Summary
Dit document meldt dat de toevoeging van Y-27632 aan TIVA medium de opbrengst van melanocyten uit volwassen huidweefsels aanzienlijk kan verhogen.
Abstract
De isolatie en cultuur van primaire melanocyten uit huidweefsels is zeer belangrijk voor biologisch onderzoek en is op grote schaal gebruikt voor klinische toepassingen. Het isoleren van primaire melanocyten van huidweefsels volgens de conventionele methode duurt meestal ongeveer 3 tot 4 weken om voldoende te passeren. Wat nog belangrijker is, de gebruikte weefsels zijn meestal pasgeboren foreskins en het is nog steeds een uitdaging om efficiënt te isoleren primaire melanocyten van volwassen weefsels. We hebben onlangs een nieuwe isolatiemethode voor melanocyten ontwikkeld die Y-27632, een Rho kinase-remmer, toevoegt aan het oorspronkelijke kweekmedium voor 48 uur. Vergeleken met het conventionele protocol verhoogt deze nieuwe methode de opbrengst van melanocyten drastisch en verkort het de tijd die nodig is om melanocyten te isoleren van voorhuidweefsels. We beschrijven deze nieuwe methode nu in meer detail met behulp van volwassen opperhuid om efficiënt te cultuur primaire melanocyten. Belangrijk is dat we aantonen dat melanocyten verkregen uit volwassen weefsels bereid door deze nieuwe methode normaal kunnen functioneren. Dit nieuwe protocol zal aanzienlijk ten goede komen aan studies van pigmentatiedefecten en melanomen met behulp van primaire melanocyten bereid uit gemakkelijk toegankelijke volwassen huidweefsels.
Introduction
Het doel van deze studie was om een eenvoudig en effectief protocol te ontwikkelen om melanocyten te isoleren van de opperhuid van volwassen huid voor biologisch onderzoek en klinische toepassingen. Melanocyten, die zich bevinden in de basale opperhuid van de huid en in haarzakjes, spelen een belangrijke rol bij de pigmentatie van de huid en het haar door melanine1te produceren. De resulterende huidpigmentatie van epidermale melanocyten fungeert als een ultraviolet stralingsfilter dat DNA-schade aan onderliggende cellen in de huid vermindert/voorkomt2. De abnormale proliferatie van melanocyten in de huid is heel gebruikelijk, zoals in de vorming van goedaardige nevi (moedervlekken) waarbij melanocyten mogelijk transformeren tot oncogene groei, gevolgd door cellulaire senescentie3.
Sinds 1957 is het isolement en de daaropvolgende cultuur van menselijke primaire melanocyten mogelijk4, maar pas sinds 1982 is er een efficiënte methode die reproduceibly culturen van menselijke melanocyten kan vestigen uit de opperhuid5. De conventionele methode om primaire melanocyten te isoleren van de opperhuid omvat een tweestapszymatische spijsvertering. Kortom, de huid wordt in eerste instantie verteerd met dispase om de opperhuid van de dermis te scheiden, waarna de opperhuid wordt verteerd met trypsine om suspensieën met melanocyten en keratinocyten te produceren, die vervolgens selectief kunnen worden gekweekt in verschillende media. Momenteel duurt de initiële cultuur meestal ongeveer 3 tot 4 weken voordat melanocyten samenvloeiing bereiken met behulp van de conventionele methode, wat waarschijnlijk te wijten is aan de lage efficiëntie van hun isolatie. Daarom zou het verhogen van de initiële productie van melanocyten uit volwassen huidweefsels heel nuttig zijn voor zowel laboratoriumonderzoek als klinische toepassingen.
Veel groeifactoren, waarvan de meeste zijn aangetoond dat ze worden afgescheiden door keratinocyten (bijvoorbeeld α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF en SCF)5-8, reguleren de differentiatie en proliferatie van zoogdiermeloolieten. Bij afwezigheid van feederlagen leidt het ontbreken van deze groeifactoren tot de verminderde proliferatie van melanocyten en hun verhoogde apoptose9. De co-cultuur van keratinocyten als feedercellen en melanocyten zou kunnen leiden tot versnelde melanocytenproliferatie en verminderde apoptose. Echter, de co-cultuur methode vereist niet alleen meer huidweefsels voor te bereiden keratinocyten, die niet praktisch is, maar ook niet efficiënt zou kunnen werken, omdat de cultuur voorwaarden vereist door melanocyten niet voorstander van keratinocyten groei, en vice versa.
Eerdere studies hebben gemeld dat de toevoeging van Y-27632, een ROCK-remmer, in het groeimedium de opbrengst van menselijke primaire epidermale cellen uit huidweefsels10-14kan verbeteren. Daarom zou het interessant zijn om te testen of de isolatie van menselijke primaire melanocyten zou profiteren van de aanwezigheid van Y-27632. De toevoeging van Y-27632 in het inentings TIVA medium15, dat TPA, IBMX, Na3VO4 en dbcAMP bevat, verhoogde de opbrengst van primaire melanocyten geïsoleerd uit voorhuidweefsels in de oorspronkelijke culturen16. In vergelijking met het conventionele protocol is dit nieuwe protocol aanzienlijk efficiënter in het verhogen van de opbrengst van melanocyten16. Daarom beschrijft dit protocol de nieuwe methode in detail met behulp van volwassen huidweefsels op basis van een eerdere studie16 om de toepassing ervan in fundamenteel en toegepast biologisch onderzoek te bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van volwassen voorhuidweefsels in dit protocol is goedgekeurd door de Human Research Ethics Committee (no.2015120401, datum: 12 mei 2015).
OPMERKING: Voer alle volgende procedures uit in een steriele omgeving om verontreinigingen van cellen en culturen te voorkomen.
1. Voorbereidingen
- Verzamel verse volwassen voorhuidweefsels van besnijdenisoperaties in 15 mL-buizen met 10 mL fosfaatbuffersoutline (PBS) en bewaar in 4 °C.
OPMERKING: Scheid de onderstaande weefsels binnen 24 uur na hun excisie. - Bereid reagentia en cultuurmedium voor.
- Bereid 3% P/S (penicilline/streptomycine) voor als wasoplossing. Meng 50 mL PBS met 1,5 mL penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 mg/L) (P/S).
- Bereid de beëindigingsoplossing (neutralisatieoplossing) voor op neutralisatie van enzymatische spijsvertering. Supplement 1% P/S, 10% foetaal runderserum (FBS) in DMEM medium.
- Bereid TIVA medium to culture melanocyten voor: Ham's F12; 10% FBS; 1x P·S·glutamine; 50 ng/mL 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetaat (TPA); 1 x 10-4 M 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX); 1 μM Na3VO4; 1 x 10-3 M N-6,2′-O-dibutyryladenosine-3′,5′-cyclisch monofosfaat (dbcAMP).
2.
- Voorbehandeling van huidweefsel
- Spoel elk volwassen voorhuidweefsel één keer met 10 mL ethanol (alcohol) gedurende 30 s en spoel vervolgens twee keer af met 10 mL wasoplossing (3% P/S), gedurende 5 minuten per stuk.
OPMERKING: Was voorhuidweefsels met 10 mL PBS in het begin als er veel bloed is. Alle wasbeurten worden bereid in 100 mm celkweekgerechten. - Schraap elk voorhuidweefsel met een chirurgisch mes om onderhuidse vetweefsels en losse bindweefsels te verwijderen in de cover van een 100 mm celkweekschaal.
OPMERKING: Gebruik een scalpel om de vetlagen weg te schrapen totdat alleen de dunne opperhuid en de dichte dermis overblijven. - Breng elke volwassen voorhuid in nog een 100 mm cultuur schotel met de dermis kant naar beneden.
OPMERKING: Snijd elk volwassen voorhuidweefsel in 3-4 mm brede stroken met behulp van een scalpelblad om de dispase efficiënter te laten werken. - Voeg 2,5 mg/mL dispase toe aan elk schaaltje van 100 mm met volwassen voorhuidweefsels en incubeer gedurende 16 tot 20 uur bij 4 °C.
LET OP: Elke gram weefsel wordt verteerd met 10 mL dispase oplossing.
- Spoel elk volwassen voorhuidweefsel één keer met 10 mL ethanol (alcohol) gedurende 30 s en spoel vervolgens twee keer af met 10 mL wasoplossing (3% P/S), gedurende 5 minuten per stuk.
- Scheiding van de opperhuid van het volwassen voorhuidweefsel
- Na de spijsvertering voor 16 tot 20 uur, scheiden van de opperhuid van de dermis met behulp van pincet. Pak de ene kant van de huidrand van het weefsel met een pincet en de overeenkomstige positie van het opperhuiddeel met een ander pincet en pel voorzichtig de opperhuid af.
- Was de opperhuid 3x met wasoplossing (3% P/S) en breng de opperhuid in een buis.
- Dompel de opperhuid onder door 5 mL van 0,05% trypsine in de buis toe te voegen en 30 minuten in een waterbad bij 37 °C in te broeden.
OPMERKING: Schud de buis om ervoor te zorgen dat de opperhuid volledig onder water staat voor incubatie.
- Verzameling en cultuur van primaire cellen
- Voeg een gelijk volume van de beëindiging oplossing (10% FBS, 1% P / S in DMEM) om de trypsine te neutraliseren en pipette de oplossing op en neer 10-15 keer om de epidermale cellen te scheiden.
- Geef de celopening door in een nieuwe buis van 50 mL via een 100 μm mesh filter om vuil te verwijderen.
- Centrifuge op 200 x g gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant en voeg 10 mL inenting tiva medium toe om de cellen opnieuw op te hoogten.
- Zaad de geresuspended cellen in een 100 mm kweekschotel.
- Cultuur in een incubator van 37°C met 5% CO2.
- Verander het medium om de 2 dagen.
- Passagecellen wanneer ze 80% samenvloeiing bereiken.
3.
OPMERKING: De procedure voor weefselbereiding en -vertering in de nieuwe methode is dezelfde als hierboven beschreven voor de conventionele methode, het enige verschil is dat de geïsoleerde verse cellen opnieuw worden opgetrokken in 10 mL TIVA-medium met 10 μM Y-27632.
- Twee dagen na het zaaien, vervang de media met normale TIVA medium zonder Y-27632. Daarna zijn de cultuuromstandigheden hetzelfde tussen de nieuwe en de conventionele methoden.
4. Celdoorgang
- Verwijder het TIVA medium en spoel elk kweekschotel twee keer af met PBS.
- Voeg 2 mL van 0,05% trypsine per 100 mm cel kweekschotel.
LET OP: Schud de schotel om voldoende contact tussen spijsverteringsenzymen en de onderkant van de schotel te garanderen. - Verteren in een 37 °C incubator gedurende 2 min.
- Gebruik een microscoop om de cellen te controleren, en zorg ervoor dat de meeste cellen hebben gescheiden van de cel cultuur schotel.
LET OP: Tik voorzichtig op de schotel om de cellen los te maken om naar boven te komen en in de oplossing te zweven. Verleng de spijsverteringstijd als de meeste cellen niet opschorten na het tikken, maar niet meer dan 5 min. - Breng de melanocyten over in een buis van 15 mL na het neutraliseren van de trypsineactiviteit door 2 mL beëindigingsoplossing toe te voegen. Centrifuge op 200 x g gedurende 5 minuten.
- Resuspend elke celpellet met 10 mL TIVA-medium na het langzaam verwijderen van de supernatant, en tel vervolgens het aantal melanocyten.
- Plaat ongeveer 1 x 106 melanocyten in 10 mL TIVA medium per 100 mm celkweekschotel.
- Vernieuw het celkweekmedium om de 48 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een schematisch diagram waarin de conventionele en de nieuwe methoden worden vergeleken. De procedure voor weefselbereiding en -vertering met de nieuwe methode is dezelfde als de procedure voor de conventionele methode, het enige verschil is dat de geïsoleerde cellen opnieuw worden opgetrokken in 10 mL TIVA-medium in aanwezigheid van 10 μM Y-27632. Twee dagen na het zaaien, vervang de media met normale TIVA medium zonder Y-27632. De conventionele methode voor het isoleren van primaire melanocyten uit huidweefsels vereist meestal ongeveer 3 tot 4 weken voor melanocyten om te groeien in voldoende aantallen naar passage, maar nog belangrijker, de weefsels komen meestal van pasgeboren baby's en het is zeer moeilijk om primaire melanocyten te isoleren van volwassen huidweefsels. Echter, met behulp van de nieuwe methode, melanocyten uit volwassen weefsels worden waargenomen in aanzienlijk grotere aantallen dan melanocyten geïsoleerd met behulp van de conventionele methode. Microscopische opvattingen werden genomen op dagen 3, 6 en 8 bij het isoleren van de melanocyten van volwassen huidweefsel met behulp van de conventionele methode en de nieuwe methode (figuur 2A). In deze microscopische weergaven verhoogde de nieuwe methode de opbrengst van melanocyten op dag 6 en 8 aanzienlijk. Melanocytennummers werden vervolgens gekwantificeerd door ten minste 10 verschillende microscopische velden te tellen op dag 3, 6 en 8. Uit de resultaten bleek dat het aantal melanocyten dat is geïsoleerd met behulp van de nieuwe methode veel hoger is dan het aantal melanocyten dat is geïsoleerd met behulp van de conventionele methode op de dagen 6 en 8 (figuur 2B). Na 8 dagen van cultuur, de melanocyten werden geoogst met behulp van trypsine en vervolgens geteld met een geautomatiseerde cel teller in elke 100 mm schotel, waaruit bleek dat de nieuwe methode verhoogde de melanocyte opbrengst met ongeveer vijf keer (Figuur 2C). Microscopische opvattingen genomen op dag 9, een dag na passaging, bleek dat de doorgegeven melanocyten zich normaal vermenigvuldigden (Figuur 2D), die werd bevestigd door Ki67 kleuring (Figuur 2E).
De verbeterde opbrengst van melanocyten door Y-27632 tijdens de initiële cultuur na isolatie is aangetoond door de regulering van keratinocyten in een eerdere publicatie16. Zoals blijkt uit figuur 3,heeft Y-27632 de groei en proliferatie van passaged melanocyten (figuur 3A-B) niet verhoogd en de apoptose van melanocyten niet belemmerd (figuur 3C-D). Y-27632 verhoogde echter de gehechtheid van keratinocyten aanzienlijk (figuur 3E-H) en bevorderde ook het overleven ervan (figuur 3I) in de melanocyten-cultuur TIVA-media. Ofwel co-cultuur met keratinocyten in aanwezigheid van Y-27632 of het geconditioneerde medium afgeleid van Y-27632 behandelde keratinocyten kan de groei van melanocyten aanzienlijk verbeteren (Figuur 3J).
Om de geïsoleerde melanocyten verder te karakteriseren met behulp van de nieuwe methode, werd MITF, een specifieke melanocytenmarkering, geanalyseerd met behulp van immunofluorescentie (IF) kleuring om de zuiverheid van melanocyten na de eerste passaging te controleren. Figuur 4A toont aan dat het percentage cellen dat MITF uitdrukte bij passage 1 bijna 100% was, wat aangeeft dat zuivere melanocyten na de eerste passage werden verkregen door de nieuwe methode, die vergelijkbaar is met de conventionele methode. Om te testen of melanocyten geïsoleerd met behulp van de nieuwe methode normaal kan functioneren, werden ze behandeld met forskolin (FSK) gedurende 2 dagen in vitro, wat de pigmentatieniveaus van melanocyten(figuur 4B)veroorzaakte. Samen suggereren deze gegevens dat de melanocyten geïsoleerd met behulp van de nieuwe methode normaal kunnen functioneren en pigment kunnen produceren.
Figuur 1: Vergelijking van de nieuwe methode en de conventionele methode. Deze regeling toont een vergelijking van de conventionele methode met de nieuwe isolatiemethode. Het enige verschil is dat de geïsoleerde verse cellen opnieuw worden opgetrokken in 10 mL TIVA-medium in aanwezigheid van 10 μM Y-27632. Twee dagen na het zaaien wordt het medium vervangen door een normaal TIVA-medium zonder Y-27632. De nieuwe methode bereikt meestal een dichtheid van melanocyten geschikt voor passaging rond dag 8, terwijl de conventionele methode duurt meestal ongeveer 20 dagen om voldoende aantallen melanocyten groeien voor het doorgeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: De nieuwe isolatiemethode verhoogt de productie van primaire melanocyten. (A) Representatieve afbeeldingen van melanocyten die zijn bereid volgens de conventionele methode (bovenste rij) en volgens de nieuwe methode (onderste rij) op de dagen 3, 6 en 8 na de initiële inenting. (B) Kwantificering van melanocytennummers die volgens de conventionele methode en de nieuwe methode zijn opgesteld door melanocytenaantallen te tellen in ten minste 10 verschillende microscopische velden (celnummer/visie) op dag 3, 6 en 8. Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud en de resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde aantal cellen per microscopisch veld. (C) Na 8 dagen kweek werden melanocyten geoogst met trypsine en het aantal melanocyten dat volgens de conventionele methode werd bereid en de nieuwe methode werd geteld met behulp van een celtelplaat. Het aantal cellen werd berekend op basis van drievoud experimenten, en de resultaten tonen het gemiddelde aantal cellen per 100 mm schotel. (D) Na het tellen van het aantal melanocyten met behulp van een geautomatiseerde celteller, werden melanocyten die volgens de conventionele methode of de nieuwe methode zijn bereid, in nieuwe gerechten gezaaid en werden microscopische foto's genomen op dag 9. (E) Melanocyten geïsoleerd met behulp van de nieuwe methode bij passage 0 of bij passage 1 werden vastgesteld en gekleurd met Ki67 antilichaam (rood) en DAPI (kernen, blauw). (B-C), Student's t-testwerd gebruikt om verschillen tussen de nieuwe en de conventionele methode te analyseren, ** P < 0,01, ***P < 0,005. Alle schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Y-27632 verbetert de melanocytengroei door regulering van keratinocyten. (A) Zuivere melanocyten (passage 3) werden behandeld met 10 μM Y-27632 voor 12, 24, 48 en 60 h en het aantal melanocyten werd geanalyseerd door CCK-8 test. (B) Zuivere melanocyten (passage 3) werden behandeld met 10 μM Y-27632 voor 48u en vervolgens werden vastgesteld voor Ki67 vlekken. Kwantificering van percentage Ki67 positieve cellen onder de totale levende cellen aangegeven met DAPI nucleaire kleuring. (C-D) Zuivere melanocyten (passage 3) werden behandeld met 10 μM Y-27632 voor 48 uur en werden vervolgens bevlekt voor apoptotische cellen met bijlage V-FITC en propidium iodide gevolgd door FACS-analyse (C) of vastgesteld voor TUNEL-test. (E) Geïsoleerde epidermis na trypsine spijsvertering werd verguld met TIVA medium met of zonder Y-27632 (10 μM) en 2 dagen later immunofluorescentie analyse van keratinocyten werd uitgevoerd met een pan-cytokeratine antilichaam (pan-ck). (F) Kwantificering van keratinocyten in de met Y-27632 behandelde en controleschotels uit (E) als percentage keratinocyten in een totaal van 500 cellen geteld. (G) Zuivere passage 3 keratinocyten werden ingezaaid in TIVA-medium met of zonder Y-27632 (10 μM). Beelden van epidermale cellen worden getoond op een dag na het zaaien. (H) Kwantificering van bijgevoegde keratinocyten in de met Y-27632 behandelde en controleschotels van (G) als percentage aangesloten cellen in een totaal van 5000 ingezaaide cellen. (I) Pure passage 3 keratinocyten werden verguld met TIVA-medium in aanwezigheid of afwezigheid van Y-27632. De microscopische beelden werden verkregen op 24 uur (J) Linkerpaneel: Gelijke aantallen zuivere passage 3 melanocyten werden verguld met TIVA medium in 4 groepen met toevoeging(s) zoals aangegeven: 1) Y-27632 (10 1μM) alleen (Y in grafiek), 2) passage 3 keratinocyten alleen , 3) keratinocyten en Y-27632 (10 μM) (K+Y) en 4) geen toevoeging (negatieve controle, con). Relatieve vouwveranderingen in de proliferatie van melanocyten in vergelijking met de negatieve controle werden bepaald door het aantal melanocyten op 24 uur en 48 uur na beplating te tellen. Rechterpaneel: Geconditioneerde TIVA media werden verkregen uit de 4 groepen van passage 3 melanocyte culturen in (linker paneel) op 48 uur na beplating. Vervolgens werden gelijke aantallen passage 3 melanocyten verguld in 4 groepen, elk met een van de geconditioneerde media. Relatieve vouwveranderingen in de proliferatie van melanocyten in vergelijking met de negatieve controle werden bepaald door het aantal melanocyten op 24 uur en 48 uur na beplating te tellen. (A-J) Alle experimenten zijn 3 keer herhaald, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005. Alle balken in de afbeeldingen vertegenwoordigen 100 μm. Het cijfer is gewijzigd van Mi et al.16. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Karakterisering van melanocyten geïsoleerd met behulp van de nieuwe methode. (A) Representatieve beelden van immunofluorescentievlekken van MITF (rood) in melanocyten die volgens de nieuwe of de conventionele methode zijn bereid. DAPI vlekken kernen (blauw). (B) Celkorrels werden verzameld uit melanocyten die volgens de nieuwe methode werden bereid en gedurende 2 dagen werden behandeld met forskolin (FSK) of DMSO-voertuig als controle (con). Alle schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol was gebaseerd op een recente publicatie16. Er moet enige aandacht worden besteed aan de volgende kritieke stappen om met de nieuwe methode de beste resultaten te bereiken. Ten eerste is een succesvolle scheiding van de opperhuid en de dermis cruciaal. Snijd de volwassen voorhuidweefsels in 3-4 mm brede stroken met behulp van een scalpelblad om de dispase grondiger en gemakkelijker te laten werken om de opperhuid van de dermis te scheiden. Ten tweede, bij het scheiden van deze twee lagen, moet verontreiniging van de dermis worden vermeden, omdat huidfibroblasten ook kunnen groeien in melanocyten cultuurmedium. Ten derde moet de trypsine spijsvertering stap minder dan 30 min; anders zal het de levensvatbaarheid van de geïsoleerde cellen aanzienlijk verminderen.
Deze nieuwe methode verkort de tijd die nodig is voor melanocytenisolatie aanzienlijk. Menselijke epidermale melanocyten produceren melanine, die de huid beschermt tegen schade aan zonnestraling. Eisinger en Marko stelden de eerste praktische methode voor de cultuur van menselijke melanocyten van de opperhuid5. Belangrijker nog, de gebruikte weefsels komen meestal van pasgeboren baby's en het is zeer moeilijk om primaire melanocyten te isoleren van volwassen huidweefsels. De rho-geassocieerde eiwitkinaseremmer Y-27632 verbetert de efficiëntie van epidermale stamcelisolatie aanzienlijk11-13. Daarnaast rapporteerden we ook een methode voor het isoleren van menselijke primaire opperhuidcellen uit huidweefsels in aanwezigheid van Y-2763210,11. In dit protocol werd aangetoond dat Y-27632 de opbrengst van primaire melanocyten efficiënt zou verhogen. Met behulp van de conventionele methode heeft een lage cel herstelsnelheid en moet ongeveer 3 tot 4 weken cultuur voor melanocyten te groeien in voldoende aantallen naar passage. Deze nieuwe methode, waarbij Y-27632 wordt toegevoegd aan het TIVA groeimedium, verhoogde de melanocytenopbrengst met ongeveer vijf keer en de verkregen melanocyten zich normaal kunnen vermenigvuldigen. We hebben ook de nieuwe methode getest met behulp van een commercieel medium en vergelijkbare resultaten gevonden. Wat het betrokken mechanisme betreft, toonde een recente studie aan dat het effect van Y-27632 om de efficiëntie van melanocytenisolatie te verbeteren voornamelijk optreedt door keratinocyten16.
Belangrijk is dat we pure melanocyten met een normale functie verkregen met behulp van de nieuwe methode. De Passage 1 (P1) melanocyten waren bijna allemaal gekleurd voor MITF expressie wat aangeeft dat zuivere melanocyten worden verkregen na de eerste passage. Primaire melanocyten met een hoog groeipotentieel zijn erg belangrijk voor biologisch onderzoek en klinische toepassingen. De melanocyten geïsoleerd met behulp van de nieuwe methode kan worden geïnduceerd tot pigment na behandeling met forskolin, een activator van adenylaat cyclase die cyclische AMP-niveaus verhoogt, wat aangeeft dat deze melanocyten normaal kunnen functioneren, wat nuttig zal zijn voor het bestuderen van pigmentatiedefecten en melanoom14.
Samengevat werd met succes een zeer efficiënte methode opgezet om primaire melanocyten te isoleren van volwassen huidweefsels. Deze verbeterde methode zou kunnen bijdragen tot voldoende aantallen melanocyten op een snelle manier voor biologisch onderzoek en voor klinische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren geen belang van conflict.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door The National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), het Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36), het Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36), het Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36), het Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36)) en The Key Research and Development Program van de provincie Shandong (2019GSF108107) aan X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) en De Fundamentele Onderzoeksfondsen van de Shandong University (2019GN043) aan J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
- Costin, G. E., Hearing, V. J. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).
- Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P.
- Eisinger, M., Marko, O. Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).
- Hirobe, T. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).
- Halaban, R., et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).
- Kunisada, T., et al. Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis. Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).
- Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor. Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Yokoyama, S., et al. Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage. Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).
- Mi, J., et al. A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).
