Summary
Dit protocol beschrijft de beoordeling van de subcellulaire compartimentspecifieke redox-status in de cel. Een redoxgevoelige fluorescerende sonde maakt een handige ratiometrische analyse in intacte cellen mogelijk.
Abstract
Het meten van de intracellulaire oxidatie/reductiebalans geeft een overzicht van de fysiologische en/of pathofysiologische redox-status van een organisme. Thiolen zijn vooral belangrijk voor het verlichten van de redox-status van cellen via hun verminderde dithiol en geoxideerde disulfide ratio's. Engineered cysteïne-bevattende fluorescerende eiwitten openen een nieuw tijdperk voor redox-gevoelige biosensoren. Een van hen, redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten (roGFP), kan gemakkelijk worden geïntroduceerd in cellen met adenovirale transductie, waardoor de redox-status van subcellulaire compartimenten kunnen worden geëvalueerd zonder cellulaire processen te verstoren. Verminderde cysteines en geoxideerde cystines van roGFP hebben excitatie maxima op respectievelijk 488 nm en 405 nm, met emissie op 525 nm. Door de verhoudingen van deze verlaagde en geoxideerde vormen te beoordelen, kan de balans van redox in de cel gemakkelijk worden berekend. In deze methode artikel, vereeuwigd menselijke drievoudige negatieve borstkankercellen (MDA-MB-231) werden gebruikt om redox status te beoordelen binnen de levende cel. De protocolstappen omvatten MDA-MB-231 cellijntransductie met adenovirus om cytosolische roGFP uit te drukken, behandeling met H2O2, en beoordeling van cysteïne en cystineverhouding met zowel stroomcytometrie als fluorescentiemicroscopie.
Introduction
Oxidatieve stress werd gedefinieerd in 1985 door Helmut Sies als "een verstoring in prooxidant-antioxidant evenwicht ten gunste van de eerste"1, en een overvloed aan onderzoek is uitgevoerd om ziekte-, voeding-, en veroudering-specifieke redox status van organismen1,2,3te verkrijgen . Sindsdien is het begrip van oxidatieve stress breder geworden. Het testen van de hypothesen van het gebruik van antioxidanten tegen ziekten en/of veroudering heeft aangetoond dat oxidatieve stress niet alleen schade veroorzaakt, maar ook andere rollen in cellen heeft. Bovendien hebben wetenschappers aangetoond dat vrije radicalen een belangrijke rol spelen bij signaaltransductie2. Al deze studies versterken het belang van het bepalen van de veranderingen in de reductie-oxidatie (redox) verhouding van macromoleculen. Enzymactiviteit, antioxidanten en/of oxidanten en oxidatieproducten kunnen met verschillende methoden worden beoordeeld. Onder deze, methoden die thiol oxidatie te bepalen zijn misschien wel de meest gebruikte omdat ze rapporteren over de balans tussen antioxidanten en prooxidanten in cellen, evenals organismen4. Specifiek worden verhoudingen tussen glutathion (GSH)/glutathione disulfide (GSSG) en/of cysteïne (CyS)/cystine (CySS) gebruikt als biomarkers voor het monitoren van de redoxstatus van organismen2.
Methoden die worden gebruikt voor het testen van de balans tussen prooxidanten en antioxidanten zijn voornamelijk afhankelijk van de niveaus van verminderde / geoxideerde eiwitten of kleine moleculen in cellen. Westerse vlekken en massaspectrometrie worden gebruikt om de verhoudingen van verminderde/geoxideerde macromoleculen (eiwit, lipiden enz.) breed te beoordelen, en GSH/GSSG-verhoudingen kunnen worden beoordeeld met spectrofotometrie5. Een gemeenschappelijk kenmerk van deze methoden is de fysieke verstoring van het systeem door cellyse en/of weefselhomogenisatie. Deze analyses worden ook uitdagend wanneer het nodig is om de oxidatiestatus van verschillende cellulaire compartimenten te meten. Al deze verstoringen veroorzaken artefacten in de testomgeving.
Redox-gevoelige fluorescerende eiwitten openden een gunstig tijdperk voor het evalueren van de redoxbalans zonder een verstoring in de cellen6te veroorzaken. Ze kunnen zich richten op verschillende intracellulaire compartimenten, waardoor de kwantificering van compartimentspecifieke activiteiten (bijvoorbeeld de redoxtoestand van mitochondriën en de cytosol) kan worden geflankeerd om kruisspraak tussen cellulaire organellen te onderzoeken. Geel fluorescerend eiwit (YFP), groen fluorescerend eiwit (GFP) en HyPeR-eiwitten worden beoordeeld door Meyer en collega's6. Onder deze eiwitten is redox-gevoelige GFP (roGFP) uniek vanwege verschillende fluorescerende uitlezingen van zijn CyS (ex. 488 nm/em. 525 nm) en CySS (ex. 405 nm/525 nm) residuen, waardoor ratiometrische analyse mogelijk is, in tegenstelling tot andere redoxgevoelige eiwitten zoals YFP7,8. Ratiometrische output is waardevol omdat het een tegenwicht biedt aan de verschillen tussen expressieniveaus, detectiegevoeligheden en photobleaching8. Subcellulaire compartimenten van cellen (cytosol, mitochondriën, kern) of verschillende organismen (bacteriën en zoogdiercellen) kunnen worden gericht door roGFP7,9,10te wijzigen .
roGFP-testen worden uitgevoerd met behulp van fluorescerende beeldvormingstechnieken, vooral voor real-time visualisatie-experimenten. Flow cytometrische analyses van roGFP's zijn ook mogelijk voor experimenten met vooraf bepaalde tijdstippen. Het huidige artikel beschrijft zowel het gebruik van fluorescerende microscopie als stroomcytometrie om een ratiometrische beoordeling van de redox-toestand in zoogdiercellen uit te voeren die roGFP (gericht op cytosol) via adenovirale transductie overpreiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor 70%-80% confluent MDA-MB-231 cellen. Voor andere cellijnen moet het aantal cellen en de veelheid van infectie (MOI) opnieuw worden geoptimaliseerd.
1. Bereiding van cellen (dag 1)
- Houd de MDA-MB-231 cellijn in 75 cm2 kolven met 10 mL gemodificeerd Eagle medium (DMEM) van Dulbecco aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2.
OPMERKING: DMEM aangevuld met 10% FBS, 37 °C en een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer worden gebruikt voor alle bevestigings- en behandelings incubaties in het gehele protocol. - Bereid de MDA-MB-231 cellen voor op experiment.
- Aspiraat het medium in de kolf, los de cellen met 2 mL van 0,25% trypsine-EDTA oplossing voor 2 min, en inactiveren de trypsine activiteit met 6 mL van het volledige medium (DMEM met 10% FBS). Centrifugeer de cellen op 150 x g gedurende 5 min. Aspirate de supernatant en schort de cellen op in 5 mL van volledig medium.
- Meng een gelijke volume cel suspensie en 0,4% trypan blauw. Neem 10 μL van dit mengsel en tel de cellen met de geautomatiseerde celteller.
LET OP: Een Coulter teller of een hemocytometer kan ook worden gebruikt voor het tellen van cellen. - Zaad de cellen in een 6 put plaat voor flow cytometrie analyses en zaad 150.000 cellen in 1 mL van medium per put. Wacht 16 uur op celbevestiging.
- Zaad de cellen in een 4 put kamer dia voor fluorescerende beeldvorming en zaad 25.000 cellen in 0,5 mL van medium per put. Wacht 16 uur op celbevestiging.
LET OP: Zaadcontroleputten naast de behandelingsputten. Gebruik een van de controleputten om het celnummer te bepalen (optioneel: als de bevestigingsperiode voor de cellen korter is dan de verdubbelingstijd, kan worden aangenomen dat het celnummer hetzelfde is als de zaaidichtheid) en de andere voor een niet-geïnfecteerde controle (0 MOI).
2. Adenovirale roGFP-transductie (dag 2 en 3)
LET OP: Adenovirussen kunnen ziekten veroorzaken. Gebruik tijdens het transduceren van de cellen gefilterde tips en ontsmettingstips, Pasteurpipettes en microcentrifugebuizen met 10% bleekmiddel.
OPMERKING: Dit protocol werd gedemonstreerd met cytosol-specifieke roGFP, maar andere cellulaire compartimenten (bijvoorbeeld mitochondriën of mitochondriale intermembrane ruimte) kunnen worden gericht met dit zelfde protocol.
- Een dosisresponscurve genereren voor het MOI om de hoogste transductie-efficiëntie te verkrijgen door het volume van het adenovirus (mL) te berekenen dat nodig is voor elke MOI-waarde voor MDA-MB-231-cellijn(tabel 1):
OPMERKING: Functionele titer van elke partij adenovirale voorraad, die wordt uitgedrukt als plaquevormende eenheid (PFU) per mL, wordt geleverd door het bedrijf. De optimale MOI voor transductie verschilt tussen celtypen. Voor de meeste zoogdiercellen ligt het optimale MOI-bereik tussen de 10 en 300. Volgens de cellulaire respons moeten de MOI-waarden opnieuw worden berekend (bijvoorbeeld het MOI-bereik moet worden verminderd als cellen cytotoxische respons hebben of het bereik moeten worden verhoogd als cellen een lage transductie-efficiëntie hebben). - Maak 1:100 verdunning van 6 x 1010 PFU/mL adenovirale roGFP oplossing met celkweekmedium (DMEM met 10% FBS) voor betrouwbaar pipetten.
- Pipette en voeg 0,0125 mL (12,5 μL), 0,025 mL (25 μL), 0,05 mL (50 μL) van adenovirale roGFP verdunning toe in elke put van de 6 putplaat om de 150.000 cellen met 50 te herleiden, respectievelijk 100 en 200 MOI voor analyse van stroomcytometrie(tabel 1).
- Pipet en voeg 0,0042 mL (4.2 μL) adenovirale roGFP verdunning toe in de 4-kamer schuifputten om 25.000 cellen met 100 MOI voor fluorescentie beeldvorming(Tabel 1) te transduceren.
OPMERKING: Een minimale hoeveelheid medium moet worden gebruikt in de putten om de hoogste interactie tussen de adenovirale roGFP-constructie en cellen te garanderen. Het serumgehalte van het kweekmedium moet mogelijk worden verlaagd voor verschillende cellijnen, omdat hoge serumniveaus de transductie-efficiëntie in sommige celtypen negatief kunnen beïnvloeden. - Incubeercellen gedurende 16-24 uur onder de celonderhoudsomstandigheden. De volgende dag (dag 3), verander het medium naar cell cultuur medium (DMEM met 10% FBS) om celherstel toe te staan voor nog eens 24 uur. Visualiseer cellen onder een microscoop om hun morfologie te beoordelen; cellen kunnen roGFP uitdrukken, zelfs als ze morfologische veranderingen hebben.
OPMERKING: Op dag 3 moeten cellen roGFP gaan uitdrukken; daarom kan de transductie-efficiëntie worden gecontroleerd met behulp van fluorescentiemicroscopie (filters met ex. 488/em. 525). Om consistente testresultaten te verkrijgen, moet u zich bewust zijn van en de morfologische veranderingen onder de fasecontrastmicroscoop documenteren en morfologie observeren terwijl de transductie-efficiëntie wordt geëvalueerd. - Maak een dosisresponscurve aan de hand van de 50,100 en 200 MOI-monsters die in stap 2.3 zijn bereid en hun transductie-efficiëntieresultaten verkregen uit de analyse van stroomcytometrie (stappen 3.1 en 4.1). Beoordeel de optimale transductie-efficiëntie met documentatie van morfologische veranderingen (stap 2.5) en de dosisresponscurve van MOI.
OPMERKING: Hoewel meer dan 98% van de celpopulatie bij 100 MOI en 200 MOI express roGFP (zie representatieve resultaten), vertoonde 200 MOI-groep aanzienlijke veranderingen in de celmorfologie van MDA-MB-231 cellen. Bijgevolg werd vastgesteld dat de meest effectieve MOI voor MDA-MB-231 cellen 100 MOI was. - Na optimale MOI (hier, 100 MOI) werd gekozen voor MDA-MB-231 cellijn, uitvoeren experiment met testmaterialen (10 μM H2O2 en het voertuig 0,1% gedeïmiseerd water).
- Bereid en zaad de cellen volgens sectie 1. Met behulp van het adenovirale transductievolume voor 100 MOI berekend in stap 2.1, herhaal stappen 2.2−2.4 voor 100 MOI adenovirale transductie van cellen. Vervolgens incuberen de plaat en kamer dia's volgens stap 2.5.
3. Verwerving van CyS/CySS-saldo
- Stroomcytometrie (dag 4)
- Op dag 4 broeden cellen uit stap 2.7.1 met 10 μM H2O2 voor 1 uur.
OPMERKING: 10 μM H2O2 werd gebruikt als teststof en 0,1% gedeïïmiseerd water werd gebruikt als voertuigbehandeling in dit protocol. Andere oxiderende middelen kunnen hier als positieve controles worden gebruikt. - Aspirate media van de 6 putplaat, vervangen door 750 μL van 0,25% trypsin-EDTA oplossing en wacht 2 min voor cellen los te maken. Activeer trypsine met 2 mL compleet medium (DMEM met 10% FBS) en verzamel het volume in 15 mL conische buizen.
- Centrifugeren de buizen op 150 x g gedurende 5 minuten bij 4ºC. Gooi supernatant weg en schorst de cellen in 500 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Stap 3.1.3 herhalen
- Filter de celsuspensies in stroom cytometrie-compatibele buizen met behulp van 40 μm mesh. Houd de buizen op ijs en uit de buurt van het licht en volg stap 4.1 voor data-analyse.
- Op dag 4 broeden cellen uit stap 2.7.1 met 10 μM H2O2 voor 1 uur.
- Microscopische beeldvorming (dag 4)
- Behandel cellen op dag 4 met 10 μM H2O2, verwerf beelden onmiddellijk (tijdpunt 0) en 1 uur na de behandeling en volg stap 4.2 voor data-analyse.
4. Gegevensanalyse
- Flow cytometrie kwantificering
- Stel de flow cytometriemethode in voor 3 verschillende analyses via monsteracquisitiesoftware (zie Tabel van Materialen):forward scatter (FCS) op x-as en zijverstrooiing (SSC) op y-ass om de celgrootte en complexiteit van cellen te beoordelen (SSC kan worden gebruikt voor ruwe identificatie van dode en levende cellen); ex. 488 nm/em. 525 nm (fluoresceïne isothiocyanaat [FITC]) bandpassfilter op x-as en SSC op y-as om CyS-roGFP te beoordelen; ex. 405 nm/em. 525 nm (Brilliant Violet 510 [BV510]) bandpass filter op x-as en SSC op y-as om CySS-roGFP te beoordelen.
- Verwerf 0 MOI-controle en visualiseer cellen met voorbeeldacquisitiesoftware. Herhaal deze stap voor de resterende monsters (50, 100, 200 MOI-groepen en later op 10 μM H2O2 behandelde cellen en voertuig behandelde cellen). Sla de bestanden op voor gegevensanalyse.
- Open data-analysesoftware (zie Tabel van materialen)en open 0 MOI-voorbeeldbestand. Beoordeel de celpopulatie van belang (Poort 1). Stel de volgende gatings in om de achtergrondfluorescentie voor ex. 488 nm/em te minimaliseren. 525 nm (Poort 2) en ex. 405 nm/em. 525 nm (Gate 3) bandpass filters met de niet-geïnfecteerde (0 MOI) controlecellen.
- Open 50, 100 en 200 MOI-voorbeeldbestanden in data-analysesoftware om de dosisresponscurve te beoordelen. Analyseer gemiddelde fluorescentieintensiteiten met Gates 2 en 3 voor elk monster. Herhaal deze stap voor testmonsters (10 μM H2O2 behandelde cellen en met voertuigen behandelde cellen).
- Bereken de gemiddelde fluorescerende intensiteitsverhouding tussen geoxideerde versus gereduceerde vormen van roGFP met de volgende vergelijking.
- Beeldbeoordeling
- Gebruik een microscoop die fluorescentiefilters bevat voor CyS-roGFP en CySS-roGFP (ex. 488 nm/em. 525 nm en ex. 405 nm/em. respectievelijk 525 nm filters).
- Kies in elke put van de kamerdia 4 willekeurige gebieden om afbeeldingen te verkrijgen, met behulp van de 4x doelstelling om grotere gebieden te visualiseren.
OPMERKING: 20x doelstelling kan ook worden gebruikt voor beelddisplays. - Open de afbeelding met ImageJ-software11. Analyse toepassen | Meet opdrachten voor elke afbeelding en gebruik de vergelijking in stap 4.1.5 om de gegevens te kwantificeren.
OPMERKING: Kwantificering van de afbeeldingen is ratiometrisch; Daarom omvat het protocol geen aftrekking van de achtergrond. Echter, om te kunnen beelden te vergelijken, helderheid, contrast, en verzadiging moet hetzelfde zijn voor elke afbeelding. Statistische significantie werd beoordeeld met eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) en de post hoc-test van Tukey.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De redoxtoestand van CyS/CySS is gemakkelijk te testen met getransduceerde roGFP's. De fluorescerende sonde kwantificeert de verhouding tussen de verlaagde en geoxideerde vormen (excitatiegolflengten respectievelijk 488 nm en 405 nm). Fluorescentie gegevens kunnen worden verkregen door zowel flow cytometrie en microscopie.
Een groot aantal cellen kan consequent en gemakkelijk worden verkregen met behulp van stroom cytometrie. De analyse bestaat uit 3 hoofdstappen: 1) selecteer de celpopulatie van belang met het FSC-gebiedsfilter (figuur 1A); 2) poort de roGFP-uitdrukkende cellen met ex. 488/em. 525 nm met een selectief bandpassfilter (figuur 1B); en 3) poort de geoxideerde roGFP-bevattende cellen uit de roGFP-uitdrukkende cellen met ex. 405 nm/em. 525 nm bandpassfilter (figuur 1C).
Elke nieuwe cellijn moet worden geëvalueerd op een optimale adenovirale transductie-efficiëntie van roGFP's. De transductie-efficiëntie moet worden beoordeeld met morfologische evaluatie van cellen en roGFP-expressieanalyses met stroomcytometrie en/of fluorescerende microscopie. Dit protocol maakt gebruik van stroomcytometrie om de dosisresponscurve voor roGFP-analyses te bepalen en om de meest efficiënte MOI-input te selecteren (figuur 2A−H). Volgens de MOI dosis-respons curve (Figuur 2I), 200 MOI gaf de hoogste roGFP expressie, maar celmorfologie werd beïnvloed, wat suggereert cytotoxiciteit. Daarom werd vastgesteld dat de optimale transductie-efficiëntie bij 100 MOI lag.
Om de effectiviteit van de methode te evalueren, werd H2O2 gebruikt als een positieve controle op oxidatie. Honderd MOI werd gebruikt voor een optimale transductie. Na de herstelperiode werden cellen behandeld met 10 μM H2O2 voor 1 uur om de fluorescentieverhouding via stroomcytometrie te verkrijgen. Geoxideerd (ex. 405 nm/em. 525nm) en verminderd (ex. 488 nm/em. 525 nm) roGFP gemiddelde fluorescentieintensiteiten werden verkregen uit stromingscytometrieanalyses voor voertuigbehandelingen (figuur 3A, B) en 10 μM H2O2 (figuur 3C, D) behandelingen. De bedekte histogrammen vertegenwoordigen de verschuiving in de celnummers van 10 μM H2O2 en voertuig behandelde groepen voor verminderd (figuur 3E) en geoxideerd (figuur 3F) roGFP. De verhouding tussen geoxideerde en verminderde roGFP toont aan dat 10 μM H2O2 een 3-voudige toename van oxidatie van roGFP veroorzaakte in vergelijking met voertuigbehandeling (figuur 3G).
Fluorescerende beeldvorming van cellen werd ook uitgevoerd met 10 μM H2O2 onder de microscoop voor 1 uur. Beelden werden genomen onder de 4x doelstelling, en representatieve beelden werden genomen onder de 20x doelstelling (Figuur 4A). Fluorescerende intensiteiten werden geëvalueerd met ImageJ-software en de verhoudingen werden berekend. Een gestage toename van H2O2-geïnduceerde oxidatie werd gedetecteerd (figuur 4B); incubatie met H2O2 voor 1 uur verhoogde de oxidatie van roGFP cysteines, die significante verandering tussen voertuigcontroles vertoonde.
Figuur 1: Gating setup voor fluorescerende intensiteiten van CyS-bevattende (gereduceerde) roGFP en CySS-bevattende (geoxideerde) roGFP-residuen met niet-doorgenoemde MDA-MB-231 cellen. (A) De celpopulatie van belang werd geselecteerd als Gate 1 met SSC- en FSC-gebiedsfilters. (B) roGFP-uitdrukkende cellen werden geselecteerd volgens niet-uitdrukkende cellen als Poort 2 met de ex. 488/em. 525 nm bandpassfilter. (C) Geoxideerde (cystine) roGFP-bevattende cellen werden omheind met de ex. 405 nm/em. 525 nm bandpass filter van de roGFP-uitdrukkende populatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: MOI dosis-respons curve beoordeling met flow cytometry analyses voor MDA-MB-231 cellijn. (A,B) Niet-geïnfecteerde cellen en (C,D) 50 MOI, (E,F) 100 MOI en (G,H) 200 MOI roGFP-uitdrukkende celpopulaties die respectievelijk voor gating setup zijn verworven. (I) Getransduceerde cellen werden geëvalueerd en uitgezet als een percentage op basis van de celpopulatie van belang. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Flow cytometriebeoordeling van CyS/CySS-balans in roGFP-getransduceerde MDA-MB-231-cellijn. Met voertuigen behandelde cellen werden beoordeeld als (A) % roGFP-uitdrukkende cellen, en (B) % geoxideerde roGFP-uitdrukkende cellen en H2O2-behandeling werden beoordeeld met dezelfde parameters in respectievelijk de panelen (C) en (D). Cel telling histogrammen van het voertuig en H2O2 behandeling werden bedekt voor (E) verminderd roGFP ex. 488/em. 525 bandpass filter en (F) geoxideerd roGFP ex. 405/em. 525 bandpass filter. (G) Gemiddelde fluorescentieintensiteitsverhoudingen tussen geoxideerde/gereduceerde vormen werden uitgezet in een staafgrafiek. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Fluorescerende beeldvorming van door roGFP-doorgetransduceerde MDA-MB-231. (A) Representatieve beelden na 1 uur behandeling met voertuig of H2O2. (B)De verhoudingen tussen geoxideerde/gereduceerde vormen werden geëvalueerd in 4 willekeurig gekozen gebieden en staven vertegenwoordigen gemiddelde ± standaarddeviatie. Statistische significantie tussen groepen die worden aangeduid als *(p < 0,05), **(p < 0,01) of ***(p < 0,005). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Analysetype | Celnummer per put | Adenovirale roGFP PFU/mL | 1:100 verdunning van adenovirale roGFP PFU/mL | Moi | Transductievolume (mL) |
| Stroomtritometrie | 150,000 | 6 x 1010 | 6 x 108 | 0 | 0 |
| 50 | 0.0125 | ||||
| 100 | 0.025 | ||||
| 200 | 0.05 | ||||
| Fluorescentiemicroscopie | 25,000 | 6 x 1010 | 6 x 108 | 100 | 0.0042 |
Tabel 1: Berekening van MOI-waarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De thiol/disulfide balans in een organisme weerspiegelt de redoxstatus van cellen. Levende organismen hebben glutathion, cysteïne, eiwittholen en thiolen met een laag moleculair gewicht, die allemaal worden beïnvloed door het oxidatieniveau en echo van de redoxstatus van cellen4. Engineered roGFP's maken de niet-verstorende kwantificering van het thiol/disulfide-saldo mogelijk via hun CyS-residuen7. De ratiometrische eigenschap van roGFP biedt betrouwbare redoxmetingen voor zoogdiercellen. roGFP kan gemakkelijk worden geïntroduceerd in cellen met transfectiemethoden en/of transductievectoren, maar adenovirale transductie heeft een hogere efficiëntie.
De redox-status van cellen wordt gemakkelijk beïnvloed door de cellulaire omgeving (bijvoorbeeld samenvloeiing van cellen en volume van het medium). Voor dit protocol werd vastgesteld dat de geoptimaliseerde celzaaivloeiing 60%-70% was, met 15.000 cellen per cm2; op de dag van de analyse waren de cellen 70%-80% samenvloeiend. De celmorfologie en de verdubbelingstijd verschillen echter tussen cellijnen. Om deze reden, als de onderzoeker van plan is om een andere cellijn te gebruiken, moet de celvloeiing worden aangepast tijdens het verwerven van metingen met stroomcytometrie en/of fluorescentiemicroscopie; dit zal zorgen voor nauwkeurige resultaten op basis van hun experimentele ontwerp en behoeften.
roGFP's kunnen eenvoudig worden geïntroduceerd in cellen met meerdere transfectiemethoden en/of transductievectoren. Het huidige protocol maakt gebruik van de cytosol-specifieke roGFP-constructie, die wordt omgezet in cellen met een adenovirus. Voordat u met een experiment begint, is het essentieel om de MOI-dosisrespons voor een cellijn te bepalen; dit maakt het mogelijk de maximale transductie-efficiëntie met minimale celtoxiciteit te bepalen om het optimale, reproduceerbare protocol te ontwerpen.
De CyS/CySS-status van roGFP-transduceerde cellen kan worden beoordeeld met zowel fluorescerende beeldvorming als stromingscytometrie. Beide analyses hebben hun voor- en nadelen; flow cytometrie maakt het mogelijk om een grotere celpopulatie snel te evalueren, maar fluorescentiebeeldvorming heeft een hogere gevoeligheid voor roGFP-specifieke cellen. Bovendien bevestigt het ook de juiste subcellulaire lokalisatie van GFP (bijvoorbeeld cytosolic versus mitochondriaal). Hier werden zowel flow cytometrie als fluorescerende beeldvorming gebruikt door de onderzoekers. Hoewel H2O2 wordt beschouwd als een zwak oxidant voor de roGFP-constructie7,toonde het protocol aan dat beide methoden gevoelig genoeg zijn om ratiometrische veranderingen tussen geoxideerde en verminderde vormen van roGFP na H2O2-behandeling te detecteren.
Dit roGFP-protocol kan worden gebruikt om de redoxstatus van verschillende zoogdierceltypen te bepalen. Om de door menadione geïnduceerde cardiomyocyte dood in het kader van prooxidant/antioxidantbalans te begrijpen, gebruikten Loor en collega's zowel cytosolische als mitochondriale roGFP-etikettering in cardiomyocyten12. roGFP maakt het mogelijk de redox-status van cellen te visualiseren terwijl ze in leven zijn, en de compartimentspecifieke targeting maakt een beter begrip van ziekten mogelijk. Esposito en collega's bekeken het gebruik van roGFP om de redoxstatus van cellen bij neurodegeneratieve ziekten te bepalen13. Omdat roGFP-transductie in verschillende organismen, waaronder planten14 en bacteriën9,gemakkelijk kan worden bereikt, kan het monitoren van de redox-status van zowel bacteriële als gastheercellen tijdens ziektetoestanden innovatieve behandelingsbenaderingen vergemakkelijken. Bovendien kunnen in vivo studies met compartimentspecifieke roGFP bij transgene dieren licht werpen op de redox-status van organismen15,16.
In bepaalde situaties is de roGFP-biosensor echter onvoldoende om fysiologisch relevante redoxveranderingen5 en H2O2 oxidatie7 in cellen te onderzoeken. Peroxidase selectiviteit voor H2O2 werd gebruikt om gevoeligere sondes te ontwerpen6. Gistperoxidase ORP1 was gekoppeld aan roGFP om de delicate meting van H2O2-gemedieerde thioloxidatie17,18,19. Evenzo controleert de integratie van menselijke glutaredoxine (Grx1) in de roGFP-sensor specifiek het GSH/GSSG-evenwicht in de celcompartimenten6,18,19.
Dit gemakkelijk toepasbare protocol stelt onderzoekers in staat om compartimentspecifieke redox-status in intacte cellen te controleren, waardoor artefactuele oxidatie als gevolg van fysieke stress tijdens celhomogenisatie tot een minimum wordt geminimaliseerd. Het huidige protocol toont 2 kwantificeringsmethoden aan: stromingscytometrie (gunstig voor snelle analyses van grote celpopulaties) en fluorescerende microscopie (waardoor continue time-lapse imaging mogelijk is en de morfologie van de cellen wordt bepaald).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De construct en recombinant adenovirus voor het uitdrukken van cytosol-specifieke roGFP in cellen werden gegenereerd in het laboratorium van Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University, en ViraQuest Inc, respectievelijk. Deze studie werd ondersteund door het Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy grant P20GM109005 via het NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program grant T32 GM106999, UAMS Foundation/Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor's Awards AWD00053484. De flow cytometry core faciliteit werd gedeeltelijk ondersteund door het Center for Microbial Pathogenese en Host Inflammatory Responses grant P20GM103625 via de COBRE NIGMS. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het NIH. ATA werd ondersteund door de Wetenschappelijke en Technologische Onderzoeksraad van Turkije (TUBITAK) 2214-A beurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | Cell culture |
| 4-well chamber slide | Thermo Scientific | 154526 | Cell seeding material for fluorescent imaging |
| 5 ml tubes with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Single cell suspension tube for flow cytometry analysis |
| 6-well plate | Corning | 353046 | Cell seeding material for flow cytometry analysis |
| 15 ml conical tubes | MidSci | C15B | Cell culture |
| 75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks | Corning | 4306414 | Cell culture |
| Adenoviral cytosol specific roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker |
| Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | Cell culture |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting |
| Countess cell counter chamber slides | Invitrogen | C10283 | Cell counting |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Cell culture |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 20 µl | Fisherbrand | 02-717-161 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl | Fisherbrand | 02-717-166 | Cell culture |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses |
| Fluorescent Microscope | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | Fluorescent imaging |
| Hydrogen Peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Positive control |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | Human epithelial breast cancer cell line |
| Microcentrifuge tubes, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Cell culture |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | Cell culture |
| Pipet controller | Drummond | Hood Mate Model 360 | Cell culture |
| Serologycal pipet, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Cell culture |
| Serologycal pipet, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Cell culture |
| Serologycal pipet, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Cell culture |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 incubator for cell culture |
| Trypan blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell counting |
References
- Sies, H. Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Jones, D. P.
- Pizzino, G., et al. Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).
- Go, Y. M., Jones, D. P. Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).
- Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).
- Meyer, A. J., Dick, T. P.
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Björnberg, O., Østergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).
- Bhaskar, A., et al. Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).
- Loor, G., et al. Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Loor, G., et al. Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis. Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).
- Esposito, S., et al. Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).
- Meyer, A. J., et al. Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer. Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).
- Galvan, D. L., et al. Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy. Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).
- Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology. Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).
- Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes. Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).
