्वविद्यालय (२०१९GN043) के मौलिक अनुसंधान कोष जेएम के लिए
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
- Costin, G. E., Hearing, V. J. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).
- Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P. Human melanocytes in tissue culture. Journal of Investigative Dermatology. 28 (1), 15-32 (1957).
- Eisinger, M., Marko, O. Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).
- Hirobe, T. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).
- Halaban, R., et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).
- Kunisada, T., et al. Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis. Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).
- Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor. Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Yokoyama, S., et al. Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage. Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).
- Mi, J., et al. A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).
