Summary
이 논문은 TIVA 배지에 Y-27632를 첨가하면 성인 피부 조직에서 멜라닌세포의 수율을 크게 증가시킬 수 있다고 보고합니다.
Abstract
피부 조직에서 1 차적인 멜라닌세포의 격리 그리고 문화는 생물학 연구를 위해 아주 중요하고 임상 응용을 위해 널리 이용되고 있습니다. 종래의 방법에 의한 피부 조직으로부터 1차 멜라닌세포를 분리하는 데는 보통 충분히 통과하기까지 약 3~4주가 소요된다. 더 중요한 것은, 사용된 조직은 일반적으로 신생아 포킨스이고 성인 조직에서 1 차적인 melanocytes를 효율적으로 격리하는 도전입니다. 최근에는 Rho 키나아제 억제제인 Y-27632를 초기 배양 배지에 48h.를 추가하는 멜라닌세포에 대한 새로운 절연 방법을 개발했습니다. 우리는 지금 1 차적인 melanocytes를 능통하게 배양하기 위하여 성인 표피를 사용하여 더 자세히 이 새로운 방법을 기술합니다. 중요한 것은, 우리는 이 새로운 방법에 의해 제조된 성인 조직에서 얻은 멜라닌세포가 정상적으로 작동할 수 있다는 것을 보여줍니다. 이 새로운 프로토콜은 쉽게 접근 성인 피부 조직에서 제조된 1 차적인 흑색종을 사용하여 색소 침착 결함 및 흑색종의 연구 결과를 현저하게 유익할 것입니다.
Introduction
이 연구의 목표는 생물학적 연구 및 임상 응용을 위해 성인 피부표에서 멜라닌신을 분리하는 간단하고 효과적인 프로토콜을 개발하는 것이었습니다. 피부의 기저 표피와 모낭에 위치한 멜라닌 세포는 멜라닌1을생성하여 피부와 모발의 색소 침착에 중요한 역할을 한다. 표피 멜라닌세포로부터의 피부 색소 침착은 피부2의근본적인 세포에 DNA 손상을 줄여 방지하는 자외선 필터역할을 한다. 피부에 있는 멜라닌세포의 비정상적인 증식은 멜라닌세포가 잠재적으로 세포 노화3에선행된 종양발생 성장으로 잠재적으로 변환되는 양성 네비(moles)의 형성과 같이 아주 일반적이다.
1957년 이래, 인간 1차 멜라닌세포의 고립및 후속 배양은4가가능했지만, 1982년부터만 표피5로부터인간의 멜라닌세포의 배양을 재현가능하게 확립할 수 있는 효율적인 방법이 있었다. 표피로부터 1차 멜라닌세포를 분리하는 종래의 방법은 2단계 효소 소화를 포함한다. 간단히 말해서, 피부는 처음에 진피에서 표피를 분리하기 위해 디스파스로 소화되며, 그 후 표피는 트립신으로 소화되어 멜라노세포와 각질 세포가 함유된 현탁액을 생성하며, 이는 다른 미디어에서 선택적으로 재배될 수 있다. 현재, 초기 배양은 일반적으로 멜라닌세포가 기존의 방법을 사용하여 합류에 도달하는 데 약 3~4주가 걸리며, 이는 그들의 격리효율이 낮기 때문일 가능성이 높다. 따라서 성인 피부 조직에서 멜라닌 세포의 초기 생산을 증가 실험실 연구 및 임상 응용 모두에 대 한 매우 도움이 될 것 이다.
많은 성장 인자, 대부분은 각질 세포에 의해 분비되는 것으로 나타났다 (예를 들어, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF 및 SCF)5-8,포유류 멜라노사이클의 분화 및 확산을 조절. 피더 층이 없는 경우, 이러한 성장 인자의 부족은 멜라닌세포의 증식 감소와 세포멸 감소9로이어집니다. 피더 세포와 멜라닌세포로 각질 세포의 공동 배양은 멜라닌세포 증식을 가속화하고 세포멸을 감소시킬 수 있다. 그러나, 공동 배양 방법은 실용적이지 않은 각질 세포를 준비하기 위해 더 많은 피부 조직을 요구할 뿐만 아니라 멜라노세포에 요구되는 배양 조건이 각질 세포 성장을 선호하지 않기 때문에 효율적으로 작동할 수 없으며, 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
이전 연구는 Y-27632의 추가, ROCK 억제제, 성장 배지에 피부 조직에서 인간의 일차 표피 세포의 수율을 향상시킬 수 있다고 보고10-14. 따라서, 인간 1 차적인 멜라닌세포의 격리가 Y-27632의 존재에서 유익할 지 여부를 시험하는 것이 흥미로할 것입니다. 실제로, Y-27632를 접종 TIVA배지(15)에첨가하여 TPA, IBMX, Na3VO4 및 dbcAMP를 함유하고 있으며, 초기 배양에서 포피 조직으로부터 분리된 1차 멜라닌세포의 수율을 크게증가시켰다(16). 종래의 프로토콜에 비해, 이 새로운 프로토콜은멜라닌세포(16)의수율을 높이는 데 훨씬 더 효율적입니다. 따라서, 본 프로토콜은 기초및 적용된 생물학적 연구에서 적용을 촉진하기 위해 이전 연구16을 기반으로 성인 피부 조직을 사용하여 새로운 방법을 자세히 설명합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 프로토콜에서 성인 포피 티슈의 사용은 인간 연구 윤리위원회 (No.2015120401, 날짜 : 2015년 5월 12일)에 의해 승인되었습니다.
참고: 세포와 배양물의 오염을 방지하기 위해 멸균 환경에서 다음 모든 절차를 수행합니다.
1. 준비
- 10mL의 인산염 완충식염(PBS)을 포함하는 15mL 튜브에서 할례 수술로부터 신선한 성인 포피피 조직을 수집하고 4°C에 보관하십시오.
참고: 절제 후 24시간 이내에 자세히 설명된 대로 조직을 분리합니다. - 시약 및 배양 매체를 준비합니다.
- 3% P/S(페니실린/연쇄절제술)를 세척 용액으로 준비합니다. 페니실린 (100 U/mL) 및 연쇄 상 미신 (100 mg/L) (P/S)의 1.5 mL와 PBS의 50 mL을 혼합.
- 효소 소화의 중화를 위해 종단 용액(중화 용액)을 준비합니다. DMEM 배지에 1% P/S, 10% 태아 소 혈청(FBS)을 보충합니다.
- 배양 멜라닌세포에 TIVA 배지 준비: 햄의 F12; 10% FBS; 1x P⁄S⁄글루타민; 50 ng/mL 12-O-테트레이드카노일 코르볼-13-아세테이트(TPA); 1 x 10-4 M 3-이소부틸-1-메틸 자칸틴 (IBMX); 1 μM Na3VO4; 1 x 10-3 M N-6,2′-O-dibutyryladenosine-3′,5′-순환 단인산염 (dbcAMP).
2. 종래의 방법
- 피부 조직 전처리
- 각 성인 포피부 조직을 30초 동안 75%의 에탄올(알코올)으로 10mL로 한 번 헹구고, 10mL의 세탁용액(3%P/S)으로 두 번 헹구고, 각각 5분간 헹구는다.
참고 : 혈액이 많은 경우 처음에 PBS의 10 mL로 포피 조직을 씻어. 모든 세정은 100mm 세포 배양 접시에 제조됩니다. - 100mm 세포 배양 접시의 표지에 피하 지방 조직과 느슨한 결합 조직을 제거하기 위해 수술 블레이드로 각 포피 킨 조직을 긁어.
참고: 얇은 표피와 조밀한 진피만 남을 때까지 메스를 사용하여 지방 층을 긁어냅니다. - 각 성인 포피를 진피 쪽으로 100mm 배양 접시에 옮길 수 있습니다.
참고: 각 성인 포피부 조직을 메스 블레이드를 사용하여 3-4mm 너비의 스트립으로 잘라 내어 디스파가 보다 효율적으로 작동하도록 합니다. - 성인 포피 티슈와 함께 각 100mm 배양 접시에 2.5 mg/mL 디스파를 넣고 4°C에서 16~20시간 동안 배양합니다.
참고: 각 티슈 그램은 10mL의 디스파제 용액으로 소화됩니다.
- 각 성인 포피부 조직을 30초 동안 75%의 에탄올(알코올)으로 10mL로 한 번 헹구고, 10mL의 세탁용액(3%P/S)으로 두 번 헹구고, 각각 5분간 헹구는다.
- 성인 포피 티슈로부터 표피의 분리
- 16~20시간 동안 소화후 핀셋을 사용하여 진피로부터 표피를 분리한다. 하나의 트위저와 다른 트위저와 표피 부분의 해당 위치와 조직의 진피 가장자리의 한쪽을 잡고 부드럽게 표피를 벗겨.
- 표피를 세척 용액(3% P/S)으로 3배 세척한 다음 표피를 튜브로 옮겨 넣습니다.
- 튜브에 0.05% 트립신의 5mL을 추가하여 표피를 잠수하고 37 °C에서 30 분 동안 수조에 배양하십시오.
참고: 튜브를 흔들어 배양 전에 표피가 완전히 잠겼을 수 있도록 합니다.
- 1차 세포의 수집 및 배양
- 동일한 양의 종단 용액(10% FBS, DMEM의 1% P/S)을 추가하여 트립신과 파이펫을 10-15배 위아래로 중화하여 표피 세포를 분리합니다.
- 100 μm 메쉬 필터를 통해 새로운 50mL 튜브에 셀 서스펜션을 전달하여 이물질을 제거합니다.
- 원심 분리기 200 x g에서 5 분 동안.
- 상체를 제거하고 세포를 다시 중단하기 위해 접종 TIVA 배지10mL를 추가합니다.
- 다시 매달린 세포를 100mm 배양 접시에 넣습니다.
- 5 % CO2와37 ° C 인큐베이터에서 배양 .
- 매 2일마다 배지를 변경합니다.
- 통로 세포는 80%의 합류에 도달할 때입니다.
3. 새로운 방법
참고: 새로운 방법에서 조직 제제 및 소화를 위한 절차는 종래의 방법에 대해 상술한 바와 동일하며, 유일한 차이점은 고립된 신선한 세포가 10μM Y-27632를 함유하는 TIVA 배지의 10mL에서 재장주된다는 것입니다.
- 시드 후 이틀 후, Y-27632없이 일반 TIVA 매체로 미디어를 교체하십시오. 그 후, 배양 조건은 새로운 방법과 종래의 방법 사이에 동일하다.
4. 세포 패시징
- TIVA 매체를 제거하고 PBS로 각 문화 요리를 두 번 헹구는 다.
- 100mm 세포 배양 접시당 2mL의 0.05%의 트립신을 추가합니다.
참고: 소화 효소와 접시 바닥 사이의 적절한 접촉을 보장하기 위해 접시를 흔들어. - 37°C 인큐베이터에서 2분 동안 소화합니다.
- 현미경을 사용하여 세포를 확인하고 대부분의 세포가 세포 배양 접시에서 분리되었는지 확인하십시오.
참고: 접시를 부드럽게 탭하여 세포를 풀어 주어 용액에 떠 있습니다. 대부분의 세포가 도청 후 중단되지 않았지만 5 분 이상 중단하지 않으면 소화 시간을 연장하십시오. - 멜라닌세포는 2mL의 종단용 용액을 추가하여 트립신 활성을 중화한 후 15mL 튜브로 전송한다. 원심 분리기 200 x g에서 5 분 동안.
- 체퍼를 천천히 제거한 후 TIVA 배지의 10mL로 각 세포 펠릿을 다시 중단하고 멜라닌세포의 수를 계산합니다.
- 100mm 세포 배양 접시당 TIVA 배지 10mL에서 약 1 x 106 멜라닌세포플레이트를 플레이트.
- 세포 배양 배지를 매 48시간마다 갱신한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
도 1은 종래와 새 방법을 비교하는 회로도를 나타낸다. 새로운 방법을 이용한 조직 제제 및 소화 절차는 종래의 방법에 대한 절차와 동일하며, 유일한 차이점은 10 μM Y-27632의 존재시 TIVA 배지의 10mL에서 분리된 세포가 재주중단된다는 것입니다. 시드 후 이틀 후, Y-27632없이 일반 TIVA 매체로 미디어를 교체하십시오. 피부 조직에서 1 차적인 melanocytes를 격리하는 전통적인 방법은 일반적으로 통과하기 위하여 충분한 수에서 증가하는 멜라닌세포에 대한 대략 3 4 주가 요구합니다, 그러나 더 중요한 것은, 조직은 일반적으로 신생아에게서 와서 성인 피부 조직에서 1 차적인 melanocytes를 분리하는 것은 아주 어렵습니다. 그러나, 새로운 방법을 이용하여, 성인 조직으로부터의 멜라닌세포는 종래의 방법을 사용하여 분리된 멜라닌세포보다 훨씬 큰 수로 관찰된다. 현미경 보기는 종래의 방법 및 새로운방법(도 2A)을이용하여 성인 피부 조직으로부터 멜라닌세포를 분리할 때 3일, 6, 8일에 취하였다. 이러한 현미경 보기에서, 새로운 방법은 6 일과 8일에 멜라닌세포의 수율을 크게 증가시켰습니다. 멜라노세포 수치는 3일, 6, 8일에 적어도 10개의 다른 현미경 필드를 계산하여 정량화되었다. 그 결과 새로운 방법을 사용하여 분리된 멜라닌세포의 수가 6일과 8일(도2B)에서종래의 방법을 사용하여 분리된 멜라닌세포의 수보다 훨씬 높은 것으로 나타났다. 8일간의 배양 후, 멜라닌세포는 트립신을 사용하여 수확한 다음, 각 100mm 접시에 자동 세포 카운터로 계산되어 새로운 방법으로 멜라닌세포 수율을 약 5배 증가시켰다(그림2C). 9일째, 합격 후 하루 만에 찍은 현미경 보기는, Ki67염색(그림 2E)에의해 확인된 통과된 멜라닌세포가 정상적으로 증식하는 것으로 나타났다.Figure 2D
격리 후 초기 배양 시 Y-27632에 의한 멜라닌세포의 향상된 수율은 이전간행물(16)에서각질세포의 규제를 통해 나타났다. 도 3에도시된 바와 같이, Y-27632는 통과된 멜라닌세포(도 3A-B)의성장 및 증식을 증가시키지 않았으며 멜라노세포(도3Figure 3C-D)의세포멸을 억제하지 않았다. 그러나 Y-27632는 각질세포 부착(도3E-H)을크게 증가시켰으며 멜라노세포 배양 TIVA 배지에서 생존(그림3I)을촉진하였다. Y-27632 또는 Y-27632 처리된 각질 세포로부터 유래된 조건제 배지의 존재하에 각질세포와 공동 배양하면 멜라노세포(그림3J)의성장을 크게 향상시킬 수 있다.
새로운 방법을 사용하여 분리된 멜라닌세포의 특징을 더욱 특성화하기 위해, 특정 멜라닌세포 마커인 MITF는 면역형광(IF)을 사용하여 초기 통과 후 멜라닌세포의 순도를 검사하였다. 도 4A는 1번 통로에서 MITF를 발현하는 세포의 비율이 거의 100%에 달하는 것을 나타내며, 이는 종래의 방법과 유사한 새로운 방법에 의해 첫 번째 통로 후에 순수한 멜라닌세포가 얻어졌다는 것을 나타낸다. 새로운 방법을 사용하여 분리된 멜라닌세포가 정상적으로 작동할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 그들은 체외에서 2일 동안 산림(FSK)으로 처리되어 멜라닌세포의 색소침착 수준을 유도하였다(도4B). 종합하면, 이러한 데이터는 새로운 방법을 사용하여 분리된 멜라닌세포가 정상적으로 기능할 수 있고 안료를 생성할 수 있음을 시사한다.
그림 1: 새로운 방법과 종래의 방법의 비교. 이 방식은 기존의 메서드와 새 격리 방법을 비교하는 것을 보여 주어 있다. 유일한 차이점은 10 μM Y-27632의 존재에 있는 TIVA 배지의 10 mL에서 격리된 신선한 세포가 재장중단된다는 것입니다. 시드 후 2일 후, 배지는 Y-27632 없이 일반 TIVA 배지로 대체된다. 새로운 방법은 일반적으로 8일째경에 통과에 적합한 멜라닌세포의 밀도를 달성하는 반면, 종래의 방법은 일반적으로 통과를 위한 충분한 수의 멜라닌세포 수를 증가시키는 데 약 20일이 걸립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 새로운 절연 방법은 1차 멜라닌세포의 생산을 증가시킨다. (A)종래의 방법(위쪽 행)에 의해 제조된 멜라닌세포의 대표적인 이미지와 초기 접종 후 3일, 6일 및 8일에 새로운 방법(아래줄)에 의해 제조된다. (b)종래의 방법을 이용하여 제조된 멜라닌세포 수의 정량화는 3일, 6일 및 8일에 적어도 10개의 상이한 현미경 필드(cell number/vision)에서 멜라닌세포 수를 계산하여 새로운 방법. 모든 실험은 삼중에서 수행되었고 결과는 현미경 필드당 평균 세포 수로 표현된다. (C)8일 동안 배양후, 멜라닌세포는 트립신을 사용하여 수확되었고, 종래의 방법을 이용하여 제조된 멜라닌세포의 수와 새로운 방법은 세포계판을 이용하여 계산하였다. 세포의 수는 삼중 실험에서 계산되었고, 결과는 100mm 접시 당 세포의 평균 수를 나타낸다. (D)자동화된 세포 카운터를 이용한 멜라닌세포의 수를 계산한 후, 종래의 방법을 사용하여 제조된 멜라닌세포 또는 새로운 방법으로 종래의 식기및 현미경 사진들이 9일째에 촬영하였다. (E)0통로 또는 통로 1에서 새로운 방법을 사용하여 분리된 멜라닌세포는 Ki67 항체(red) 및 DAPI(핵, 청색)로 고정 및 염색하였다. (B-C),학생의 t-test는새로운 방법과 종래의 방법 사이의 차이를 분석하는 데 사용되었다, ** P & 0.01, ***P < 0.005. 모든 축척 막대는 100 μm을 나타냅니다.
그림 3: Y-27632는 각질 세포의 조절을 통해 멜라닌세포 성장을 향상시킵니다. (A)순수 멜라닌세포(passage 3)는 12, 24, 48, 60h에 대해 10 μM Y-27632로 처리되었고, 멜라닌세포의 수는 CCK-8 분석에 의해 분석되었다. (B)순수 멜라닌세포(통로 3)는 48h에 대해 10μM Y-27632로 처리한 다음 Ki67 염색을 위해 고정하였다. DAPI 핵 염색으로 표시된 총 살아있는 세포 중 Ki67 양성 세포의 백분율의 정량화. (C-D) 순수 멜라노세포(passage 3)는 48시간 동안 10μM Y-27632로 처리된 다음, 부속서 V-FITC및 프로피듐 요오드제를 함유한 세포에 대해 염색한 후 FACS분석(C)또는 TUNEL 분석용으로 고정하였다. (E)트립신 소화 후 분리된 표피는 Y-27632(10μM) 유무에 관계없이 TIVA 배지로 도금되었고 2일 후 각질세포의 면역형광 분석(pan-ck)으로 수행되었다. (F)Y-27632 처리 및 대조식 접시내각질세포의 정량화(E)총 500개의 세포에서 각질 세포의 백분율로 계산하였다. (G)순수한 통로 3 각질 세포는 Y-27632 (10 μM)의 유무에 관계없이 TIVA 배지에서 시드하였다. 표피 세포의 이미지는 시드 후 하루에 표시됩니다. (H)Y-27632 처리 및 대조식 접시에 부착된 각질 세포의 정량화(G)를총 5000개의 세포에서 부착된 세포의 백분율로 시드하였다. (I)순수한 통로 3 각질세포는 Y-27632의 존재 또는 부재에서 TIVA 배지로 도금하였다. 현미경 이미지는 24h에서 수득하였다.(J)좌측 패널: 순수 통로 3멜라닌세포의 동일한 숫자는 TIVA 배지로 도금되었다 4개의 그룹으로 추가된 바와 같이: 1) Y-27632 (10 μM) 단독으로 (Y), 2) 통로 3 각질 세포단독, 3) 각질 세포 및 Y-27632 (10 μM) 및 Y-27632 (10 μM) 및 Y-27632 (10 μM) 및 Y-27632 (10 μM) 및 Y-27632 (10 μM) 및 (10 μM) (10 μM) 및 Y-27632 (10 μM) 및 Y-27632 (10 μM) 및 Y-27632 (10 μM) 및 Y-27632 (10 μM) 및 Y-27632 (10 μM) 및 Y-27632 (10 μM) 및 Y-27632 (10 μM) 및 Y-27632 (10 μM) 및 Y-27632 (10 μM) 및 (10 μM) 및 Y-27632 (10 μM) 및 Y-27632 (10 μM) 및 음의 (10 μM) 및 Y-27 음극대조군과 비교하여 멜라닌세포 증식의 상대적인 접이식 변화는 도금 후 24h 및 48h에서 멜라닌세포의 수를 계산하여 결정되었다. 오른쪽 패널: 조건부 TIVA 배지는 도금 후 48h에서 4개의 통과 3멜라닌세포 배양(왼쪽 패널)에서 얻어졌다. 이어서, 동일한 수의 통과 3 멜라닌세포는 각각 4그룹으로 도금되었고, 각각 조건부 미디어 중 하나를 가진 다. 음극대조군과 비교하여 멜라닌세포 증식의 상대적인 접이식 변화는 도금 후 24h 및 48h에서 멜라닌세포의 수를 계산하여 결정되었다. (A-J) 모든 실험은 3회 반복되었습니다, * p&0.05, **p<0.01, ***p<0.005.p 이미지의 모든 막대는 100 μm을 나타냅니다. 그림은 Mi 외16에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 새로운 방법을 사용하여 분리된 멜라닌세포의 특성화. (A)새로운 또는 종래의 방법을 사용하여 제조된 멜라닌세포에서 MITF(red)의 면역형염색의 대표적인 이미지. DAPI 얼룩 핵 (파란색). (B)세포 펠릿은 새로운 방법을 사용하여 제조된 멜라닌세포로부터 수집되었고, 포스콜린(FSK) 또는 DMSO 차량으로 2일 동안 대조군(con)으로 처리하였다. 모든 축척 막대는 100 μm을 나타냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 최근 간행물16을기반으로 했습니다. 새로운 방법으로 최상의 결과를 얻으려면 다음 중요한 단계에 주의를 기울여야 합니다. 첫째, 표피와 진피의 성공적인 분리가 중요합니다. 성인 포피 조직을 메스 블레이드를 사용하여 3-4mm 너비의 스트립으로 잘라 내어 디스파가 더 철저하고 쉽게 변미에서 표피를 분리할 수 있도록 합니다. 둘째, 이 두 층을 분리할 때, 진피 섬유아세포도 멜라닌세포 배양 배지에서 자랄 수 있기 때문에 진피의 오염을 피해야 한다. 셋째, 트립신 소화 단계는 30분 미만이어야 합니다. 그렇지 않으면 격리 된 세포의 생존가능성을 크게 감소시다.
이 새로운 방법은 멜라닌세포 격리에 필요한 시간을 크게 단축시합니다. 인간의 표피 멜라닌 세포는 태양 조사 손상으로부터 피부를 보호하는 멜라닌을 생성합니다. 아이싱거와 마르코는 표피5로부터인간의 멜라닌세포 배양에 대한 최초의 실용적인 방법을 제안했다. 가장 중요한 것은, 일반적으로 사용된 조직은 일반적으로 신생아에게서 온 고 성인 피부 조직에서 1 차적인 melanocytes를 분리하는 것은 아주 어렵습니다. Rho-관련 단백질 키나아제 억제제 Y-27632는 표피 줄기 세포 격리11-13의효율을현저히 향상시킵니다. 또한, 우리는 또한 Y-2763210,11의존재에 있는 피부 조직에서 인간 1 차성 표피 세포를 격리하는 방법을보고했습니다. 이 프로토콜에서, Y-27632는 1차 멜라닌세포의 수율을 효율적으로 증가시키는 것으로 나타났다. 종래의 방법을 사용하면 세포 회수율이 낮고 멜라닌세포가 충분한 수로 자라기 위해서는 약 3~4주의 배양이 필요하다. Y-27632가 TIVA 성장 배지에 첨가되는 이 새로운 방법은 멜라닌세포 수율을 약 5배 증가시키고, 얻어진 멜라닌세포는 정상적으로 증식할 수 있다. 또한 상용 매체를 사용하여 새로운 방법을 테스트하고 유사한 결과를 발견했습니다. 관련 메커니즘에 관하여, 최근 연구는 멜라닌세포 절연의 효율성을 향상시키기 위하여 Y-27632의 효력이 주로각질세포(16)를통해 서 발생한다는 것을 보여주었다.
중요한 것은, 새로운 방법을 사용하여 정상 기능을 가진 순수 멜라닌세포를 얻었다. 통로 1(P1) 멜라닌세포는 거의 모두 MITF 발현에 얼룩져 순수한 멜라닌세포가 첫 번째 통로 후에 얻어진다는 것을 나타낸다. 높은 성장 잠재력을 가진 1 차적인 멜라닌세포는 생물학 연구 및 임상 응용을 위해 아주 중요합니다. 새로운 방법을 사용하여 분리된 흑색세포는 포스콜린을 사용한 치료 후 안료에 유도될 수 있으며, 이러한 흑색세포가 정상적으로 기능할 수 있음을 나타내는 아데닐레이트 사이클라제의 활성제로서, 색소 침착 결함 및흑색종(14)을연구하는 데 유용할 것이다.
요약하자면, 성인 피부 조직에서 1차 멜라닌세포를 분리하는 매우 효율적인 방법이 성공적으로 확립되었습니다. 이 향상된 방법은 생물학 연구 및 임상 응용을 위한 급속한 방식으로 멜라닌세포의 충분한 수를 제공하는 데 기여할 수 있었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
모든 저자는 충돌에 대한 이해가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2017YFA0104604), 중국 국립 자연 과학 재단의 일반 프로그램 (81772093), 군사 물류 연구 프로젝트 (AWS17J005), 산동성 자연 과학 재단 (ZR2019ZD33)의 주요 프로그램에 의해 지원되었습니다. 6) 산동성 의 주요 연구 개발 프로그램 (2019GSF108107) X.W. 광동 기본 및 응용 기본 연구 재단 (2019A1515110833) 및 산동대학의 기초 연구 기금 (2019GN043)에 J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
- Costin, G. E., Hearing, V. J. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).
- Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P.
- Eisinger, M., Marko, O. Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).
- Hirobe, T. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).
- Halaban, R., et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).
- Kunisada, T., et al. Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis. Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).
- Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor. Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Yokoyama, S., et al. Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage. Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).
- Mi, J., et al. A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).
