Summary
Questo documento riporta che l'aggiunta di Y-27632 al mezzo TIVA può aumentare significativamente la resa dei melanociti dai tessuti della pelle adulti.
Abstract
L'isolamento e la coltura dei melanociti primari dai tessuti della pelle è molto importante per la ricerca biologica ed è stato ampiamente utilizzato per applicazioni cliniche. Isolare i melanociti primari dai tessuti della pelle con il metodo convenzionale di solito richiede circa 3 o 4 settimane per passare sufficientemente. Ancora più importante, i tessuti utilizzati sono di solito pregeniti ed è ancora una sfida per isolare in modo efficiente i melanociti primari dai tessuti adulti. Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo metodo di isolamento per i melanociti che aggiunge Y-27632, un inibitore della chinasi del Rho, al mezzo di coltura iniziale per 48 h. Rispetto al protocollo convenzionale, questo nuovo metodo aumenta drasticamente la resa dei melanociti e riduce il tempo necessario per isolare i melanociti dai tessuti di prepuzio. Ora descriviamo questo nuovo metodo in modo più dettagliato usando l'epidermide adulta per coltivare in modo efficiente i melanociti primari. È importante sottolineare che i melanociti ottenuti da tessuti adulti preparati da questo nuovo metodo possono funzionare normalmente. Questo nuovo protocollo beneficerà in modo significativo gli studi di difetti di pigmentazione e melanomi utilizzando melanociti primari preparati da tessuti della pelle adulta facilmente accessibili.
Introduction
L'obiettivo di questo studio era quello di sviluppare un protocollo semplice ed efficace per isolare i melanociti dall'epidermide della pelle adulta per la ricerca biologica e le applicazioni cliniche. I melanociti, che si trovano nell'epidermide basale della pelle e nei follicoli piliferi, svolgono un ruolo importante nella pigmentazione della pelle e dei capelli producendo melanina1. La pigmentazione cutanea risultante dai melanociti epidermici agisce come un filtro di radiazione ultravioletta che riduce/previene il danno del DNA alle cellule sottostanti nella pelle2. La proliferazione anormale dei melanociti nella pelle è abbastanza comune, come nella formazione di nevi (talpe) benigni in cui i melanociti potenzialmente si trasformano in crescita oncogenica seguita dalla senescenza cellulare3 .
Dal 1957, l'isolamento e la successiva cultura dei melanociti primari umani è stato possibile4, ma solo dal 1982 c'è stato un metodo efficiente che può riprodurre in modo riproducibile le culture dei melanociti umani dall'epidermide5. Il metodo convenzionale per isolare i melanociti primari dall'epidermide comporta una digestione enzimatica in due fasi. In breve, la pelle viene inizialmente digerita con dispasi per separare l'epidermide dal derma, dopo di che l'epidermide viene digerita con la trypsin per produrre sospensioni contenenti melanociti e cheratinociti, che possono quindi essere coltivati selettivamente in diversi supporti. Attualmente, la cultura iniziale di solito richiede circa 3 o 4 settimane per i melanociti per raggiungere la confluenza utilizzando il metodo convenzionale, che è probabilmente dovuto alla bassa efficienza del loro isolamento. Pertanto, aumentare la produzione iniziale di melanociti dai tessuti della pelle adulti sarebbe molto utile sia per la ricerca di laboratorio che per le applicazioni cliniche.
Molti fattori di crescita, la maggior parte dei quali hanno dimostrato di essere secreti da cheratinociti (ad esempio, z-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF e SCF)5-8, regolano la differenziazione e la proliferazione dei melanociti dei mammiferi. In assenza di strati di alimentatore, la mancanza di questi fattori di crescita porta alla diminuzione della proliferazione dei melanociti e alla loro aumento dell'apoptosi9. La co-coltura dei cheratinociti come cellule nutritrici e melanociti potrebbe portare ad accelerare la proliferazione del melanocito e a ridurre l'apoptosi. Tuttavia, il metodo di co-cultura non solo richiede più tessuti della pelle per preparare i cheratinociti, che non è pratico, ma potrebbe anche non funzionare in modo efficiente perché le condizioni di coltura richieste dai melanociti non favoriscono la crescita dei cheratinociti e viceversa.
Studi precedenti hanno riferito che l'aggiunta di Y-27632, un inibitore rock, nel mezzo di crescita può migliorare la resa delle cellule epidermiche primarie umane dai tessuti della pelle10-14. Pertanto, sarebbe interessante verificare se l'isolamento dei melanociti primari umani trarrebbe beneficio dalla presenza di Y-27632. Infatti, l'aggiunta di Y-27632 nell'inoculazione TIVA medium15, che contiene TPA, IBMX, Na3VO4 e dbcAMP, ha aumentato significativamente la resa dei melanociti primari isolati dai tessuti del prepuzio16. Rispetto al protocollo convenzionale, questo nuovo protocollo è significativamente più efficiente nell'aumentare la resa dei melanociti16. Pertanto, questo protocollo descrive in dettaglio il nuovo metodo utilizzando tessuti per la pelle adulti basati su uno studio precedente16 al fine di promuovere la sua applicazione nella ricerca biologica di base e applicata.
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Protocol
L'uso dei tessuti adulti del prepuzio in questo protocollo è stato approvato dal Comitato Etico della Ricerca Umana (No.2015120401, data: 12 maggio 2015).
NOTA: Eseguire tutte le procedure seguenti in un ambiente sterile per evitare contaminazioni di cellule e colture.
1. Preparativi
- Raccogliere tessuti di prepuzio adulti freschi da interventi chirurgici di circoncisione in tubi da 15 mL contenenti 10 mL di salina buffer fosfato (PBS) e conservarli in 4 gradi centigradi.
NOTA: Separare i tessuti come descritto di seguito entro 24 h dopo l'escissione. - Preparare reagenti e mezzi di coltura.
- Preparare il 3% p/S (penicillina/streptomycin) come soluzione di lavaggio. Mescolare 50 mL di PBS con 1,5 mL di penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 mg/L) (P/S).
- Preparare la soluzione di terminazione (soluzione di neutralizzazione) per la neutralizzazione della digestione enzymatica. Supplemento 1% P/S, 10% siero bovino fetale (FBS) in mezzo DMEM.
- Preparare i melanociti medi alla cultura TIVA: la F12 di Ham; 10% FBS; 1x P,S-glutamina; 50 ng/mL 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetato (TPA); 1 x 10-4 M 3-isobutyl-1-metil xanthine (IBMX); 1 - M Na3VO4; 1 x 10-3 M N-6,2'-O-dibutyryladenosine-3,5'-cofofottofa (dbcAMP).
2. Il metodo convenzionale
- Pretrattamento dei tessuti cutanei
- Sciacquare ogni tessuto prepuzio adulto una volta con 10 mL di 75% di etanolo (alcool) per 30 s, quindi risciacquare due volte con 10 mL di soluzione di lavaggio (3% P/S), per 5 min ciascuno.
NOTA: Lavare i tessuti del prepuzio con 10 mL di PBS all'inizio se c'è molto sangue. Tutti i lavatori sono preparati in 100 mm piatti di coltura cellulare. - Raschiare ogni tessuto del prepuzio con una lama chirurgica per rimuovere i tessuti adiposi sottocutanei e i tessuti connettivi sciolti nella copertura di un piatto di coltura cellulare da 100 mm.
NOTA: Utilizzare un bisturi per raschiare via gli strati di grasso fino a quando rimangono solo l'epidermide sottile e il denso derma. - Trasferire ogni prepuzio adulto in un altro piatto di coltura 100 mm con il derma verso il basso.
NOTA: Tagliare ogni tessuto prepuzio adulto in strisce larghe 3-4 mm utilizzando una lama del bisturi per rendere il lavoro dispase più efficiente. - Aggiungere 2,5 mg/mL di dispase ad ogni piatto di coltura da 100 mm con tessuti adulti di prepuzio e incubare per 16-20 h a 4 gradi centigradi.
NOTA: Ogni grammo di tessuto viene digerito con 10 mL di soluzione dispasi.
- Sciacquare ogni tessuto prepuzio adulto una volta con 10 mL di 75% di etanolo (alcool) per 30 s, quindi risciacquare due volte con 10 mL di soluzione di lavaggio (3% P/S), per 5 min ciascuno.
- Separazione dell'epidermide dal tessuto prepuzio adulto
- Dopo la digestione per 16-20 h, separare l'epidermide dal derma utilizzando una pinzetta. Afferrare un lato del bordo dermico del tessuto con una pinzetta e la posizione corrispondente della parte epidermica con un'altra pinzetta e staccare delicatamente l'epidermide.
- Lavare l'epidermide 3x con la soluzione di lavaggio (3% P/S), quindi trasferire l'epidermide in un tubo.
- Immergere l'epidermide aggiungendo 5 mL di 0,05% di trypsin nel tubo e incubare in un bagno d'acqua per 30 min a 37 .
NOTA: Agitare il tubo per assicurarsi che l'epidermide sia completamente sommersa prima dell'incubazione.
- Raccolta e coltura di cellule primarie
- Aggiungere un volume uguale di soluzione di terminazione (10% FBS, 1% P/S in DMEM) per neutralizzare la trippsina e pipetta la soluzione su e giù 10-15 volte per separare le cellule epidermiche.
- Passare la sospensione cellulare in un nuovo tubo da 50 mL attraverso un filtro a rete da 100 m per rimuovere i detriti.
- Centrifuga a 200 x g per 5 min.
- Rimuovere il supernatante e aggiungere 10 mL di inoculazione TIVA medio per riutilizzare le cellule.
- Semina le cellule risospese in un piatto di coltura di 100 mm.
- Cultura in un incubatore a 37 gradi centigradi con 5% di CO2.
- Cambiare il mezzo ogni 2 giorni.
- Passare le cellule quando raggiungono l'80% di confluenza.
3. Il nuovo metodo
NOTA: La procedura per la preparazione e la digestione dei tessuti nel nuovo metodo è la stessa descritta in precedenza per il metodo convenzionale, l'unica differenza è che le celle fresche isolate vengono risospese in 10 mL del supporto TIVA contenente 10 - M Y-27632.
- Due giorni dopo la seeding, sostituire il supporto con il normale supporto TIVA senza Y-27632. Dopo di che, le condizioni di coltura sono le stesse tra i metodi nuovi e convenzionali.
4. Cellula che passa
- Rimuovere il supporto TIVA e sciacquare due volte ogni piatto di coltura con PBS.
- Aggiungere 2 mL di 0,05% di trypsin per piatto di coltura cellulare da 100 mm.
NOTA: Agitare il piatto per garantire un adeguato contatto tra gli enzimi digestivi e il fondo del piatto. - Digerire in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 2 min.
- Utilizzare un microscopio per controllare le cellule e assicurarsi che la maggior parte delle cellule si sia dissociata dal piatto di coltura cellulare.
NOTA: Toccare delicatamente il piatto per rilasciare le celle per arrotondare e galleggiare nella soluzione. Prolungare il tempo di digestione se la maggior parte delle cellule non ha sospeso dopo la maschiatura, ma non più di 5 min in più. - Trasferire i melanociti in un tubo da 15 mL dopo aver neutralizzato l'attività della trypsin aggiungendo 2 mL di soluzione di terminazione. Centrifuga a 200 x g per 5 min.
- Risospendere ogni pellet cellulare con 10 mL di TIVA medio dopo aver rimosso lentamente il supernatante, e quindi contare il numero di melanociti.
- Piatto di circa 1 x 106 melanociti in 10 mL di TIVA medio per 100 mm cell coltura piatto.
- Rinnovare il mezzo di coltura cellulare ogni 48 h.
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Representative Results
Nella figura 1 viene illustrato un diagramma schematico che confronta i metodi convenzionali e quelli nuovi. La procedura per la preparazione e la digestione dei tessuti con il nuovo metodo è la stessa della procedura per il metodo convenzionale, l'unica differenza è che le cellule isolate vengono risospese in 10 mL di mezzo TIVA in presenza di 10 -M Y-27632. Due giorni dopo la seeding, sostituire il supporto con il normale supporto TIVA senza Y-27632. Il metodo convenzionale di isolare i melanociti primari dai tessuti della pelle di solito richiede circa 3 o 4 settimane per i melanociti di crescere in numero sufficiente per il passaggio, ma ancora più importante, i tessuti di solito provengono da neonati ed è molto difficile isolare i melanociti primari dai tessuti della pelle adulti. Tuttavia, utilizzando il nuovo metodo, i melanociti dai tessuti adulti sono osservati in numero significativamente maggiore rispetto ai melanociti isolati utilizzando il metodo convenzionale. Le visioni microscopiche sono state prese nei giorni 3, 6 e 8 quando si isolano i melanociti dal tessuto cutaneo adulto utilizzando il metodo convenzionale e il nuovo metodo (Figura 2A). In queste visioni microscopiche, il nuovo metodo ha aumentato significativamente la resa dei melanociti ai giorni 6 e 8. I numeri dei melanociti sono stati poi quantificati contando almeno 10 diversi campi microscopici nei giorni 3, 6 e 8. I risultati hanno mostrato che il numero di melanociti isolati utilizzando il nuovo metodo è molto superiore al numero di melanociti isolati utilizzando il metodo convenzionale nei giorni 6 e 8 (Figura 2B). Dopo 8 giorni di cultura, i melanociti sono stati raccolti utilizzando trypsin e poi contati con un contatore cellulare automatizzato in ogni singolo piatto da 100 mm, il che ha rivelato che il nuovo metodo ha aumentato la resa del melanocite di circa cinque volte (Figura 2C). Le visioni microscopiche scattate al giorno 9, un giorno dopo il passaggio, hanno mostrato che i melanociti passati si sono moltiplicati normalmente (Figura 2D), che è stata confermata dalla colorazione Ki67 (Figura 2E).
La maggiore resa dei melanociti di Y-27632 durante la cultura iniziale dopo l'isolamento è stata dimostrata attraverso la regolazione dei cheratinociti in una precedente pubblicazione16. Come illustrato nella Figura 3, Y-27632 non ha aumentato la crescita e la proliferazione dei melanociti passaggi (Figura 3A-B) e non ha inibito l'apoptosi dei melanociti (Figura 3C-D). Tuttavia, Y-27632 ha aumentato significativamente l'attaccamento al cheratinocito (Figura 3E-H) e ne ha anche promosso la sopravvivenza (Figura 3I) nei media TIVA della cultura melanocite. O co-cultura con cheratinociti in presenza di Y-27632 o il mezzo condizionato derivato da Y-27632 trattati cheratinociti potrebbe migliorare significativamente la crescita dei melanociti (Figura 3J).
Per caratterizzare ulteriormente i melanociti isolati utilizzando il nuovo metodo, MITF, un marcatore di melanocito specifico, è stato analizzato utilizzando la colorazione immunofluorescenza (IF) per verificare la purezza dei melanociti dopo il passaggio iniziale. La figura 4A mostra che la percentuale di cellule che esprimono MITF al passaggio 1 era quasi del 100%, indicando che i melanociti puri sono stati ottenuti dopo il primo passaggio con il nuovo metodo, che è simile al metodo convenzionale. Per verificare se i melanociti isolati utilizzando il nuovo metodo possono funzionare normalmente, sono stati trattati con forskolin (FSK) per 2 giorni in vitro, che ha indotto i livelli di pigmentazione dei melanociti (Figura 4B). Nel loro insieme, questi dati suggeriscono che i melanociti isolati utilizzando il nuovo metodo possono funzionare normalmente e possono produrre pigmenti.
Figura 1: Confronto tra il nuovo metodo e il metodo convenzionale. Questo schema mostra un confronto tra il metodo convenzionale e il nuovo metodo di isolamento. L'unica differenza è che le celle fresche isolate vengono risospese in 10 mL di mezzo TIVA in presenza di 10 SY-27632. Due giorni dopo la seeding, il mezzo viene sostituito con il normale mezzo TIVA senza Y-27632. Il nuovo metodo di solito raggiunge una densità di melanociti adatta per passare intorno al giorno 8, mentre il metodo convenzionale di solito richiede circa 20 giorni per crescere un numero sufficiente di melanociti per passare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il nuovo metodo di isolamento aumenta la produzione di melanociti primari. (A) Immagini rappresentative dei melanociti preparate con il metodo convenzionale (riga superiore) e con il nuovo metodo (riga inferiore) nei giorni 3, 6 e 8 dopo l'inoculazione iniziale. (B) Quantificazione dei numeri di melanociti preparati con il metodo convenzionale e il nuovo metodo contando i numeri di melanociti in almeno 10 diversi campi microscopici (numero di cellule/visione) nei giorni 3, 6 e 8. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia e i risultati sono espressi come numero medio di cellule per campo microscopico. (C) Dopo la coltura per 8 giorni, i melanociti sono stati raccolti utilizzando la trypsin e il numero di melanociti preparati con il metodo convenzionale e il nuovo metodo sono stati contati utilizzando una piastra di conteggio cellulare. Il numero di cellule è stato calcolato da esperimenti triplicati e i risultati mostrano il numero medio di cellule per piatto da 100 mm. (D) Dopo aver contato il numero di melanociti utilizzando un contatore cellulare automatizzato, i melanociti preparati con il metodo convenzionale o il nuovo metodo sono stati seminati in nuovi piatti e le foto microscopiche sono state scattate al giorno 9. (E) I melanociti isolati con il nuovo metodo al passaggio 0 o al passaggio 1 sono stati fissati e macchiati con anticorpi Ki67 (rosso) e DAPI (nuclei, blu). (B-C), il test t-student è stato utilizzato per analizzare le differenze tra il metodoP nuovo e quello convenzionale, P Tutte le barre della scala rappresentano 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Y-27632 migliora la crescita del melanocito attraverso la regolazione dei cheratinociti. (A) I melanociti puri (passaggio 3) sono stati trattati con 10 -m Y-27632 per 12, 24, 48 e 60 h e il numero di melanociti è stato analizzato dal saggio CCK-8. (B) I melanociti puri (passaggio 3) sono stati trattati con 10 M Y-27632 per 48h e poi sono stati fissati per la colorazione Ki67. Quantificazione della percentuale di cellule positive Ki67 tra le cellule vive totali indicato con colorazione nucleare DAPI. (C-D) I melanociti puri (passaggio 3) sono stati trattati con 10 SM Y-27632 per 48 h e poi sono stati macchiati per le cellule apoptotiche con annessina V-FITC e propidium iodide seguita da faCS analysis (C) o fissate per il saggio TUNEL. (E) L'epidermide isolata dopo la digestione della cipina è stata placcata con il mezzo TIVA con o senza Y-27632 (10 m) e 2 giorni dopo l'analisi immunofluorescenza della cheratinocitos è stata eseguita con un anticorpo pan-citokeratina (pan-ck). (F) Quantificazione dei cheratinociti nell'Anno-27632-trattato e controllare piatti da (E) come percentuale di cheratinociti su un totale di 500 cellule contate. (G) Passaggio puro 3 cheratinociti sono stati semi nati in tiVA con o senza Y-27632 (10 M). Le immagini delle cellule epidermiche vengono mostrate in un giorno dopo la semina. (H) Quantificazione dei cheratinociti attaccati nei piatti trattati con Y-27632 e che controllano i piatti da (G) come percentuale di cellule collegate in un totale di 5000 cellule semiseme. (I) Passaggio puro 3 cheratinociti sono stati placcati con mezzo TIVA in presenza o assenza di Y-27632. Le immagini microscopiche sono state ottenute a 24 h. ( (J) Pannello sinistro: Numero uguale di passaggio puro 3 melanociti sono stati placcati con tiVA medio in 4 gruppi con addition(s) come indicato: 1) Y-27632 (10 Solo M) (Y nel grafico), 2) passaggio 3 cheratinociti da solo , 3) cheratinociti e Y-27632 (10 m) (K-Y) nessuna aggiunta (controllo negativo, con). I cambiamenti relativi nella proliferazione dei melanociti rispetto al controllo negativo sono stati determinati contando il numero di melanociti a 24 h e 48 h dopo la placcatura. Pannello destro: I media TIVA condizionati sono stati ottenuti dai 4 gruppi di passaggio 3 colture melanociti (pannello sinistro) a 48 h dopo la placcatura. Poi, pari numero di passaggio 3 melanociti sono stati placcati in 4 gruppi, ciascuno con uno dei media condizionati. I cambiamenti relativi nella proliferazione dei melanociti rispetto al controllo negativo sono stati determinati contando il numero di melanociti a 24 h e 48 h dopo la placcatura. (A-J) Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti per 3 volte, ,p<0.05, s<0.01,'p<0.005.p Tutte le barre nelle immagini rappresentano 100 m. La cifra è stata modificata da Mi etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Caratterizzazione dei melanociti isolati utilizzando il nuovo metodo. (A) Immagini rappresentative della colorazione immunofluorescenza del MITF (rosso) nei melanociti preparati con il metodo nuovo o convenzionale. DAPI macchia nuclei (blu). (B) I pellet cellulari sono stati raccolti da melanociti preparati con il nuovo metodo e sono stati trattati per 2 giorni con il forskolin (FSK) o il veicolo DMSO come un controllo (con). Tutte le barre della scala rappresentano 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descritto si basava su una recente pubblicazione16. Occorre prestare attenzione ai seguenti passi critici per ottenere i migliori risultati con il nuovo metodo. In primo luogo, una separazione di successo dell'epidermide e del dermide è fondamentale. Tagliare i tessuti adulti di prepuzio in strisce larghe 3-4 mm utilizzando una lama del bisturi per rendere il dispase lavorare più a fondo e facilmente per separare l'epidermide dal derma. In secondo luogo, quando si separano questi due strati, la contaminazione del derma dovrebbe essere evitata poiché i fibroblasti dermici possono anche crescere nel mezzo di coltura del melanocite. In terzo luogo, il passo di digestione della trypsin dovrebbe essere inferiore a 30 min; in caso contrario, diminuirà significativamente la vitalità delle cellule isolate.
Questo nuovo metodo riduce significativamente il tempo necessario per l'isolamento del melanocite. I melanociti epidermici umani producono melanina, che protegge la pelle dai danni da irradiazione solare. Eisinger e Marko hanno proposto il primo metodo pratico per la cultura dei melanociti umani dall'epidermide5. Ancora più importante, i tessuti utilizzati di solito provengono da neonati ed è molto difficile isolare i melanociti primari dai tessuti della pelle adulti. L'inibitore della chinasi proteica associato al Rho Y-27632 migliora significativamente l'efficienza dell'isolamento delle cellule staminali epidermiche11-13. Inoltre, abbiamo anche segnalato un metodo per isolare le cellule epidermiche primarie umane dai tessuti della pelle in presenza di Y-2763210,11. In questo protocollo, Y-27632 è stato indicato per aumentare in modo efficiente la resa dei melanociti primari. Utilizzando il metodo convenzionale ha un basso tasso di recupero cellulare e ha bisogno di circa 3 a 4 settimane di coltura per i melanociti di crescere in numero sufficiente per il passaggio. Questo nuovo metodo, in cui Y-27632 viene aggiunto al mezzo di crescita TIVA, ha aumentato la resa di melanociti di circa cinque volte, e i melanociti ottenuti possono proliferare normalmente. Abbiamo anche testato il nuovo metodo utilizzando un mezzo commerciale e trovato risultati simili. Per quanto riguarda il meccanismo in questione, un recente studio ha dimostrato che l'effetto di Y-27632 per migliorare l'efficienza dell'isolamento dei melanociti si verifica principalmente attraverso cheratinociti16.
È importante sottolineare che abbiamo ottenuto melanociti puri con funzione normale utilizzando il nuovo metodo. I melanociti Passage 1 (P1) erano quasi tutti macchiati per l'espressione del MITF indicando che i melanociti puri si ottengono dopo il primo passaggio. I melanociti primari ad alto potenziale di crescita sono molto importanti per la ricerca biologica e le applicazioni cliniche. I melanociti isolati utilizzando il nuovo metodo possono essere indotti al pigmento dopo il trattamento con forskolin, un attivatore di ciclosi adenilare che aumenta i livelli di AMP ciclici, indicando che questi melanociti possono funzionare normalmente, che sarà utile per studiare i difetti di pigmentazione e melanoma14.
In sintesi, è stato stabilito con successo un metodo altamente efficiente per isolare i melanociti primari dai tessuti della pelle adulti. Questo metodo migliorato potrebbe contribuire a fornire un numero sufficiente di melanociti in modo rapido per la ricerca biologica e per le applicazioni cliniche.
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Disclosures
Tutti gli autori non dichiarano alcun interesse di conflitto.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), il programma chiave della Shandong Provincia Natural Science Foundation e il programma chiave di ricerca e sviluppo della provincia di Shandong (2019GSF108107) a X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A151510833) e I fondi di ricerca fondamentali della Shandong University (2019GN043) a J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
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