Summary
Les événements stressants de la vie altèrent la fonction cognitive, ce qui augmente le risque de troubles psychiatriques. Ce protocole illustre comment le stress affecte la flexibilité cognitive à l’aide d’une stratégie opérante automatisée changeant de paradigme chez les rats Sprague Dawley mâles et femelles. Des zones cérébrales spécifiques sous-jacentes à des comportements particuliers sont discutées et la pertinence translationnelle des résultats est explorée.
Abstract
Le stress affecte la fonction cognitive. La question de savoir si le stress améliore ou altère la fonction cognitive dépend de plusieurs facteurs, y compris le 1) type, l’intensité et la durée du facteur de stress; 2) type de fonction cognitive à l’étude; et 3) le moment du facteur de stress par rapport à l’apprentissage ou à l’exécution de la tâche cognitive. En outre, les différences entre les sexes parmi les effets du stress sur la fonction cognitive ont été largement documentées. Décrit ici est une adaptation d’une stratégie opérante automatisée changeant de paradigme pour évaluer comment les variations du stress affectent la flexibilité cognitive chez les rats Sprague Dawley mâles et femelles. Plus précisément, le stress de contention est utilisé avant ou après l’entraînement dans cette tâche opérante pour examiner comment le stress affecte les performances cognitives chez les deux sexes. Des zones cérébrales particulières associées à chaque tâche dans ce paradigme automatisé ont été bien établies (c’est-à-dire le cortex préfrontal médian et le cortex orbitofrontal). Cela permet des manipulations ciblées au cours de l’expérience ou l’évaluation de gènes et de protéines particuliers dans ces régions à la fin du paradigme. Ce paradigme permet également de détecter différents types d’erreurs de performance qui se produisent après un stress, chacun d’entre eux ayant des substrats neuronaux définis. Des différences distinctes entre les sexes dans les erreurs de persévérance après un paradigme de stress de contention répété sont également identifiées. L’utilisation de ces techniques dans un modèle préclinique peut révéler comment le stress affecte le cerveau et altère la cognition dans les troubles psychiatriques, tels que le trouble de stress post-traumatique (SSPT) et le trouble dépressif majeur (TDM), qui présentent des différences marquées de prévalence entre les sexes.
Introduction
Chez l’homme, les événements stressants de la vie peuvent altérer la fonction cognitive (c’est-à-dire la flexibilité cognitive1), ce qui dénote la capacité d’adapter les stratégies de traitement cognitif pour faire face à de nouvelles conditions dans l’environnement2. L’altération de la cognition précipite et exacerbe de nombreux troubles psychiatriques, tels que le trouble de stress post-traumatique (SSPT) et le trouble dépressif majeur(TDM) 3,4. Ces troubles sont deux fois plus fréquents chez les femmes5,6,7,8, mais la base biologique de cette disparité reste inconnue. Les aspects du fonctionnement exécutif chez l’homme peuvent être évalués à l’aide de la tâche de tri des cartes du Wisconsin, une démonstration de la flexibilité cognitive2. La performance dans cette tâche est altérée chez les patients atteints de SSPT9 et MDD10, mais la base neuronale de ce changement ne peut être examinée que par imagerie cérébrale11.
Des progrès dans la compréhension de la façon dont le stress affecte le cerveau ont été réalisés grâce à l’utilisation de modèles animaux, en particulier les rongeurs. Comme la flexibilité cognitive est affectée dans les maladies liées au stress, c’est un phénotype exceptionnellement pertinent à examiner chez les rongeurs. À ce jour, la plupart de la littérature sur la neurobiologie du stress a utilisé un paradigme alternatif de flexibilité cognitive (parfois appelé tâche de creusement)12,13,14,15. Bien que cette tâche ait été largement examinée, elle nécessite plus de temps et d’efforts de la part de l’expérimentateur pour former les rongeurs. Adapté et décrit ici est un protocole automatisé bien établi de changement de décor16 pour évaluer la flexibilité cognitive chez les rats Sprague Dawley mâles et femelles en utilisant divers modèles de stress17,18. La procédure nécessite une surveillance minimale de la part de l’expérimentateur et permet à plusieurs rats d’être testés simultanément. De plus, contrairement à d’autres versions de cette tâche automatisée19,l’adaptation de ce paradigme ne nécessite que 3 jours de formation et comprend une analyse efficace des données programmées.
Que le stress améliore ou altère la fonction cognitive dépend du type, de l’intensité et de la durée du facteur de stress, ainsi que du moment du facteur de stress par rapport à l’apprentissage ou à l’exécution d’une tâche cognitive20,21. Ainsi, le protocole intègre des procédures de stress avant et après l’entraînement opérant. Il examine également les résultats représentatifs des études sur le stress. En outre, les régions cérébrales sous-jacentes à des aspects particuliers du décalage des ensembles ont été bienétablies2,16,22; Ainsi, le rapport décrit également comment cibler et évaluer des régions cérébrales particulières pendant ou après le stress et les procédures de changement de stratégie.
Il y a eu peu de recherches sur l’examen direct des différences entre les sexes dans la flexibilité cognitive18,23. Le protocole décrit comment 1) incorporer des rats mâles et femelles dans le paradigme expérimental, puis 2) suivre les cycles œstrous avant et pendant les procédures chez les femelles qui font librement du vélo. Des études antérieures ont indiqué que le stress avant l’entraînement opérant peut entraîner des déficits spécifiques au sexe dans la flexibilité cognitive chez les rats17. En particulier, les rats femelles présentent des perturbations de la flexibilité cognitive après le stress, tandis que la flexibilité cognitive s’améliore chez les rats mâles après le stress17. Fait intéressant, une caractéristique majeure des troubles psychiatriques liés au stress, qui ont une incidence biaisée par le sexe chez les humains, est l’inflexibilité cognitive. Ces résultats suggèrent que les femmes peuvent être plus vulnérables à ce type de déficience cognitive que les hommes. L’utilisation de ces techniques dans des modèles animaux permettra de mettre en lumière les effets du stress sur le cerveau et la façon dont il altère la cognition dans les troubles psychiatriques chez l’homme.
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Protocol
Toutes les procédures de cette étude ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Bryn Mawr College. Obtenir l’approbation réglementaire de l’IACUC ou d’une autre approbation réglementaire applicable avant de commander des animaux de laboratoire et de commencer l’expérimentation.
1. Préparation des animaux
- Acquérir des rats Sprague Dawley adultes mâles et femelles.
REMARQUE: Les rats peuvent être livrés avant l’âge de 65 jours, mais ne commencez les procédures qu’après ce point pour vous assurer que les mâles et les femelles sont complètement matures. - Coupler des rats de même sexe aussi longtemps que possible, car l’isolement à long terme est un facteur de stress24. Pour la restriction alimentaire, hébergez les rats seuls juste avant le protocole de changement de stratégie opérant.
- Après 1 semaine d’acclimatation, commencez doucement à manipuler les rats pendant 3 à 5 minutes par jour. Collectez le poids corporel de chaque rat. De plus, si vous souhaitez évaluer comment les hormones gonadiques peuvent affecter les résultats, collectez un lavage vaginal pour les rats femelles (décrit à la rubrique 2).
- Limitez (de la nourriture) les animaux qui seront exécutés dans le paradigme de changement de stratégie opérant au moins 3 jours avant le début de la formation afin qu’ils apprennent avec succès la tâche. Assurez-vous que l’eau est toujours disponible gratuitement. Des dossiers écrits doivent être tenus pour chaque animal afin de documenter la consommation quotidienne d’aliments et de liquides, l’état d’hydratation et tout changement comportemental et clinique utilisé comme critère pour le retrait temporaire ou permanent d’un animal d’un protocole (Morton, 2000; CNRC, 2003b).
- Si vous utilisez une procédure de stress pendant plus de 3 jours avant l’entraînement, ajustez la restriction alimentaire pour qu’elle corresponde au nombre de jours de stress (par exemple, 5 jours de contention plus restriction alimentaire25).
- Chaque jour, verser 80 % de l’apport alimentaire quotidien normal (c.-à-d. 4 g de nourriture pour 100 g de poids corporel)26. Utilisez la collecte quotidienne de poids pour le rat afin de calculer la quantité de nourriture à donner chaque jour.
- Poursuivez la restriction alimentaire pendant les journées de formation et de test. Cependant, ne placez pas de nourriture dans la cage de la maison avant que le rat ait terminé l’entraînement ou les tests pour la journée, sinon il ne sera pas motivé à effectuer les tâches pour une récompense de granulés alimentaires. Assurez-vous que le moment de la livraison de nourriture aux rats à la fin de la tâche est assez imprévisible, car cela permet d’éviter une motivation réduite à jouer dans la chambre opérante (en faveur de la simple attente de nourriture dans la cage de la maison par la suite).
REMARQUE: Les animaux subissant le paradigme du stress de contention ne présentent pas de perte de poids significativement plus importante que les sujets témoins, non stressés. Cependant, diverses procédures de stress peuvent elles-mêmes induire une perte de poids, ce qui fait que les rats reçoivent moins de nourriture que leurs homologues non stressés pendant la restriction alimentaire basée sur le poids corporel. Cela peut présenter un facteur de stress supplémentaire et confondant. Si cela semble être le cas, utilisez alternativement une quantité fixe de nourriture donnée à chaque sujet, quel que soit le poids27.
2. Lavage vaginal
REMARQUE: Les hormones gonadiques (c’est-à-dire l’œstrogène et la progestérone) sont connues pour affecter la réponse au stress et la cognition28,29,30. Ces hormones fluctuent au cours du cycle œstrous des rats femelles31. Si vous souhaitez suivre le cycle œstral des rongeurs femelles en corrélation avec les données de stress ou de flexibilité cognitive, collectez un lavage vaginal comme décrit ci-dessous. Les données représentatives tenant compte du stade du cycle œstrous ne sont pas fournies.
- Pour obtenir des échantillons de lavage vaginal des femelles, rassemblez de l’eau tiède dans un bécher propre, une pipette en verre, une lame de « lavage » (lame de microscope avec des cercles de peinture acrylique pour contenir l’échantillon de lavage) et un bécher vide.
- Remplissez la pipette avec une petite quantité d’eau tiède (~0,5 mL), puis insérez la pointe dans le vagin du rat femelle (en soulevant par sa queue). Expulsez l’eau stérile 2x–3x et expulsez le fluide recueilli sur une lame microscopique. Ne débordez pas le cercle de glissière de lavage.
- Expulser tout excès de liquide dans le bécher vide. Étiquetez la lame de lavage avec des numéros de rat et mettez les échantillons de chaque rat dans cet ordre afin qu’il soit clair quel échantillon appartient à chaque rat.
- Rincez soigneusement la pipette en pipetant de l’eau chaude propre et en la distribuant plusieurs fois dans le bécher « en excès » avant de remplir la pipette pour échantillonner le rat suivant.
- Portez soigneusement la lame de lavage à un microscope à champ lumineux pour imager l’échantillon de lavage et classer le jour dans le cycle œstral comme décrit dans Becker et al31.
REMARQUE: Idéalement, la mise en cage devrait être effectuée pendant quelques semaines pour suivre correctement le cycle d’une femme et devrait être effectuée à une heure très similaire chaque jour pour contrôler les rythmes circadiens. De préférence, cette procédure doit être effectuée avant les procédures de changement de stratégie de stress et d’opération. L’utilisation de cotons-tiges et de solution saline stérile peut également être utilisée comme alternative à cette technique de compte-gouttes. Les données pour les rats femelles peuvent être analysées post-hoc en fonction du jour du cycle œstré (considérez les jours de cycle lorsque le stress est effectué et / ou le jour du cycle lorsque les tests ont lieu).
3. Équipement et logiciels
- Utilisez des chambres opérantes pour l’entraînement et les tests comportementaux.
- Assurez-vous que les chambres contiennent au moins deux leviers rétractables avec deux lumières de stimulation au-dessus, une lumière de maison et un distributeur pour le renforcement pour ces tâches.
- Vérifiez que les leviers se trouvent de chaque côté de la zone centrale de livraison de renfort avec une lumière de stimulation au-dessus de chaque levier.
- Utilisez la lumière de la maison pour éclairer la chambre sans interférer avec la détection du stimulus lumineux (il est préférable que la lumière de la maison soit sur le mur arrière de la chambre, à l’opposé des leviers et des lumières de stimulation).
- Utilisez des granulés alimentaires sans poussière (ici, des granulés de 45 mg sont utilisés: 18,7% de protéines, 5,6% de matières grasses et 4,7% de fibres) pour renforcer les rats soumis à des restrictions alimentaires. N’utilisez pas de granulés riches en saccharose ou en gras (à moins qu’il n’y ait un intérêt pour la façon dont le stress affecte l’apport alimentaire appétissant).
- Contrôlez la présentation des stimuli, le fonctionnement du levier et la collecte de données à partir d’un ordinateur doté d’un logiciel capable de faire fonctionner la chambre(Table des matériaux).
REMARQUE: Pour plus d’informations sur le codage des programmes utilisant ce logiciel, contactez les auteurs. Les scripts MED-PC sont inclus en tant que fichiers supplémentaires. Ce logiciel recueille des informations sur les réponses de l’animal pour chaque essai (quel levier est enfoncé, s’il est correct / incorrect / pas de réponse, et latence pour faire le choix). À partir de ces informations, les utilisateurs peuvent calculer diverses mesures dans le paradigme comportemental, comme décrit dans la section analyse comportementale. - Effectuer un entraînement / test à la même heure chaque jour pour contrôler les rythmes circadiens dans les hormones de stress32 (et d’autres mesures pertinentes).
- Remplissez le plateau inférieur de chaque boîte opérationnelle avec de la litière fraîche pour ramasser les matières fécales / déchets. Après chaque séance, jetez chaque plateau, nettoyez les plateaux et l’intérieur de la chambre avec des lingettes alcoolisées ou un désinfectant approuvé par l’IACUC, et remplacez-le par de la literie fraîche avant de placer un nouvel animal dans la chambre.
4. Procédures de stress
- Décider si la procédure de stress doit être effectuée avant, pendant et/ou après la formation sur le paradigme de changement de stratégie opérante (par exemple, 5 jours de stress de contention avant 3 jours de formation opérationnelle contre 3 jours de formation opérationnelle suivis d’une seule contrainte et d’un seul test).
- Exécutez la procédure de stress à la même heure tous les jours en ce qui concerne l’entraînement opérant. (p. ex., 30 min de contrainte à partir de 9 A.M., suivie d’un placement dans la chambre opérante).
- Effectuer les procédures de stress dans une pièce séparée de la salle de la colonie et des salles de paradigme de changement de stratégie (pour s’assurer qu’il n’y a pas de facteurs de confusion associés au stress du témoin)33. En bref, placez le rat dans un tube de retenue transparent de style Broome et scellez l’ouverture, en prenant soin de ne pas pincer les membres ou la queue. Entre chaque sujet, utilisez un désinfectant approuvé par l’IACUC pour nettoyer le tube de style Broome. Une désinfection inadéquate peut laisser des phéromones derrière elles qui peuvent nuire au protocole de test.
REMARQUE: Estimer combien de temps le premier groupe de rats passera dans les chambres opérantes. Cela variera en fonction de l’entraînement par rapport au jour du test; cependant, après avoir exécuté plusieurs cohortes, un temps moyen pour terminer chaque tâche afin d’estimer les tâches futures peut être calculé. - En fonction du nombre de chambres opérantes disponibles, échelonnez la procédure de contrainte pour les sujets. Par exemple, quatre rats subissent une contrainte de contention et sont placés dans quatre chambres opérantes. Une heure plus tard, quatre autres animaux subissent des procédures de stress à suivre par la chambre opérante.
5. Formation
REMARQUE: Ce paradigme est modifié à partir de la procédure opérante de décalage de jeu développée par Floresco et al. de sorte qu’il peut être complété en 3 jours19. Les procédures d’entraînement pour les rats nécessitent 3 jours (1 jour pour apprendre chaque tâche comme décrit ci-dessous). Il est rare qu’un rat n’apprenne pas ces tâches. Si un rat ne parvient pas à apprendre chaque tâche, il doit être exclu de l’étude finale. Voir la figure 1A pour une représentation visuelle du paradigme d’entraînement décrit ci-dessous.
- Avant de placer le rat dans la chambre, assurez-vous qu’il y a suffisamment de granulés de nourriture dans le distributeur et que les boîtes opérantes fonctionnent correctement. Pour ce faire, chargez et lancez un programme de formation ou de journée de test dans une chambre vide, en testant manuellement que le bon levier offre une récompense par pression de levier.
- Entraîner le rat à appuyer sur chaque levier
- Avant de placer le rat dans la boîte pour le premier jour de formation, placez manuellement une récompense de granulés alimentaires sur le bon levier, tel que désigné lors du chargement de la procédure d’entraînement dans chaque chambre.
- Entraînez le rat à l’aide d’un programme à rapport fixe (FR-1), de sorte que chaque pression de levier correcte soit récompensée par un renfort. Contrebalancer le bon levier par jour entre les sujets et/ou les conditions expérimentales (mise en forme d’un seul levier à la fois) en désignant le bon levier lors du chargement de la procédure d’entraînement sur l’ordinateur faisant fonctionner les chambres.
- Laissez le rat appuyer sur le levier jusqu’à ce qu’il atteigne le critère en appuyant sur le bon levier 50x, en effectuant généralement la tâche entre 30 et 45 minutes.
- Le lendemain, forcez le rat à effectuer cette tâche sur le levier opposé en utilisant le même programme que le premier jour d’entraînement, mais désignez le levier opposé comme le bon. Il n’est pas nécessaire de « façonner » le levier avec une pastille alimentaire en ce jour de formation. Typiquement, ce critère est rapidement acquis après que les rats ont appris à appuyer sur le premier levier.
- Entraîner le rat à répondre au signal lumineux
- Le troisième jour d’entraînement, allumez la lumière au-dessus des deux leviers pendant 15 essais, au cours desquels le rat peut appuyer sur l’un des leviers pour potentiellement recevoir une récompense de granulés alimentaires. Au cours de la tâche de discrimination de la lumière, ce programme sélectionnera au hasard quel levier est correct essai par essai.
- Si le rat appuie sur le bon levier, assurez-vous que les lumières restent allumées pendant 3 s et que la récompense est livrée, suivie d’une période de 5 s, pendant laquelle les lumières sont éteintes avant le prochain essai. Si le rat appuie sur le levier incorrect, assurez-vous qu’aucune récompense n’est livrée et que les lumières sont éteintes pendant 10 s avant le prochain essai.
- Après cette dernière journée d’entraînement, calculez le « biais latéral » pour déterminer si le rat a une préférence pour le levier gauche ou droit en divisant le nombre de pressions d’un levier divisé par le nombre total de pressions à levier. Le jour du test, le rat commencera de son côté le moins préféré pour s’assurer qu’il apprend la contingence spécifique réponse-récompense, plutôt que de répondre à un levier préféré.
6. Essais
REMARQUE : Voir la figure 1B pour une représentation visuelle du paradigme de test décrit ci-dessous.
- Le jour 4 (jour du test), placez le rat dans la chambre opérante en suivant les procédures de contrainte et testez-le dans les tâches de discrimination latérale, d’inversion latérale et de discrimination légère en série. Assurez-vous que la tâche de discrimination de la lumière n’éclaire que la lumière au-dessus du levier « correct ». Dans chaque tâche, les rats doivent réaliser consécutivement huit essais corrects pour compléter chaque discrimination sans appuyer sur le levier incorrect non récompensé. Une pression incorrecte sur le levier réinitialisera cette chaîne d’essais.
- Testez les rats à l’aide de la tâche de discrimination latérale. En utilisant le programme de discrimination latérale, récompensez le rat pour avoir appuyé sur le levier de son côté le moins préféré tel que déterminé à partir du troisième jour d’entraînement, quel que soit le signal lumineux. La tâche se termine en appuyant sur le levier correct 8x consécutivement (à l’exclusion des omissions).
- Effectuez le test d’inversion latérale en exécutant à nouveau des rats en utilisant le programme de discrimination latérale, mais cette fois en désignant le levier opposé au levier correct de la tâche de discrimination latérale comme correct. Assurez-vous que le rat est récompensé pour avoir appuyé sur ce levier, quel que soit le signal lumineux. La tâche se termine en appuyant sur le levier correct 8x consécutivement (à l’exclusion des omissions).
- Effectuez la tâche de discrimination de la lumière, qui récompense le rat pour avoir appuyé sur le levier avec la lumière allumée au-dessus. Chaque test opérationnel est terminé en appuyant sur le bon levier 8x consécutivement (à l’exclusion des omissions).
REMARQUE: Sur la base d’études antérieures, ces tâches codent un minimum de 30 essais, indépendamment des presses consécutives, pour s’assurer que les rats ont suffisamment de temps pour apprendre les règles de chaque tâche18. Ainsi, si le rat réalise consécutivement huit essais corrects avant que 30 essais n’aient eu lieu, la tâche restera engagée jusqu’à ce que 30 essais soient terminés.
7. Analyse comportementale
REMARQUE: Les données acquises pour chaque animal le jour du test sont automatiquement enregistrées et enregistrées par l’ordinateur, à condition qu’un script MED-PC pour chaque tâche ait été lancé et autorisé à être terminé (voir les documents supplémentaires pour les scripts MED-PC).
- Ouvrez les données de chaque tâche du jour de test (discrimination latérale, inversion latérale et discrimination de la lumière) à l’aide du programme informatique. Les principales mesures enregistrées par le programme sont les essais par critère, les erreurs de critère et le délai d’évaluation. Ces mesures sont décrites en détail ci-dessous.
REMARQUE: Les auteurs ont généré un script MATLAB qui permet l’automatisation du processus d’analyse ainsi que l’analyse des erreurs persévératives par rapport aux erreurs régressives (contactez les auteurs pour obtenir des informations sur le code afin de rationaliser l’analyse des données).- Utiliser les essais au critère (qui fait référence au nombre total d’essais [à l’exclusion des omissions] nécessaires pour que le rat termine consécutivement huit essais corrects, y compris ces huit essais) comme principal indicateur de précision. Ces données se trouvent dans la première colonne du tableau B dans un fichier de données généré par le script MED-PC pour l’une des tâches du jour du test.
- Examinez le nombre total d’erreurs commises au cours de chaque tâche. Ces données se trouvent dans la troisième colonne du tableau B dans un fichier de données généré par le script MED-PC pour l’une des tâches du jour du test. Ces erreurs sont également classées en erreurs persévérantes ou régressives. Des erreurs persévératives sont commises lorsque le rat continue de suivre la règle précédente de la tâche précédente. Des erreurs régressives sont commises après qu’elle se soit désengagée de la règle précédente mais continue d’essayer d’acquérir la nouvelle règle (pour plus de détails sur la façon dont ces types d’erreurs sont calculés, reportez-vous à la méthode publiée18).
- Si le rat n’a pas répondu à un signal lumineux dans les 15 s, l’essai est classé comme une omission, et il ne comptera pas dans le nombre total d’essais à critère. Calculez cela en additionnant d’abord le nombre de réponses correctes (situées dans la deuxième colonne du tableau B dans le fichier de données) et le nombre d’erreurs (situées dans la troisième colonne du tableau B dans le fichier de données). Ensuite, soustrayez ce nombre du nombre total d’essais au critère (il s’agit du dernier nombre de la première colonne du tableau B d’un fichier de données, différent des essais au critère).
- Utilisez les heures de début et de fin enregistrées par le programme (situées en haut d’un fichier de données généré par le script MED-PC pour l’une des tâches du jour du test) pour calculer le temps de mise en critère. La latence à la première pression du levier peut également être calculée à partir du fichier de données en soustrayant la variable K (temps écoulé en secondes à partir de la première pression sur le levier) du temps au critère.
- Faire la moyenne des données pour chaque mesure comportementale pour les rats du même groupe de traitement. Effectuer des analyses statistiques appropriées (selon le nombre de variables examinées).
8. Substrats cérébraux
- Déterminer une zone cérébrale intéressée et/ou un aspect de la flexibilité cognitive. Par exemple, si le stress augmente les erreurs de persévérance dans la tâche d’inversion latérale, le cortex orbitofrontal (OFC) peut être d’un intérêt particulier, car des études antérieures sur les lésions ont indiqué que cette région du cerveau joue un rôle dans de nombreuses formes d’apprentissage de l’inversion (c’est-à-dire l’inversion spatiale testée dans la tâche d’inversion latérale)34,35,36. Dans cet exemple, sacrifiez des rats une fois le paradigme de changement de stratégie terminé et examinez c-fos (mesure de l’activation neuronale37)dans l’OFC en utilisant les méthodes immunohistochimiques décrites25 et décrites brièvement ici.
- Tout d’abord, extrayez les cerveaux des animaux et coupez-les en tranches de 40 μm.
- Lavez les tissus dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 4x pendant 5 minutes chacun, puis incubez dans du peroxyde d’hydrogène à 0,3% pendant 10 min pour éteindre les peroxydases endogènes.
- Lavez les tissus dans pbS 2x pendant 5 minutes chacun, puis incubez dans l’anticorps primaire anti-c-fos de souris (1:500), 3% de sérum d’âne normal (NDS) et 0,3% de Triton X pendant la nuit.
- Le lendemain, lavez les tissus dans du PBS 3x pendant 5 min chacun, puis incubez dans un anticorps anti-souris conjugué à la biotine-SP (1:500) pendant 2 h.
- Laver les tissus dans PBS 3x pendant 5 min chacun, puis incuber dans le complexe avidine-streptavidine AB pendant 1 h.
- Laver les tissus dans PBS 3x pendant 5 minutes chacun, puis incuber dans une solution DAB jusqu’à 10 minutes lorsque les tissus subissent une réaction chromogène d’oxydation.
- Lavez les tissus dans PBS 3x pendant 5 minutes chacun, puis montez les tranches de cerveau sur des lames de microscope en verre.
- Couvrez le tissu à l’aide d’un support de montage à base de toluène et une image à l’aide d’un microscope à fond clair.
REMARQUE: Ici, comme le reflètent les résultats représentatifs, les rats sont sacrifiés 30 minutes après la fin du paradigme de changement de stratégie, environ 60 à 90 minutes après la fin de la tâche d’inversion (en fonction de la performance de chaque rat dans la tâche légère). Cela devrait représenter un timing optimal pour l’expression c-fos38, reflétant les performances dans la tâche d’inversion.
- Alternativement, canulez une zone spécifique du cerveau pour l’injection de drogue ou l’injection virale avant l’exécution du stress ou le paradigme de changement de stratégie opérante.
REMARQUE: Les chercheurs voudront peut-être examiner comment la manipulation des substrats neuronaux modifie les effets du stress sur la flexibilité cognitive. Par exemple, les chercheurs peuvent bloquer un récepteur de neurotransmetteur particulier dans le cortex préfrontal avant le test.
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Representative Results
Le paradigme de changement de stratégie d’opération automatisé adapté décrit ci-dessus a été utilisé pour déterminer si le stress de contention répété affecte la cognition chez les rats Sprague Dawley mâles et femelles. Les données comportementales représentatives sont décrites à la figure 2 ci-dessous. En bref, les rats de contrôle et retenus à plusieurs reprises ont effectué ce test de changement de stratégie opérant, qui consistait en une série de tâches: discrimination latérale, inversion latérale et discrimination de la lumière.
Les essais aux critères pour chaque tâche sont illustrés à la figure 2A. En règle générale, une meilleure performance sur chaque tâche était représentée par un nombre réduit d’essais au critère. Ces données indiquent qu’à la suite d’une contention aiguë, les hommes ont effectué la tâche d’inversion latérale dans beaucoup moins d’essais que les hommes témoins non stressés. Inversement, les femmes stressées ont eu besoin d’un nombre significativement plus élevé d’essais pour terminer la tâche d’inversion latérale. Ces résultats suggèrent que les hommes ont montré une performance améliorée après le stress, tandis que les femmes ont montré des performances altérées. Dans la tâche de discrimination légère, le stress a augmenté le nombre d’essais par rapport aux femmes témoins, ce qui a nui aux performances des femmes, mais pas des hommes dans cette tâche.
Le nombre total d’erreurs commises pour chaque tâche d’attention est illustré à la figure 2B. Conformément au nombre d’essais par rapport au critère, les hommes stressés ont fait beaucoup moins d’erreurs que les hommes témoins, tandis que les femmes stressées ont fait plus d’erreurs dans la tâche d’inversion latérale. En outre, dans la tâche de discrimination légère, les femmes ont également commis beaucoup plus d’erreurs. En résumé, ces données suggèrent que le stress répété améliore les performances cognitives chez les hommes, mais altère les performances cognitives chez les femmes.
Les erreurs totales ont ensuite été classées en erreurs persévérantes ou régressives à la figure 2C (pour une distinction entre ces deux types d’erreurs, reportez-vous à la section 7 du protocole). Fait intéressant, les hommes stressés ont commis moins d’erreurs persévérantes dans la tâche d’inversion latérale que les hommes témoins. D’autre part, tant dans les tâches d’inversion latérale que dans les tâches de discrimination légère, les femmes stressées ont commis un plus grand nombre d’erreurs de persévérance que les femmes témoins. Il n’y avait aucune différence entre les groupes de traitement dans le nombre d’erreurs régressives commises au cours de l’une ou l’autre tâche.
Les omissions dans chaque essai et le critère de temps d’accès sont illustrés à la figure 2D (pour plus d’informations sur la façon dont ils ont été calculés, reportez-vous à la section 7 duprotocole). Ces mesures ont été évaluées uniquement dans le cadre de la tâche d’inversion latérale, car cette tâche présentait les plus grandes différences entre les sexes. Les femmes stressées ont fait un pourcentage plus élevé d’omissions par rapport à tous les autres groupes de traitement. En outre, alors que le stress semblait diminuer le temps d’exécution de la tâche d’inversion latérale chez les hommes, le stress prolongeait l’achèvement de la tâche chez les femmes. En résumé, le stress répété a altéré la flexibilité cognitive chez les femmes, mais pas chez les hommes.
Les substrats cérébraux sous-jacents à la flexibilité cognitive sont représentés à la figure 3. Comme des différences marquées entre les sexes ont été observées dans la tâche d’inversion latérale, les zones du cerveau sous-jacentes à cette tâche ont été examinées pour déterminer si elles présentaient des différences similaires entre les sexes dans l’activité neuronale. Comme discuté précédemment, des études sur les lésions ont indiqué que le cortex orbitofrontal (OFC) médère la tâche d’inversion latérale34. Ainsi, c-fos, une mesure de l’activation neuronale37, a été étiqueté dans l’OFC à 30 min après la fin du changement de stratégie, ce qui aurait dû refléter les performances dans la tâche d’inversion latérale38. Toutefois, il est possible que l’OFC joue également un rôle dans la composante de changement de stratégie extradimensionnelle de cette tâche39. Ainsi, il est important d’effectuer le sacrifice au moment opportun pour refléter l’activité cérébrale au cours d’une tâche particulière dans le paradigme de changement de stratégie opérante. Ici, le stress a induit une augmentation significative de l’activation neuronale dans l’OFC des hommes par rapport auxtémoins. Cependant, le stress a induit une diminution significative de l’activation neuronale dans l’OFC des femmes par rapport aux témoins. De plus, chez les hommes, l’activation de l’OFC et les essais au critère étaient négativement corrélés ; plus précisément, une activation plus élevée de l’OFC était associée à moins d’essais par critère. En revanche, il n’y avait aucune corrélation entre l’activation de l’OFC et la performance chez les femmes, ce qui suggère que l’OFC a été désengagé pendant ces performances.
Figure 1: Schéma de la stratégie opérante changeant de paradigme pendant les journées de formation et de test. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Données comportementales représentatives provenant d’un changement de paradigme de stratégie opérante. (A) Essais à critère pour chaque tâche le jour du test. Dans la tâche d’inversion latérale, le stress a amélioré les performances chez les hommes, mais a altéré les performances chez les femmes. Dans la tâche de discrimination légère, le stress a affaibli les performances chez les femmes, alors qu’il n’a pas affecté les hommes. (B) Nombre d’erreurs pour chaque tâche le jour du test. Le stress a réduit le nombre d’erreurs commises chez les hommes, mais a augmenté les erreurs chez les femmes dans les tâches d’inversion latérale et de discrimination légère. (C) Catégorisation persévérative et régressive des erreurs. Le stress a diminué les erreurs de persévérance commises chez les hommes, mais a augmenté les erreurs de persévérance commises chez les femmes dans les tâches d’inversion latérale et de discrimination légère. (D) Pourcentage d’essais omis et délai jusqu’au critère dans la tâche d’inversion latérale. Le stress a augmenté le pourcentage d’omissions chez les rats femelles. Le stress a diminué le temps requis par les hommes, mais a augmenté le temps requis par les femmes pour accomplir la tâche. Les statistiques ont été calculées à l’aide de l’ANOVA bidirectionnelle suivie du test t de Tukey (n = 12 rats par groupe; les barres d’erreur représentent le SEM; #p ≤ 0,10, *p < 0,05). Ce chiffre a été modifié par rapport à une publication précédente17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Activation neuronale représentative après un changement de paradigme de stratégie opérante. (A) Activation de l’OFC après une tâche de changement de stratégie. Images représentatives de la coloration immunohistochimique de la 3,3'-diaminobenzidine (DAB) à l’aide d’un anticorps contre le c-fos dans l’OFC visualisées à l’aide de la microscopie à fond clair, puis quantifiées. Le stress a significativement augmenté l’activation (démontrée par le nombre de cellules exprimant c-fos) dans l’OFC des hommes, tandis qu’il a diminué l’activation chez les femelles. La barre d’échelle dans le panneau d’image en bas à droite représente 200 μm. Les statistiques ont été calculées à l’aide de l’ANOVA bidirectionnelle suivie du test t de Tukey (n = 12 rats par groupe, 6 à 8 sections d’OFC analysées par rat; les barres d’erreur représentent le SEM; *p < 0,05). (B) Essais au critère dans la tâche d’inversion latérale corrélés avec l’activation de l’OFC. Les hommes ont montré une corrélation négative significative, contrairement aux femmes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole montre comment mesurer les effets du stress sur la fonction cognitive. Plus précisément, un paradigme de changement de stratégie opérant modifié est utilisé chez les rongeurs, qui mesure la flexibilité cognitive (analogue à la tâche de tri des cartes du Wisconsin chez l’homme)1. La flexibilité cognitive désigne la capacité d’adapter les stratégies de traitement cognitif pour faire face à de nouvelles conditions dans l’environnement, et elle est cruciale pour le fonctionnement quotidien normal2. Comme les études humaines sur la flexibilité cognitive se limitent principalement à l’imagerie cérébrale11,l’utilisation de ce paradigme chez les animaux fera grandement progresser la compréhension des effets du stress sur le cerveau et la cognition.
Le stress peut altérer la fonction cognitive40. En fait, c’est l’un des phénotypes les plus courants dans les maladies liées au stress telles que le SSPT et leTDM 3,41. De plus, il existe des différences marquées entre les sexes dans l’apparition de maladies psychiatriques liées au stress5,6,7, mais il y a peu de compréhension de la neurobiologie derrière ces incidences biaisées. Ainsi, l’utilisation de cette stratégie opérante changeant de paradigme chez les animaux des deux sexes peut aider à faire progresser la compréhension actuelle des différences entre les sexes en psychiatrie.
Cette tâche de changement de stratégie opérante permet aux chercheurs d’examiner les aspects clés de la cognition pertinents pour les troubles psychiatriques. Par exemple, les erreurs persévératives après manipulation expérimentale sont calculées dans ce paradigme. La persévérance est observée dans les troubles psychiatriques liés au stress tels que le SSPT, et elle nuit à la capacité de quelqu’un à apprendre un nouvel ensemble de règles, altérant finalement la mémoire de travail3. Ainsi, la mesure des erreurs persévératives est pertinente sur le plan de la traduction. De plus, des omissions dans les tâches d’attention ont été notées chez les patients atteints de SSPT, indiquant un traitement cortical plus lent3. En conséquence, les données d’omission de ce paradigme peuvent avoir des contreparties cliniques. En somme, la flexibilité cognitive mesurée comme par ce paradigme expérimental modélise les phénotypes clés qui sont observés dans les troubles psychiatriques.
Ce paradigme expérimental permet également de cibler avec précision les substrats neuronaux sous-jacents à la flexibilité cognitive. Par exemple, la littérature a indiqué que le cortex préfrontal (PFC) est une région cérébrale cruciale pour la flexibilité cognitive3, y compris le cortex préfrontal médian (mPFC) et le cortex orbitofrontal (OFC). Parmi ces sous-régions du PFC, l’OFC est important pour la performance dans la tâche d’inversion latérale34,35. Ces zones du cerveau sont également des cibles clés pour les altérations fonctionnelles induites par le stress42,43. Fait intéressant, le modèle de stress utilisé ici semble jouer un rôle dans la performance ultérieure des rongeurs dans les tests de flexibilité cognitive; il devrait donc être pris en compte dans la conception des expériences futures. Ces réponses variables au stress indiquent des mécanismes potentiellement nouveaux par lesquels la cognition est affectée par le stress. Ainsi, le ciblage de neurotransmetteurs spécifiques, de protéines ou l’activation de ces régions du cerveau peut faire la lumière sur la façon dont le stress affecte la cognition chez les rongeurs masculins et féminins. Les chercheurs peuvent choisir de manipuler ces substrats neuronaux à différents moments en conjonction avec le stress ou le changement de stratégie, ou bien mesurer les substrats neuronaux après l’exposition à ces paradigmes comportementaux.
Cette tâche de changement de stratégie opérationnelle modifiée présente des avantages évidents par rapport à d’autres paradigmes de flexibilité cognitive utilisés dans la littérature sur le stress (c’est-à-dire la tâche de creusement12,13,14,15), qui nécessitent plus de temps et d’efforts de la part de l’expérimentateur pour entraîner les rongeurs. Cette procédure nécessite une surveillance minimale de la part de l’expérimentateur et permet de tester plusieurs rats simultanément. De plus, contrairement aux autres versions de cette tâche automatisée19,le paradigme ne nécessite que 3 jours de formation et comprend une analyse de données programmée efficace.
Le paradigme de changement de stratégie opérant a certaines limites. Une limitation est qu’il ne peut tester que deux dimensions de stimulus (par exemple, levier gauche ou droit vs signal lumineux), tandis que la tâche de creusement12,13,14,15 peut tester une troisième dimension de stimulus (par exemple, creuser un média vs odeur vs texture). Cependant, la tâche décrite dans ce protocole permet toujours de tester la capacité du rat à passer à des règles différentes, ce qui permet de tester les constructions de flexibilité cognitive. De plus, il est possible d’ajouter d’autres paramètres aux chambres de fonctionnement pour permettre un troisième stimulus (par exemple, une odeur), mais cela peut prolonger l’entraînement requis pour la tâche.
Le principal avantage de cette tâche est sa simplicité et sa capacité à l’associer à des manipulations stressantes ou pharmacologiques pour mieux comprendre comment le stress affecte le cerveau. Il convient de noter que cette simplicité s’accompagne d’une difficulté accrue à laquelle les sujets sont confrontés lorsqu’ils apprennent à tirer parti de la presse, par rapport à la tâche de creusement écologiquement pertinente. Bien que cette tâche opérationnelle soit beaucoup moins exigeante en main-d’œuvre, les rongeurs auront généralement besoin de plus d’essais pour acquérir cette tâche. Cependant, la tâche de creusement et ce paradigme engagent des mécanismes neurobiologiques similaires et représentent donc des options valables pour l’examen de la flexibilité cognitive16,44. Bien qu’il y ait eu des résultats variés dans la littérature concernant les effets du stress sur la flexibilité cognitive en utilisantla tâche de creusement et cette procédure opérante23,25 , 27,45,46, la méthode présentée reflète les effets complexes que le type, l’intensité et la durée d’un facteur de stress peuvent avoir sur la fonction cognitive20,21.
Une autre limitation de la tâche est que les rongeurs sont logés dans des boîtes opaques fermées; ainsi, les comportements autres que ceux qui sont collectés via l’interface de l’ordinateur ne peuvent pas être codés. Par exemple, un nombre élevé d’omissions par un rat peut être dû à une inhibition comportementale infligée par le stress, ou parce que le rat est endormi. De plus, d’autres comportements stéréotypés, tels que le toilettage (qui est particulièrement pertinent dans l’étude du stress), peuvent être intéressants à analyser pendant la tâche. Le montage de caméras dans des chambres de fonctionnement peut permettre ce type de précision comportementale.
Dans l’ensemble, ce rapport détaille l’utilisation de procédures de stress en conjonction avec une stratégie opérante changeant de paradigme pour mieux comprendre comment le stress affecte le cerveau. Il convient de noter qu’en plus des procédures de stress et de l’évaluation cognitive chez les adultes, la recherche sur les différents stades de développement peut fournir des informations cruciales sur l’étiologie de l’inflexibilité cognitive. En plus d’étudier les effets du stress sur la flexibilité cognitive, ce paradigme de changement de stratégie opérant simple et efficace peut être associé à de nombreuses manipulations expérimentales pour étudier comment le cerveau s’adapte aux environnements changeants. De plus, d’autres approches expérimentales peuvent être utilisées pour étudier la base neuronale de la flexibilité cognitive, y compris les lésions, la pharmacologie, l’édition de gènes et l’électrophysiologie. Comme l’inflexibilité cognitive est l’un des phénotypes clés dans les maladies psychiatriques, davantage de recherches doivent être menées pour mieux comprendre ses substrats neurobiologiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Hannah Zamore, Emily Saks et Josh Searle pour leur aide dans l’établissement de ce paradigme de changement de stratégie opérant dans le laboratoire Grafe. Ils remercient également Kevin Snyder pour son aide avec le code MATLAB pour l’analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 inch glass pipette eye droppers | Amazon | 4306-30-012LC | For vaginal lavage |
| Alcohol Wipes | VWR | 15648-990 | To clean trays in set shifting boxes between rats |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse lgG (H+L), minimal cross reaction to bovine, chicken, goat, guinea pig, hamster, horse, human, rabbit, sheep serum proteins | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | All other DAB protocol staining materials are standard buffers/DAB and are not specified here, as this is not the main focus of the methods paper |
| C-fos mouse monoclonal primary antibody | AbCam | ab208942 | To stain neural activation in brain areas after set shifting |
| Dustless Food Pellets | Bio Serv | F0021 | For set shifting boxes (dispenser for reward) |
| GraphPad Prism | Used for data analysis | ||
| Leica DM4 B Microscope and associated imaging software | Leica | Lots of different parts for the microscope and work station, for imaging lavage and/or cfos | |
| MatLab | Software; code to help analyze set shifting data, available upon request. | ||
| Med-PC Software Suite | Med Associates | SOF-736 | Software; uses codes to operate operant chambers |
| Operant Chambers | Med PC | MED-008-B2 | Many different parts for the chamber set up and software to work with it; we also wrote a separate code for set shifting, available upon request. |
| Rat Bedding | Envigo | T.7097 | |
| Rat Chow | Envigo | T.2014.15 | |
| Restraint Devices | Bryn Mawr College | Made by our shop | For stress exposure; specifications available upon request. |
| Scribbles 3d fabric paint | Amazon | 54139 | For vaginal lavage |
| Sprague Dawley Rats | Envigo | At least D65 Males and Females | |
| VWR Superfrost Plus Micro Slide | VWR | 48311-703 | For vaginal lavage and/or brain slices/staining for c-fos |
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