Summary
Stressende livshendelser svekker kognitiv funksjon, noe som øker risikoen for psykiatriske lidelser. Denne protokollen illustrerer hvordan stress påvirker kognitiv fleksibilitet ved hjelp av et automatisert operant strategiskiftende paradigme hos mannlige og kvinnelige Sprague Dawley-rotter. Spesifikke hjerneområder som ligger til grunn for bestemt atferd diskuteres, og translasjonell relevans av resultater utforskes.
Abstract
Stress påvirker kognitiv funksjon. Hvorvidt stress forbedrer eller svekker kognitiv funksjon avhenger av flere faktorer, inkludert 1) type, intensitet og varighet av stressoren; 2) type kognitiv funksjon under studie; og 3) tidspunktet for stressoren i forhold til å lære eller utføre den kognitive oppgaven. Videre har kjønnsforskjeller mellom effekten av stress på kognitiv funksjon blitt mye dokumentert. Beskrevet her er en tilpasning av en automatisert operant strategi skiftende paradigme for å vurdere hvordan variasjoner i stress påvirker kognitiv fleksibilitet hos mannlige og kvinnelige Sprague Dawley rotter. Spesielt brukes selvbeherskelsesstress før eller etter trening i denne operantbaserte oppgaven for å undersøke hvordan stress påvirker kognitiv ytelse hos begge kjønn. Spesielle hjerneområder knyttet til hver oppgave i dette automatiserte paradigmet har vært veletablerte (dvs. medial prefrontal cortex og orbitofrontal cortex). Dette muliggjør målrettede manipulasjoner under eksperimentet eller vurdering av bestemte gener og proteiner i disse regionene etter ferdigstillelse av paradigmet. Dette paradigmet tillater også påvisning av forskjellige typer ytelsesfeil som oppstår etter stress, som hver har definert nevrale substrater. Også identifisert er distinkte kjønnsforskjeller i utholdenhetsfeil etter et gjentatt selvbeherskelsesstressparadigme. Bruken av disse teknikkene i en preklinisk modell kan avdekke hvordan stress påvirker hjernen og svekker kognisjon i psykiatriske lidelser, som posttraumatisk stresslidelse (PTSD) og stor depressiv lidelse (MDD), som viser markerte kjønnsforskjeller i utbredelse.
Introduction
Hos mennesker kan stressende livshendelser svekke kognitiv funksjon (dvs. kognitiv fleksibilitet1), som betegner evnen til å tilpasse kognitive behandlingsstrategier for å møte nye forhold i miljøet2. Svekkelse i kognisjon utfeller og forverrer mange psykiatriske lidelser, for eksempel posttraumatisk stresslidelse (PTSD) og Major Depressive Disorder (MDD)3,4. Disse lidelsene er dobbelt så utbredt hos kvinner5,6,7,8, men det biologiske grunnlaget for denne forskjellen forblir ukjent. Aspekter ved utøvende funksjon hos mennesker kan vurderes ved hjelp av Wisconsin Card Sorting Task, en demonstrasjon av kognitiv fleksibilitet2. Ytelsen i denne oppgaven er svekket hos pasienter med PTSD9 og MDD10, men det nevrale grunnlaget for denne endringen kan bare undersøkes ved hjerneavbildning11.
Fremskritt i å forstå hvordan stress påvirker hjernen har blitt gjort gjennom bruk av dyremodeller, spesielt gnagere. Ettersom kognitiv fleksibilitet påvirkes i stressrelaterte sykdommer, er det en usedvanlig relevant fenotype å undersøke hos gnagere. Til dags dato har de fleste stress nevrobiologi litteratur brukt et alternativt kognitivt fleksibilitetsparadigme (noen ganger referert til som graveoppgaven)12,13,14,15. Mens denne oppgaven har blitt grundig undersøkt, krever det mer tid og krefter av eksperimentet for å trene gnagere. Tilpasset og beskrevet her er en veletablert automatisert set-shifting protokoll16 for å vurdere kognitiv fleksibilitet hos mannlige og kvinnelige Sprague Dawley rotter ved hjelp av ulike stressmodeller17,18. Prosedyren krever minimal tilsyn av eksperimentet og gjør det mulig å teste flere rotter samtidig. I tillegg, i motsetning til andre versjoner av denne automatiserte oppgaven19, krever tilpasningen av dette paradigmet bare 3 dagers opplæring og inkluderer en effektiv programmert dataanalyse.
Hvorvidt stress forbedrer eller forringer kognitiv funksjon, avhenger av stressorens type, intensitet og varighet, samt tidspunktet for stressoren i forhold til læring eller utførelse av en kognitiv oppgave20,21. Dermed inneholder protokollen stressprosedyrer både før og etter operantopplæringen. Den undersøker også representative resultater fra stressstudier. I tillegg har hjerneregionene som ligger til grunn for bestemte aspekter ved set-shifting vært veletablerte2,16,22; Rapporten beskriver derfor også hvordan man målretter og vurderer bestemte hjerneregioner under eller etter stress- og strategiskifteprosedyrene.
Det har vært begrenset forskning på direkte undersøkelse av kjønnsforskjeller i kognitiv fleksibilitet18,23. Protokollen beskriver hvordan man 1) inkorporerer både mannlige og kvinnelige rotter i det eksperimentelle paradigmet, deretter 2) sporer østrogensykluser før og under prosedyrene hos fritt syklende kvinner. Tidligere studier har indikert at stress før operant trening kan føre til kjønnsspesifikke underskudd i kognitiv fleksibilitet hos rotter17. Spesielt viser kvinnelige rotter forstyrrelser i kognitiv fleksibilitet etter stress, mens kognitiv fleksibilitet forbedres hos hannrotter etter stress17. Interessant nok er et stort kjennetegn på stressrelaterte psykiatriske lidelser, som har en sex-partisk forekomst hos mennesker, kognitiv ufleksibilitet. Disse resultatene tyder på at kvinner kan være mer sårbare for denne typen kognitiv svikt enn menn. Bruken av disse teknikkene i dyremodeller vil belyse effekten av stress på hjernen og hvordan den svekker kognisjon hos psykiatriske lidelser hos mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrene i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Bryn Mawr College. Få IACUC eller på annen måte gjeldende forskriftsmessig godkjenning før bestilling av forsøksdyr og begynne å eksperimentere.
1. Dyreforberedelse
- Skaff mannlige og kvinnelige voksne Sprague Dawley rotter.
MERK: Rottene kan leveres før 65 dager, men ikke begynn prosedyrene før etter dette punktet for å sikre at både menn og kvinner er fullt modne. - Pair-house samme kjønn rotter så lenge som mulig, så langsiktig isolasjon er en stressor24. For matrestriksjon, singly house rotter like før operant strategi skiftende protokoll.
- Etter 1 uke med akklimatisering begynner forsiktig å håndtere rotter i 3-5 min per dag. Samle kroppsvekten til hver rotte. I tillegg, hvis interessert i å vurdere hvordan gonadale hormoner kan påvirke resultatene, samle vaginal lavage for kvinnelige rotter (beskrevet i avsnitt 2).
- Begrens (fra mat) dyr som vil bli kjørt i operant strategi skiftende paradigme minst 3 dager før treningen begynner slik at de lykkes med å lære oppgaven. Sørg for at vann alltid er fritt tilgjengelig. Skriftlige journaler bør vedlikeholdes for hvert dyr for å dokumentere daglig mat- og væskeforbruk, hydreringsstatus og eventuelle atferdsmessige og kliniske endringer som brukes som kriterier for midlertidig eller permanent fjerning av et dyr fra en protokoll (Morton 2000; NRC 2003b).
- Hvis du bruker en stressprosedyre i mer enn 3 dager før trening, juster matbegrensningen slik at den samsvarer med antall dager med stress (f.eks. 5 dagers selvbeherskelse pluss matbegrensning25).
- Hver dag leverer du 80% av det normale daglige matinntaket (dvs. 4 g mat per 100 g kroppsvekt)26. Bruk den daglige vektsamlingen for rotten for å beregne hvor mye mat som skal gi hver dag.
- Fortsett matbegrensningen gjennom opplærings- og testdagene. Men ikke plasser mat i hjemmeburet før etter at rotten har fullført trening eller testing for dagen, ellers vil de ikke bli motivert til å utføre oppgavene for en matpellets belønning. Forsikre deg om at tidspunktet for matlevering til rotter ved ferdigstillelse av oppgaven er ganske uforutsigbar, siden dette bidrar til å unngå redusert motivasjon til å utføre i operantkammeret (til fordel for bare å vente på mat i hjemmeburet etterpå).
MERK: Dyr som gjennomgår selvbeherskelsesstressparadigmet, viser ikke signifikant større vekttap enn kontroll, ubelastede personer. Imidlertid kan ulike stressprosedyrer selv indusere vekttap, noe som resulterer i at rotter får mindre mat enn ubestressede kolleger under kroppsvektbasert matbegrensning. Dette kan utgjøre en ekstra, forvirrende stressor. Hvis dette ser ut til å være tilfelle, kan du alternativt bruke en fast mengde mat gitt til hvert emne, uavhengig av vekt27.
2. Vaginal lavage
MERK: Gonadale hormoner (dvs. østrogen og progesteron) er kjent for å påvirke stressresponsen og kognisjon28,29,30. Disse hormonene svinger over østrogensyklusen til kvinnelige rotter31. Hvis du er interessert i å spore østrogensyklusen til fritt syklende kvinnelige gnagere for å korrelere med stress eller kognitive fleksibilitetsdata, samle vaginal lavage som beskrevet nedenfor. Representative data som vurderer estrous syklusstadium er ikke gitt.
- For å få vaginale lavageprøver fra kvinner, samle varmt vann i et rent beger, en glasspipette, en "lavage" lysbilde (mikroskopsklie med akrylmalingssirkler for å holde lavageprøven), og ett tomt beger.
- Fyll pipetten med en liten mengde varmt vann (~ 0,5 ml), og sett deretter spissen inn i vagina av den kvinnelige rotten (ved å løfte ved halen). Utvis det sterile vannet 2x–3x og utvis den oppsamlede væsken på en mikroskopisk sklie. Ikke overløp lavage lysbilde sirkelen.
- Utvis overflødig væske inn i det tomme begeret. Merk lavage lysbildet med rotte tall og sette prøvene fra hver rotte i den rekkefølgen så det er klart hvilken prøve som tilhører hver rotte.
- Skyll pipetten grundig ved å pipettere rent varmt vann og dispensere det inn i det "overflødige" begeret flere ganger før du fyller pipetten for å prøve neste rotte.
- Bær lavagesklien forsiktig til et brightfield-mikroskop for å avbilde lavageprøven og klassifisere dagen innenfor østrogensyklusen som beskrevet i Becker et al31.
MERK: Ideelt sett bør lavaging gjøres i noen uker for å spore en kvinnes syklus riktig og bør utføres på et veldig likt tidspunkt hver dag for å kontrollere for døgnrytme. Fortrinnsvis bør denne prosedyren utføres før stress og operant strategiskifteprosedyrer. Bruken av bomullspinne og steril saltvann kan også brukes som et alternativ til denne øyedråpeteknikken. Data for kvinnelige rotter kan analyseres post-hoc i henhold til østrogen syklus dag (vurdere dager med syklus når stress utføres og / eller dag av syklus når testing oppstår).
3. Utstyr og programvare
- Bruk operantkamre for atferdstrening og testing.
- Sørg for at kamrene inneholder minst to uttrekkbare spaker med to stimuluslys over, et huslys og en dispenser for forsterkning for disse oppgavene.
- Kontroller at spakene er på hver side av det sentrale forsterkningsleveringsområdet med ett stimuluslys over hver spak.
- Bruk huslyset til å belyse kammeret uten å forstyrre deteksjonen av lys stimulansen (det er best hvis huslyset er på bakveggen i kammeret, motsatt av spakene og stimuluslysene).
- Bruk støvfrie matpellets (her brukes 45 mg pellets: 18,7% protein, 5,6% fett og 4,7% fiber) for forsterkning hos matbegrensede rotter. Ikke bruk pellets med høyt sukrose eller fett (med mindre det er interesse for hvordan stress påvirker velsmakende matinntak).
- Kontroller presentasjonen av stimuli, spakdrift og datainnsamling fra en datamaskin med programvare som er i stand til å betjene kammeret (Tabell over materialer).
MERK: Hvis du vil ha informasjon om koding av programmer som bruker denne programvaren, kan du kontakte forfatterne. MED-PC-skript er inkludert som tilleggsfiler. Denne programvaren samler inn informasjon om dyrets svar for hver prøve (hvilken spak som trykkes, om det er riktig / feil / ingen respons og ventetid for å gjøre valget). Fra denne informasjonen kan brukere beregne ulike tiltak i atferdsparadigmet, som beskrevet i atferdsanalysedelen. - Utfør trening/testing til samme tid hver dag for å kontrollere for døgnrytme i stresshormoner32 (og andre relevante tiltak).
- Fyll bunnbrettet på hver operantboks med ferskt sengetøy for å samle avføring/avfall. Etter hver økt dumper du hvert brett, rengjør skuffer og kammerinteriør med alkoholservietter eller et IACUC-godkjent desinfeksjonsmiddel, og erstatt med ferskt sengetøy før du legger et nytt dyr i kammeret.
4. Stress prosedyrer
- Bestem om stressprosedyren skal utføres før, under og/eller etter trening på operant strategiskifteparadigmet (f.eks. 5 dager med selvbeherskelsesstress før 3 dager med operant trening vs. 3 dager med operant trening etterfulgt av en enkelt selvbeherskelse og testing).
- Utfør stressprosedyren samtidig daglig med hensyn til operant trening. (f.eks. 30 min selvbeherskelsesstress fra 9 A.M., etterfulgt av plassering i operantkammeret).
- Utfør stressprosedyrene i et eget rom fra både kolonirommet og strategiskiftende paradigmerom (for å sikre at det ikke er forvirrende faktorer forbundet med vitnestress)33. Kort sagt, plasser rotten i et broome-stil gjennomsiktig sikkerhetsrør og forsegle åpningen, pass på at du ikke klemmer lemmer eller hale. Mellom hvert emne, bruk et IACUC-godkjent desinfeksjonsmiddel for å rengjøre Broome-lignende rør. Feil desinfisering kan etterlate feromoner som kan påvirke testprotokollen negativt.
MERK: Beregn hvor lenge den første gruppen rotter vil tilbringe i operantkamrene. Dette vil variere avhengig av trening vs. testdag; Når du har kjørt flere kohorter, kan det imidlertid beregnes en gjennomsnittstid for å fullføre hver aktivitet for å beregne fremtidige aktiviteter. - Avhengig av hvor mange operantkamre som er tilgjengelige, forskyver stressprosedyren for. For eksempel gjennomgår fire rotter selvbeherskelsesstress og er plassert i fire operankamre. En time senere gjennomgår ytterligere fire dyr stressprosedyrer som skal følges av operantkammeret.
5. Trening
MERK: Dette paradigmet er modifisert fra operant set-shifting prosedyren utviklet av Floresco et al. slik at det kan fullføres i 3 dager19. Opplæringsprosedyrer for rotter krever 3 dager (1 dag for å lære hver oppgave som beskrevet nedenfor). Det er sjelden at en rotte ikke lærer disse oppgavene. Hvis en rotte ikke lærer hver oppgave, bør den utelukkes fra den endelige studien. Se figur 1A for en visuell fremstilling av treningsparadigmet beskrevet nedenfor.
- Før du plasserer rotten i kammeret, må du sørge for at det er nok matpellets i dispenseren og at operantboksene fungerer som de skal. For å oppnå dette, last og start et trenings- eller testdagsprogram i et tomt kammer, og test manuelt at riktig spak gir en belønning per spakpresse.
- Trene rotten til å trykke på hver spak
- Før du plasserer rotten i esken for den første treningsdagen, må du manuelt sette en matpelletsbelønning på riktig spak, som angitt ved lasting av treningsprosedyren i hvert kammer.
- Tren rotten ved hjelp av en tidsplan med fast forhold (FR-1), slik at hver riktige spakpress belønnes med en forsterkning. Motvekt riktig spak per dag på tvers av motiver og/eller eksperimentelle forhold (som bare former én spak om gangen) ved å angi riktig spak ved lasting av treningsprosedyren på datamaskinen som betjener kamrene.
- La rotten trykke på spaken til den når kriteriet ved å trykke på riktig spak 50x, vanligvis fullføre oppgaven mellom 30-45 min.
- Neste dag tvinger rotten til å utføre denne oppgaven på motsatt spak ved hjelp av samme program som den første treningsdagen, men betegner motsatt spak som den riktige. Det er ikke nødvendig å "forme" spaken med en matpellet på denne treningsdagen. Vanligvis blir dette kriteriet raskt anskaffet etter at rotter har lært å trykke på den første spaken.
- Trene rotten til å reagere på lyssignalet
- På den tredje treningsdagen lyser lyset over begge spakene for 15 s forsøk, hvor rotten kan trykke på en av spakene for å potensielt motta en matpelletsbelønning. Under lysdiskrimineringsoppgaven vil dette programmet tilfeldig velge hvilken spak som er riktig på prøve-for-prøve-basis.
- Hvis rotten trykker på riktig spak, må du sørge for at lysene forblir opplyst i 3 s og belønningen leveres, etterfulgt av en periode på 5 s, der lysene slås av før neste prøve. Hvis rotten trykker på feil spak, må du kontrollere at ingen belønning leveres, og at lysene er slått av i 10 s før neste prøve.
- Etter denne siste treningsdagen beregner du "sideskjevhet" for å avgjøre om rotten har en preferanse for venstre eller høyre spak ved å dele antall trykk på en spak delt på det totale antall spakpresser. På testdagen vil rotten starte på sin minst foretrukne side for å sikre at den lærer den spesifikke responsbelønningsberedskapen, i stedet for å svare på en foretrukket spak.
6. Testing
MERK: Se figur 1B for en visuell fremstilling av testparadigmet beskrevet nedenfor.
- På dag 4 (testdag) plasserer du rotten i operantkammeret etter stressprosedyrer og tester dem i sidediskriminering, side reversering og lette diskrimineringsoppgaver serielt. Påse at lysdiskrimineringsoppgaven bare lyser opp lyset over den "riktige" spaken. I hver oppgave må rotter fortløpende oppnå åtte riktige forsøk for å fullføre hver diskriminering uten å trykke på den uoverførte, uriktige spaken. Et feil spaktrykk vil tilbakestille denne kjeden av forsøk.
- Test rotter ved hjelp av sidediskrimineringsoppgaven. Ved hjelp av sidediskrimineringsprogrammet belønner du rotten for å trykke spaken på sin minst foretrukne side som bestemt fra den tredje treningsdagen, uavhengig av lyssignalet. Oppgaven avsluttes når du trykker på riktig spak 8 ganger etter hverandre (unntatt utelatelser).
- Utfør side reverseringstesten ved å kjøre rotter ved hjelp av sidediskrimineringsprogrammet igjen, men denne gangen angir spaken motsatt av den riktige fra sidediskrimineringsoppgaven som riktig. Forsikre deg om at rotten belønnes for å trykke på denne spaken, uavhengig av lyssignalet. Oppgaven avsluttes når du trykker på riktig spak 8 ganger etter hverandre (unntatt utelatelser).
- Utfør lysdiskrimineringsoppgaven, som belønner rotten for å trykke på spaken med lyset opplyst ovenfor. Hver operanttesting er fullført når du trykker på riktig spak 8 ganger etter hverandre (unntatt utelatelser).
MERK: Basert på tidligere studier koder disse oppgavene minimum 30 studier, uavhengig av påfølgende presser, for å sikre at rotter har tilstrekkelig tid til å lære reglene for hver oppgave18. Således, hvis rotten fortløpende oppnår åtte riktige studier før 30 forsøk har skjedd, vil oppgaven forbli engasjert til 30 forsøk er fullført.
7. Atferdsanalyse
MERK: Dataene som samles inn for hvert dyr på testdagen, registreres og lagres automatisk av datamaskinen, så lenge et MED-PC-skript for hver oppgave er initiert og tillatt å fullføre (se tilleggsmaterialer for MED-PC-skript).
- Åpne dataene for hver testdagsoppgave (sidediskriminering, sidetilbakeføring og lett diskriminering) ved hjelp av dataprogrammet. De viktigste tiltakene som er registrert av programmet er forsøk på kriterium, feil i kriterium og tid til kriterium. Disse tiltakene er beskrevet i detalj nedenfor.
MERK: Forfatterne har generert et MATLAB-skript som muliggjør automatisering av analyseprosessen, samt analyse av utholdenhets- kontra regressive feil (kontaktforfattere for kodeinformasjon for å effektivisere dataanalysen).- Bruk forsøk på kriterium (som refererer til det totale antallet studier [ikke inkludert utelatelser] som er nødvendige for at rotten skal kunne fullføre åtte korrekte studier fortløpende, inkludert de åtte studiene) som hovedindikator for nøyaktighet. Disse dataene er plassert i den første kolonnen i matrise B i en datafil generert av MED-PC-skriptet for noen av oppgavene på testdagen.
- Undersøk de totale feilene som ble gjort under hver aktivitet. Disse dataene er plassert i den tredje kolonnen i matrise B i en datafil generert av MED-PC-skriptet for noen av oppgavene på testdagen. Disse feilene er også kategorisert i utholdenhets- eller regressive feil. Utholdenhetsfeil begås når rotten fortsetter å følge den tidligere regelen fra forrige oppgave. Regressive feil utføres etter at den er koblet fra den forrige regelen, men fortsetter å prøve å hente den nye regelen (hvis du vil ha mer informasjon om hvordan disse feiltypene beregnes, kan du se den publiserte metoden18).
- Hvis rotten ikke svarte på et lyssignal innen 15 s, er studien kategorisert som en utelatelse, og den vil ikke telle mot det totale antall studier til kriterium. Beregn dette ved først å legge sammen antall riktige svar (plassert i den andre kolonnen i matrise B i datafil) og antall feil (plassert i den tredje kolonnen i matrise B i datafilen). Deretter trekker du dette tallet fra det totale antallet forsøk til vilkår (dette er det siste tallet i den første kolonnen i matrise B i en datafil, forskjellig fra forsøkene til kriteriet).
- Bruk start- og sluttidspunkt som er registrert av programmet (plassert øverst i en datafil generert av MED-PC-skriptet for noen av oppgavene på testdagen) for å beregne tid til kriterium. Ventetiden til det første spaktrykket kan også beregnes fra datafilen ved å trekke variabelen K (forløpt tid i sekunder fra første spaktrykk) fra tid til kriterium.
- Gjennomsnitt av dataene for hvert atferdsmål for rotter i samme behandlingsgruppe. Utføre hensiktsmessige statistiske analyser (avhengig av hvor mange variabler som undersøkes).
8. Hjernesubstrater
- Bestemme et interessert hjerneområde og/eller aspekt av kognitiv fleksibilitet. For eksempel, hvis stress øker utholdenhetsfeil i side reverseringsoppgaven, kan orbitofrontal cortex (OFC) være av spesiell interesse, som tidligere lesjonsstudier har indikert at denne hjerneregionen spiller en rolle i mange former for reverseringslæring (dvs. romlig reversering testet i side reverseringsoppgaven)34,35,36. I dette eksemplet, ofre rotter etter strategien skiftende paradigme er fullført og undersøke c-fiender (mål på nevral aktivering37) i OFC ved hjelp av beskrevne immunhiistokjemiske metoder25 og beskrevet kort her.
- Først trekker du ut hjerner fra dyr og kutter i 40 μm skiver.
- Vask vevet i fosfatbufret saltvann (PBS) 4x i 5 min hver, og inkuber deretter i 0,3% hydrogenperoksid i 10 minutter for å slukke endogene peroksididaser.
- Vask vev i PBS 2x i 5 min hver, og inkuber deretter i musens anti-c-fos primære antistoff (1:500), 3% normalt eselserum (NDS) og 0,3% Triton X over natten.
- Neste dag, vask vev i PBS 3x i 5 min hver, og inkuber deretter i biotin-SP-konjugert esel antimus sary antistoff (1:500) i 2 timer.
- Vask vev i PBS 3x i 5 min hver, og inkuber deretter i avidin-streptavidin AB-kompleks i 1 time.
- Vask vev i PBS 3x i 5 min hver, og inkuber deretter i DAB-oppløsning i opptil 10 minutter da vev gjennomgår en oksidasjonskromogene reaksjon.
- Vask vev i PBS 3x i 5 min hver, og monter deretter hjerneskivene på glassmikroskopsklier.
- Dekker vevet ved hjelp av toluenbasert monteringsmedium og bilde ved hjelp av et brightfield-mikroskop.
MERK: Her, som reflektert i de representative resultatene, blir rotter ofret 30 min etter at strategien skiftende paradigme slutter, omtrent 60-90 min etter at reverseringsoppgaven er fullført (avhengig av hver rottes ytelse i lysoppgaven). Dette bør representere optimal timing for c-fos-uttrykk38, som gjenspeiler ytelsen i tilbakeføringsoppgaven.
- Alternativt kanylere et bestemt hjerneområde for legemiddelinjeksjon eller viral injeksjon før utførelsen av stress eller operant strategiskiftende paradigme.
MERK: Forskere vil kanskje undersøke hvordan manipulering av nevrale substrater endrer effekten av stress på kognitiv fleksibilitet. For eksempel kan forskere blokkere en bestemt nevrotransmitterreseptor i prefrontal cortex før testing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det tilpassede automatiserte operantstrategiforskyvningsparadigmet som er skissert ovenfor, ble brukt til å avgjøre om gjentatt selvbeherskelsesstress påvirker kognisjon hos mannlige og kvinnelige Sprague Dawley-rotter. Representative atferdsdata er beskrevet i figur 2 nedenfor. Kort sagt, kontroll og gjentatte ganger beherskede rotter utførte denne operant strategiskiftetesten, som besto av en rekke oppgaver: sidediskriminering, side reversering og lett diskriminering.
Forsøk på vilkår for hver aktivitet vises i Figur 2A. Vanligvis ble bedre ytelse for hver aktivitet representert av et redusert antall forsøk til kriterium. Disse dataene indikerer at menn, etter akutt selvbeherskelse, fullførte sidetilbakeføringsoppgaven i betydelig færre studier enn ubelastet, kontrollhanner. På den annen side krevde stressede kvinner et betydelig større antall forsøk for å fullføre sidetilbakeføringsoppgaven. Disse resultatene tyder på at menn viste forbedret ytelse etter stress, mens kvinner viste nedsatt ytelse. I lysdiskrimineringsoppgaven økte stresset antall forsøk til kriterium sammenlignet med kontrollhunner, og dermed svekket ytelsen hos kvinner, men ikke menn i denne oppgaven.
Totalt antall feil som er gjort for hver oppmerksomhetsoppgave, vises i Figur 2B. I samsvar med antall forsøk på kriterium gjorde stressede menn betydelig færre feil enn kontrollhanner, mens stressede kvinner gjorde flere feil i sidetilbakeføringsoppgaven. Videre, i lysdiskrimineringsoppgaven, gjorde kvinner også betydelig flere feil. I sum antyder disse dataene at gjentatt stress forbedrer kognitiv ytelse hos menn, men svekker kognitiv ytelse hos kvinner.
Totalfeil ble videre kategorisert i utholdenhets- eller regressive feil i figur 2C (for et skille mellom disse to feiltypene, se protokolldel 7). Interessant nok gjorde stressede menn færre utholdenhetsfeil i sidetilbakeføringsoppgaven enn kontrollhanner. På den annen side, både i sidetilbakeføringen og lette diskrimineringsoppgaver, gjorde stressede kvinner et større antall utholdenhetsfeil enn å kontrollere kvinner. Det var ingen forskjeller mellom behandlingsgruppene i antall regressive feil som ble gjort under noen avoppgavene.
Utelatelser i hvert forsøks- og tidskriterium vises i figur 2D (hvis du vil ha mer informasjon om hvordan disse ble beregnet, se avsnitt 7 i protokollen). Disse tiltakene ble evaluert bare i sidetilbakeføringsoppgaven, da denne oppgaven viste de største kjønnsforskjellene. Stressede kvinner gjorde en høyere prosentandel av unnlatelser sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper. I tillegg, mens stress syntes å redusere tiden til å fullføre side reverseringsoppgaven hos menn, stress langvarig fullføring av oppgaven hos kvinner. I sum svekket gjentatt stress kognitiv fleksibilitet hos kvinner, men ikke menn.
Hjernesubstrater som ligger til grunn for kognitiv fleksibilitet, er avbildet i figur 3. Etter hvert som det ble observert sterke kjønnsforskjeller i sidetilbakeføringsoppgaven, ble hjerneområdene som ligger til grunn for denne oppgaven undersøkt for å avgjøre om de viste lignende kjønnsforskjeller i nevral aktivitet. Som tidligere diskutert har lesjonsstudier indikert at orbitofrontal cortex (OFC) formidler side reverseringsoppgaven34. Dermed ble c-fiender, et mål på nevral aktivering37, merket i OFC på 30 minutter etter ferdigstillelse av strategiforskyvning, noe som burde ha reflektert ytelsen i side reverseringsoppgaven38. Det er imidlertid mulig at OFC også kan spille en rolle i den utenomdimensjonale strategiforskyvningskomponenten i denne oppgave39. Dermed er det viktig å utføre offeret til rett tid for å reflektere hjerneaktivitet under en bestemt oppgave i operant strategiskifteparadigmet. Her forårsaket stress en betydelig økning i nevronaktivering i OFC hos menn sammenlignet med kontroller. Stress induserte imidlertid en betydelig reduksjon i nevronaktivering i OFC hos kvinner sammenlignet med kontroller. Videre ble OFC-aktivering og studier til kriterium negativt korrelert hos menn; nærmere bestemt var høyere OFC-aktivering knyttet til færre forsøk til kriterium. Derimot var det ingen sammenheng mellom OFC-aktivering og ytelse hos kvinner, noe som tyder på at OFC ble løsnet under disse forestillingene.
Figur 1: Skjematisk for operant strategiskifteparadigmet under trening og testdager. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative atferdsdata fra operant strategiskifteparadigme. (A) Forsøk på kriterium for hver oppgave på testdagen. I side reverseringsoppgaven forbedret stressytelsen hos menn, men svekket ytelse hos kvinner. I lysdiskrimineringsoppgaven svekket stress ytelsen hos kvinner, mens det ikke påvirket menn. (B) Antall feil for hver oppgave på testdagen. Stress reduserte antall feil hos menn, men økte feil hos kvinner i både sidetilbakeføring og lette diskrimineringsoppgaver. (C) Utholdenhets- og regresjonsfeilkategorisering. Stress reduserte utholdenhetsfeil hos menn, men økte utholdenhetsfeil hos kvinner i både sidetilbakeføring og lette diskrimineringsoppgaver. (D) Forsøk med prosent utelatt og tid til kriterium i sidetilbakeføringsoppgaven. Stress økte prosentandelen utelatelser hos kvinnelige rotter. Stress reduserte tiden som kreves av menn, men økte tiden som kreves av kvinner for å fullføre oppgaven. Statistikk ble beregnet ved hjelp av toveis ANOVA etterfulgt av Tukeys t-test (n = 12 rotter per gruppe; feilfelt representerer SEM; #p ≤ 0,10, * p < 0,05). Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon17. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativ nevral aktivering etter operant strategiskifteparadigme. (A) OFC-aktivering etter strategiskifteoppgave. Representative bilder av immunhiistokjemiske 3,3'-diaminobenzidin (DAB) farging ved hjelp av et antistoff mot c-fos i OFC visualisert ved hjelp av brightfield mikroskopi, deretter kvantifisert. Stress økte aktiveringen betydelig (demonstrert av antall c-fos-uttrykkende celler) i OFC hos menn, mens det reduserte aktivering hos kvinner. Skalalinjen i bildepanelet nederst til høyre representerer 200 μm. Statistikken ble beregnet ved hjelp av toveis ANOVA etterfulgt av Tukeys t-test (n = 12 rotter per gruppe, 6–8 deler OFC analysert per rotte; feilfelt representerer SEM; *p < 0,05). (B) Forsøk på kriterium i sidetilbakeføringsoppgaven korrelert med OFC-aktivering. Hannene viste en betydelig negativ korrelasjon, mens kvinner ikke gjorde det. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen viser hvordan man måler effekten av stress på kognitiv funksjon. Spesielt brukes et modifisert operant strategiskifteparadigme hos gnagere, som måler kognitiv fleksibilitet (analogt med Wisconsin Card Sorting Task hos mennesker)1. Kognitiv fleksibilitet betegner evnen til å tilpasse kognitive behandlingsstrategier for å møte nye forhold i miljøet, og det er avgjørende for normal daglig funksjon2. Ettersom menneskelige studier på kognitiv fleksibilitet for det meste er begrenset til hjerneavbildning11, vil bruken av dette paradigmet hos dyr i stor grad fremme forståelsen av effekter av stress på hjernen og kognisjon.
Stress kan svekke kognitiv funksjon40. Faktisk er dette en av de vanligste fenotypene i stressrelaterte sykdommer som PTSD og MDD3,41. Videre er det sterke kjønnsforskjeller i forekomsten av stressrelaterte psykiatriske sykdommer5,6,7, men det er liten forståelse av nevrobiologien bak disse partiske forekomstene. Dermed kan bruk av denne operantstrategien skiftende paradigme hos dyr av begge kjønn bidra til å fremme den nåværende forståelsen av kjønnsforskjeller i psykiatrien.
Denne operantiske strategiskifteoppgaven gjør det mulig for forskere å undersøke viktige aspekter ved kognisjon som er relevante for psykiatriske lidelser. For eksempel beregnes utholdenhetsfeil etter eksperimentell manipulering i dette paradigmet. Utholdenhet observeres i stressrelaterte psykiatriske lidelser som PTSD, og det svekker ens evne til å lære et nytt sett med regler, til slutt svekke arbeidsminne3. Dermed er målet på utholdenhetsfeil oversettelsesrelevant. Videre har unnlatelser i oppmerksomhetsoppgaver blitt notert hos pasienter med PTSD, noe som indikerer langsommere kortikale behandling3. Følgelig kan utelatelsesdata fra dette paradigmet ha kliniske kolleger. I sum er kognitiv fleksibilitet målt ved hjelp av dette eksperimentelle paradigmet modeller viktige fenotyper som observeres i psykiatriske lidelser.
Dette eksperimentelle paradigmet gir også presisjon i målretting av nevrale substrater som ligger til grunn for kognitiv fleksibilitet. For eksempel har litteraturen indikert at prefrontal cortex (PFC) er en avgjørende hjerneregion for kognitiv fleksibilitet3, inkludert medial prefrontal (mPFC) og orbitofrontal cortex (OFC). Av disse underregionene i PFC er OFC viktig for ytelsen i sidetilbakeføringsoppgaven34,35. Disse hjerneområdene er også et sentralt mål for stressinduserte funksjonelle endringer42,43. Interessant, modellen av stress som brukes her ser ut til å spille en rolle i den etterfølgende ytelsen til gnagere i tester av kognitiv fleksibilitet; Dermed bør det vurderes i utformingen av fremtidige eksperimenter. Disse varierende responsene på stress peker på potensielt nye mekanismer som kognisjon påvirkes av stress. Dermed kan målretting av spesifikke nevrotransmittere, proteiner eller aktivering av disse hjerneregionene kaste lys over hvordan stress påvirker kognisjon hos mannlige og kvinnelige gnagere. Forskere kan velge å manipulere disse nevrale substratene på forskjellige tidspunkter i forbindelse med stress eller strategiforskyvning, eller alternativt måle nevrale substrater etter eksponering for disse atferdsparadigmene.
Denne modifiserte operant strategiskifteoppgaven har klare fordeler i forhold til andre kognitive fleksibilitetsparadigmer som brukes i stresslitteraturen (dvs. graveoppgaven12,13,14,15), som krever mer tid og krefter av eksperimentet for å trene gnagere. Denne prosedyren krever minimal tilsyn av eksperimentet og gjør det mulig å teste flere rotter samtidig. I tillegg, i motsetning til andre versjoner av denne automatiserte oppgaven19, krever paradigmet bare 3 dagers opplæring og inkluderer en effektiv programmert dataanalyse.
Operant strategiskifteparadigmet har visse begrensninger. En begrensning er at den bare kan teste to stimulansdimensjoner (f.eks. venstre eller høyre spak vs. lyssignal), mens graveoppgaven12,13,14,15 kan teste en tredje stimulansdimensjon (f.eks. gravemedier vs. lukt vs. tekstur). Imidlertid tillater oppgaven beskrevet i denne protokollen fortsatt testing av rottens evne til å skifte til forskjellige regler, noe som gjør det mulig å teste de kognitive fleksibilitetskonstruksjonene. I tillegg er det mulig å legge til andre parametere i operantkamrene for å tillate en tredje stimulus (f.eks. en lukt), men dette kan forlenge treningen som kreves for oppgaven.
Den viktigste fordelen med denne oppgaven er dens enkelhet og evne til å parre den med stressende eller farmakologiske manipulasjoner for å forstå hvordan stress påvirker hjernen ytterligere. Det skal bemerkes at denne enkelheten kommer med en økt vanskelighet som fagene står overfor mens de lærer å utnytte pressen, sammenlignet med den økologisk relevante graveoppgaven. Mens denne operantoppgaven er langt mindre arbeidskrevende, vil gnagere generelt kreve flere forsøk for å skaffe seg denne oppgaven. Imidlertid engasjerer både graveoppgaven og dette paradigmet lignende nevrobiologiske mekanismer og representerer dermed gyldige alternativer for undersøkelse av kognitiv fleksibilitet16,44. Mens det har vært varierte resultater i litteraturen om effekten av stress på kognitiv fleksibilitet ved hjelp av graveoppgaven og denne operantprosedyren23,25,27,45,46, gjenspeiler den presenterte metoden de komplekse effektene som typen, intensiteten og varigheten til en stressor kan ha på kognitiv funksjon20,21.
En annen begrensning av oppgaven er at gnagere er plassert i lukkede ugjennomsiktige bokser; Andre virkemåter enn de som samles inn via datamaskingrensesnittet, kan derfor ikke kodes. For eksempel kan et høyt antall utelatelser av en rotte skyldes atferdshemming påført av stress, eller fordi rotten sover. Videre kan annen stereotypisk oppførsel, for eksempel grooming (som er spesielt relevant for å studere stress), være interessant å analysere under oppgaven. Monteringskameraer i operankamre kan tillate denne typen atferdspresisjon.
Samlet sett beskriver denne rapporten bruken av stressprosedyrer i forbindelse med et operant strategiskiftende paradigme for å forstå hvordan stress påvirker hjernen ytterligere. Det skal bemerkes at i tillegg til stressprosedyrer og kognitiv vurdering hos voksne, kan forskning på ulike utviklingsstadier gi avgjørende informasjon om etiologien til kognitiv infleksibilitet. I tillegg til å studere effekten av stress på kognitiv fleksibilitet, kan dette enkle og effektive operant strategiskifteparadigmet kombineres med mange eksperimentelle manipulasjoner for å undersøke hvordan hjernen tilpasser seg skiftende miljøer. Videre kan alternative eksperimentelle tilnærminger brukes til å studere det nevrale grunnlaget for kognitiv fleksibilitet, inkludert lesjoner, farmakologi, genredigering og elektrofysiologi. Siden kognitiv ufleksibilitet er en av de viktigste fenotypene i psykiatrisk sykdom, må det forskes mer for å forstå nevrobiologiske substrater ytterligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Hannah Zamore, Emily Saks og Josh Searle for deres hjelp til å etablere denne operaniske strategien som skifter paradigme i Grafe-laboratoriet. De vil også takke Kevin Snyder for hans hjelp med MATLAB-koden for analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 inch glass pipette eye droppers | Amazon | 4306-30-012LC | For vaginal lavage |
| Alcohol Wipes | VWR | 15648-990 | To clean trays in set shifting boxes between rats |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse lgG (H+L), minimal cross reaction to bovine, chicken, goat, guinea pig, hamster, horse, human, rabbit, sheep serum proteins | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | All other DAB protocol staining materials are standard buffers/DAB and are not specified here, as this is not the main focus of the methods paper |
| C-fos mouse monoclonal primary antibody | AbCam | ab208942 | To stain neural activation in brain areas after set shifting |
| Dustless Food Pellets | Bio Serv | F0021 | For set shifting boxes (dispenser for reward) |
| GraphPad Prism | Used for data analysis | ||
| Leica DM4 B Microscope and associated imaging software | Leica | Lots of different parts for the microscope and work station, for imaging lavage and/or cfos | |
| MatLab | Software; code to help analyze set shifting data, available upon request. | ||
| Med-PC Software Suite | Med Associates | SOF-736 | Software; uses codes to operate operant chambers |
| Operant Chambers | Med PC | MED-008-B2 | Many different parts for the chamber set up and software to work with it; we also wrote a separate code for set shifting, available upon request. |
| Rat Bedding | Envigo | T.7097 | |
| Rat Chow | Envigo | T.2014.15 | |
| Restraint Devices | Bryn Mawr College | Made by our shop | For stress exposure; specifications available upon request. |
| Scribbles 3d fabric paint | Amazon | 54139 | For vaginal lavage |
| Sprague Dawley Rats | Envigo | At least D65 Males and Females | |
| VWR Superfrost Plus Micro Slide | VWR | 48311-703 | For vaginal lavage and/or brain slices/staining for c-fos |
References
- Hurtubise, J. L., Howland, J. G. Effects of stress on behavioral flexibility in rodents. Neuroscience. 345, 176-192 (2016).
- Bissonette, G. B., Powell, E. M., Roesch, M. R. Neural structures underlying set-shifting: Roles of medial prefrontal cortex and anterior cingulate cortex. Behavioural Brain Research. 250, 91-101 (2013).
- Vasterling, J. J., Brailey, K., Constans, J. I., Sutker, P. B. Attention and memory dysfunction in posttraumatic stress disorder. Neuropsychology. 12 (1), 125-133 (1998).
- Bangasser, D. A., Kawasumi, Y. Cognitive disruptions in stress-related psychiatric disorders: A role for corticotropin releasing factor (CRF). Hormones and Behavior. 76, 125-135 (2015).
- Nestler, E. J., et al.
- Keane, T. M., Marshall, A. D., Taft, C. T. Posttraumatic stress disorder: etiology, epidemiology, and treatment outcome. Annual Review of Clinical Psychology. 2, 161 (2006).
- Seeman, M. V. Psychopathology in women and men: focus on female hormones. The American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1641-1647 (1997).
- Hodes, G. E., Epperson, C. N. Sex Differences in Vulnerability and Resilience to Stress Across the Life Span. Biological Psychiatry. 86 (6), 421-432 (2019).
- Monika, T. -B., Antoni, F., Piotr, G., Marian, M., Krzysztof, Z. Wisconsin Card Sorting Test in psychological examination of patients with psychiatric disorders. Polski merkuriusz lekarski: organ Polskiego Towarzystwa Lekarskiego. 25, Suppl 1 51-52 (2008).
- Merriam, E. P., Thase, M. E., Haas, G. L., Keshavan, M. S., Sweeney, J. A. Prefrontal cortical dysfunction in depression determined by Wisconsin Card Sorting Test performance. The American Journal of Psychiatry. 156 (5), 780-782 (1999).
- Monchi, O., Petrides, M., Petre, V., Worsley, K., Dagher, A. Wisconsin Card Sorting revisited: distinct neural circuits participating in different stages of the task identified by event-related functional magnetic resonance imaging. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (19), 7733-7741 (2001).
- Bulin, S. E., Hohl, K. M., Paredes, D., Silva, J. D., Morilak, D. A. Bidirectional optogenetically-induced plasticity of evoked responses in the rat medial prefrontal cortex can impair or enhance cognitive set-shifting. eNeuro. 7 (1), 0363 (2019).
- Chaby, L. E., Karavidha, K., Lisieski, M. J., Perrine, S. A., Liberzon, I. Cognitive Flexibility Training Improves Extinction Retention Memory and Enhances Cortical Dopamine With and Without Traumatic Stress Exposure. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 24 (2019).
- Drozd, R., Rojek-Sito, K., Rygula, R. The trait 'pessimism' does not interact with cognitive flexibility but makes rats more vulnerable to stress-induced motivational deficits: Results from the attentional set-shifting task. Behavioural Brain Research. 335, 199-207 (2017).
- Birrell, J. M., Brown, V. J. Medial frontal cortex mediates perceptual attentional set-shifting in the rat. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (11), 4320-4324 (2000).
- Floresco, S. B., Block, A. E., Tse, M. T. L. Inactivation of the medial prefrontal cortex of the rat impairs strategy set-shifting, but not reversal learning, using a novel, automated procedure. Behavioural Brain Research. 190 (1), 85-96 (2008).
- Grafe, L. A., Cornfeld, A., Luz, S., Valentino, R., Bhatnagar, S. Orexins Mediate Sex Differences in the Stress Response and in Cognitive Flexibility. Biological Psychiatry. 81 (8), 683-692 (2017).
- Snyder, K. P., Barry, M., Valentino, R. J. Cognitive impact of social stress and coping strategy throughout development. Psychopharmacology. 232 (1), 185-189 (2014).
- Brady, A. M., Floresco, S. B. Operant procedures for assessing behavioral flexibility in rats. Journal of Visualized Experiments. (96), e52387 (2015).
- Sandi, C., Pinelo-Nava, M. T. Stress and Memory: Behavioral Effects and Neurobiological Mechanisms. Neural Plasticity. , 1-20 (2007).
- Shansky, R. M., Lipps, J. Stress-induced cognitive dysfunction: hormone-neurotransmitter interactions in the prefrontal cortex. Frontiers in Human Neuroscience. 7, 123 (2013).
- Ragozzino, M. E., Detrick, S., Kesner, R. P. Involvement of the prelimbic-infralimbic areas of the rodent prefrontal cortex in behavioral flexibility for place and response learning. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 19 (11), 4585-4594 (1999).
- Liston, C., et al. Stress-induced alterations in prefrontal cortical dendritic morphology predict selective impairments in perceptual attentional set-shifting. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26 (30), 7870-7874 (2006).
- Hatch, A., Wiberg, G. S., Balazs, T., Grice, H. C.
- Grafe, L. A., Cornfeld, A., Luz, S., Valentino, R., Bhatnagar, S. Orexins Mediate Sex Differences in the Stress Response and in Cognitive Flexibility. Biological Psychiatry. 81 (8), 683-692 (2017).
- Animal Care and Use Committee, T. J. H. U. Species Specific Information: Rat. , Available from: http://web.jhu.edu/animalcare/procedures/rat.html (2020).
- Lapiz-Bluhm, M. D. S., et al. Behavioural assays to model cognitive and affective dimensions of depression and anxiety in rats. Journal of Neuroendocrinology. 20 (10), 1115-1137 (2008).
- McEwen, B. S. Permanence of brain sex differences and structural plasticity of the adult brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (13), 7128-7130 (1999).
- Manber, R., Armitage, R. Sex, steroids, and sleep: a review. Sleep. 22 (5), 540-555 (1999).
- Sherwin, B. B. Estrogen and Cognitive Functioning in Women. Endocrine Reviews. 24 (2), 133-151 (2003).
- Becker, J. B., et al. Strategies and methods for research on sex differences in brain and behavior. Endocrinology. 146 (4), 1650-1673 (2005).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Warren, B. L., et al. Neurobiological sequelae of witnessing stressful events in adult mice. Biological Psychiatry. 73 (1), 7-14 (2013).
- McAlonan, K., Brown, V. J. Orbital prefrontal cortex mediates reversal learning and not attentional set-shifting in the rat. Behavioural Brain Research. 146 (1-2), 97-103 (2003).
- Schoenbaum, G., Saddoris, M. P., Stalnaker, T. A. Reconciling the roles of orbitofrontal cortex in reversal learning and the encoding of outcome expectancies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1121 (1), 320-335 (2007).
- Meunier, M. Effects of orbital frontal and anterior cingulate lesions on object and spatial memory in rhesus monkeys. Neuropsychologia. 35 (7), 999-1015 (1997).
- Zappulla, R. A., Wang, W., Friedrich, V. L., Grabel, J., Nieves, J. CNS activation patterns underlying motor evoked potentials as demonstrated by c-fos immunoreactivity. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 43, 155-169 (1991).
- Schoenenberger, P., Gerosa, D., Oertner, T. G. Temporal Control of Immediate Early Gene Induction by Light. PLoS ONE. 4 (12), 8185 (2009).
- Chase, E. A., Tait, D. S., Brown, V. J. Lesions of the orbital prefrontal cortex impair the formation of attentional set in rats. The European Journal of Neuroscience. 36 (3), 2368-2375 (2012).
- Hancock, P. A., Warm, J. S. A dynamic model of stress and sustained attention. Human Performance in Extreme Environments. 7 (1), 15-28 (2003).
- Johnson, P. L., Molosh, A., Fitz, S. D., Truitt, W. A., Shekhar, A. Orexin, stress, and anxiety/panic states. Progress in Brain Research. 198, 133-161 (2012).
- Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscience. 251, 108-119 (2013).
- Holmes, A., Wellman, C. L. Stress-induced prefrontal reorganization and executive dysfunction in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 33 (6), 773-783 (2009).
- Placek, K., Dippel, W. C., Jones, S., Brady, A. M. Impairments in set-shifting but not reversal learning in the neonatal ventral hippocampal lesion model of schizophrenia: further evidence for medial prefrontal deficits. Behavioural Brain Research. 256, 405-413 (2013).
- Nikiforuk, A., Popik, P. Long-lasting cognitive deficit induced by stress is alleviated by acute administration of antidepressants. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 28-39 (2011).
- Bondi, C. O., Rodriguez, G., Gould, G. G., Frazer, A., Morilak, D. A. Chronic unpredictable stress induces a cognitive deficit and anxiety-like behavior in rats that is prevented by chronic antidepressant drug treatment. Neuropsychopharmacology. 33 (2), 320-331 (2008).
