Summary
Denne protokol beskriver vurderingen af subcellulær rumspecifik redox-status i cellen. En redox-følsom fluorescerende sonde muliggør praktisk ratiometrisk analyse i intakte celler.
Abstract
Måling af den intracellulære oxidations-/reduktionsbalance giver et overblik over en organismes fysiologiske og/eller patofysiologiske redox-status. Thioler er især vigtige for at oplyse redox status af celler via deres reducerede dithiol og oxideret disulfid nøgletal. Konstruerede cysteinholdige fluorescerende proteiner åbner en ny æra for redox-følsomme biosensorer. En af dem, redox-følsomme grønne fluorescerende protein (roGFP), kan nemt indføres i celler med adenoviral transduktion, så redox status subcellulære rum, der skal evalueres uden at forstyrre cellulære processer. Reducerede cysteiner og oxiderede cystiner af roGFP har excitationsmaksima ved henholdsvis 488 nm og 405 nm med en emission på 525 nm. En vurdering af forholdet mellem disse reducerede og oxiderede former gør det muligt at beregne redox-balancen i cellen. I denne metode artikel, udødeliggjort menneskelige triple-negative brystkræftceller (MDA-MB-231) blev brugt til at vurdere redox status i den levende celle. Protokoltrinnene omfatter MDA-MB-231 cellelinjetransduktion med adenovirus til ekspres cytosolroGFP, behandling med H2O2og vurdering af cystein- og cystinforholdet med både flowcytometri og fluorescensmikroskopi.
Introduction
Oxidativ stress blev defineret i 1985 af Helmut Sies som "en forstyrrelse i prooxidant-antioxidant balance til fordel for den tidligere"1, og en overflod af forskning er blevet udført for at opnå sygdom-, ernæring-, og aldring-specifikke redox status af organismer1,2,3. Siden da er forståelsen af oxidativstress blevet bredere. Test af hypoteser for at bruge antioxidanter mod sygdomme og / eller aldring har vist, at oxidativstress ikke kun forårsager skade, men også har andre roller i celler. Desuden har forskerne vist, at frie radikaler spiller en vigtig rolle for signaltransduktion2. Alle disse undersøgelser styrker betydningen af at bestemme makromolekylernes ændringsoxidationsforhold (redox). Enzymaktivitet, antioxidanter og/eller oxidanter, og oxidationsprodukter kan vurderes med forskellige metoder. Blandt disse, metoder, der bestemmer thiol oxidation er velsagtens den mest anvendte, fordi de rapporterer om balancen mellem antioxidanter og prooxidanter i celler, samt organismer4. Specifikt anvendes forholdet mellem glutathion (GSH)/glutathiondisulfid (GSSG) og/eller cystein (CyS)/cystin (CySS) som biomarkører til overvågning af redox-status for organismer2.
Metoder, der anvendes til at analysere balancen mellem prooxidanter og antioxidanter er hovedsageligt afhængige af niveauet af reducerede / oxiderede proteiner eller små molekyler i cellerne. Vestlige blots og massespektrometri anvendes til bredt at vurdere forholdet mellem reducerede/oxiderede makromolekyler (protein, lipider osv.), og GSH/GSSG-forhold kan vurderes med spektrofotometri5. Et fælles træk ved disse metoder er den fysiske ædering af systemet ved cellelysis og/eller vævshomogenisering. Disse analyser bliver også udfordrende, når det er nødvendigt at måle oxidationsstatus for forskellige cellulære rum. Alle disse forstyrrelser forårsage artefakter i analysen miljø.
Redox-følsomme fluorescerende proteiner åbnede en fordelagtig æra for vurdering af redox-balancen uden at forårsage forstyrrelse i cellerne6. De kan målrettes mod forskellige intracellulære rum, så kvantificering af rumspecifikke aktiviteter (f.eks. analyse af mitokondriers og cytosolens redox-tilstand) for at undersøge krydstale mellem cellulære organeller. Gult fluorescerende protein (YFP), grønt fluorescerende protein (GFP) og HyPeR-proteiner gennemgås af Meyer og kolleger6. Blandt disse proteiner er redox-følsomme GFP (roGFP) unik på grund af forskellige fluorescerende udlæsninger af dens CyS (ex. 488 nm/em. 525 nm) og CySS (ex. 405 nm/525 nm) rester, som tillader ratiometrisk analyse, i modsætning til andre redox-følsomme proteiner såsom YFP7,8. Ratiometrisk output er værdifuldt, fordi det opvejer forskellene mellem udtryksniveauer, detektionsfølsomheder og fotobleaching8. Subcellulære rum af celler (cytosol, mitokondrier, kerne) eller forskellige organismer (bakterier samt pattedyrceller) kan målrettes ved at ændre roGFP7,,9,10.
roGFP assays udføres ved hjælp af fluorescerende billeddannelse teknikker, især for real-time visualisering eksperimenter. Flow cytometriske analyser af roGFPs er også mulige for forsøg med forudbestemte tidspunkter. Den nuværende artikel beskriver både brugen af fluorescerende mikroskopi og flowcytometri til at udføre en ratiometrisk vurdering af redox-status i pattedyrceller, der overekspresser roGFP (målrettet til cytosol) via adenoviral transduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol blev optimeret til 70%-80% sammenflydende MDA-MB-231 celler. For andre cellelinjer skal antallet af celler og multipliciteten af infektion (MOI) genopfyldes.
1. Forberedelse af celler (dag 1)
- MDA-MB-231 cellelinje i 75 cm2 kolber med 10 ml Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS) ved 37 °C i en 5% CO2 befugtet atmosfære.
BEMÆRK: DMEM suppleret med 10% FBS, 37 °C, og en 5% CO2 befugtet atmosfære anvendes til alle fastgørelse og behandling inkubationer i hele protokollen. - Forbered MDA-MB-231-cellerne til eksperiment.
- Aspirere mediet i kolben, afmontere cellerne med 2 ml 0,25% trypsin-EDTA opløsning i 2 min, og inaktivere trypsinaktiviteten med 6 ml komplet medium (DMEM med 10% FBS). Cellerne centrifugeres ved 150 x g i 5 min. supernatanten aspireres, og cellerne suspenderes med 5 ml komplet medium.
- Bland en lige volumen celle suspension og 0,4% trypan blå. Tag 10 μL af denne blanding og tæl cellerne med den automatiserede celletæller.
BEMÆRK: En Coulter-tæller eller et hæmocytometer kan også bruges til celletælling. - Cellerne frøs til en 6 brøndplade til flowcytometrianalyser og frø 150.000 celler i 1 ml medium pr. brønd. Vent 16 timer for celletilbehør.
- Cellerne frøs til et 4-brønds kammerslid for fluorescerende billeddannelse og frø 25.000 celler i 0,5 ml medium pr. brønd. Vent 16 timer for celletilbehør.
BEMÆRK: Seed kontrol brønde ud over behandling brønde. Brug en af kontrolbrøndene til at bestemme cellenummer (valgfrit: Hvis fastgørelsesperioden for cellerne er kortere end fordoblingstiden, kan cellenummeret antages at være det samme som seedingtætheden) og den anden for en ikke-inficeret kontrol (0 MOI).
2. Adenoviral roGFP transduktion (dag 2 og 3)
FORSIGTIG: Adenovirus kan forårsage sygdomme. Mens transducing cellerne, bruge filtrerede tips og dekontaminere tips, Pasteur pipetter, og mikrocentrifuge rør med 10% blegemiddel.
BEMÆRK: Denne protokol blev demonstreret med cytosol-specifikke roGFP, men andre cellulære rum (f.eks mitokondrier eller mitokondrielle intermembrane rum) kan målrettes med samme protokol.
- Generer en dosis-respons-kurve for MOI for at opnå den højeste transduktionseffektivitet ved at beregne det volumen af adenovirus (ml), der kræves for hver MOI-værdi for MDA-MB-231-cellelinjen (tabel 1):
BEMÆRK: Den funktionelle titer af hvert parti adenovirale lager, som udtrykkes som plaque danner enhed (PFU) pr ml, leveres af selskabet. Den optimale MOI til transduktion varierer mellem celletyper. For de fleste pattedyrceller er det optimale MOI-område mellem 10 og 300. Ifølge det cellulære respons skal MOI-værdierne genberegnes (f.eks. bør MOI-området reduceres, hvis cellerne har cytotoksisk respons, eller intervallet skal øges, hvis cellerne har lav transduktionseffektivitet). - 1:100 fortynding af 6 x 1010 PFU/ml adenoviral roGFP opløsning med cellekultur medium (DMEM med 10% FBS) for pålidelig pipettering.
- Pipette og tilsættes 0,0125 ml (12,5 μL), 0,025 ml (25 μL), 0,05 ml (50 μL) adenoviral roGFP fortynding i hver brønd af 6 brøndpladen for at omdukle de 150.000 celler med 50 henholdsvis 100 og 200 MOI for flowcytometrianalyse (tabel 1).
- Pipette og tilsættes 0,0042 ml (4,2 μL) adenoviral roGFP fortynding i 4-kammer glidebrønde til transduce 25.000 celler med 100 MOI for fluorescens imaging (Tabel 1).
BEMÆRK: Der bør anvendes en minimal mængde medium i brøndene for at sikre den højeste interaktion mellem adenoviral roGFP-konstruktionen og cellerne. Det kan være nødvendigt at nedsætte serumindholdet i dyrkningsmediet for forskellige cellelinjer, fordi høje serumniveauer kan påvirke transduktionseffektiviteten negativt i nogle celletyper negativt. - Inkuber celler i 16-24 timer under cellevedligeholdelsesbetingelserne. Den næste dag (dag 3), ændre medium til celle kultur medium (DMEM med 10% FBS) at tillade celle opsving for yderligere 24 h. Visualisere celler under et mikroskop til at vurdere deres morfologi; kan udtrykke roGFP, selvom de har morfologiske ændringer.
BEMÆRK: På dag 3 skal cellerne begynde at udtrykke roGFP; Transduktionseffektiviteten kan derfor overvåges ved hjælp af fluorescensmikroskopi (filtre med ex. 488/em. 525). For at opnå ensartede analyseresultater skal du være opmærksom på og dokumentere de morfologiske ændringer under fasekontrastensmikroskop og observere morfologi, mens transduktionseffektiviteten evalueres. - En dosisresponskurve konstrueres ved hjælp af 50-, 100- og 200 MOI-prøver, der er fremstillet i trin 2.3, og deres transduktionseffektivitetsresultater opnået ved flowcytometrianalyse (trin 3.1 og 4.1). Vurdering af optimal transduktionseffektivitet med dokumentation af morfologiske ændringer (trin 2.5) og moi-respons-dosiskurven.
BEMÆRK: Selv om mere end 98% af cellepopulationen ved 100 MOI og 200 MOI express roGFP (se repræsentative resultater), viste 200 MOI-gruppen væsentlige ændringer i cellemorfologien af MDA-MB-231-celler. Derfor blev den mest effektive MOI for MDA-MB-231 celler bestemt til at være 100 MOI. - Efter optimal MOI (her, 100 MOI) blev valgt til MDA-MB-231 celle linje, udføre eksperiment med testmaterialer (10 μM H2O2 og dets køretøj 0,1% deioniseret vand).
- Forbered og frø cellerne i henhold til afsnit 1. Ved hjælp af det adenovirale transduktionsvolumen for 100 MOI beregnet i trin 2.1 gentages trin 2.2−2.4 for 100 MOI adenoviral transduction af celler. Derefter inkuberes pladen og kammeret dias i henhold til trin 2.5.
3. Erhvervelse af CyS/CySS-saldo
- Flow cytometri (dag 4)
- På dag 4 inkuberes celler fra trin 2.7.1 med 10 μM H2O2 i 1 time.
BEMÆRK: 10 μM H2O2 blev anvendt som teststof, og 0,1 % deioniseret vand blev anvendt som køretøjsbehandling i denne protokol. Andre oxiderende midler kan bruges som positive kontroller her. - Aspirere medier fra 6 brøndpladen, udskift med 750 μL 0,25% trypsin-EDTA opløsning og vente i 2 min for celler at løsne. Inaktivere trypsin med 2 ml komplet medium (DMEM med 10% FBS) og opsamles i 15 ml koniske rør.
- Centrifuger rørene ved 150 x g i 5 min ved 4ºC. Supernatant kasseres, og cellerne suspenderes i 500 μL fosfatbufferet saltvand (PBS).
- Gentag trin 3.1.3
- Cellesuspensionerne filtreres i cytometri-kompatible rør, der er kompatible med strømme, ved hjælp af 40 μm mesh. Hold rørene på is og væk fra lyset, og følg trin 4.1 for dataanalyse.
- På dag 4 inkuberes celler fra trin 2.7.1 med 10 μM H2O2 i 1 time.
- Mikroskopisk billeddannelse (dag 4)
- På dag 4 behandles celler med 10 μM H2O2,straks anskaffes billeder (tidspunkt 0) og 1 time efter behandling, og trin 4.2 følges for dataanalyse.
4. Dataanalyse
- Indvantificering af cytometri af flow
- Indstil flowcytometrimetoden for 3 forskellige analyser via prøveerhvervelsessoftware(se Tabel over Materialer ): fremadgående spredning (FCS) på x-akse og sidespredning (SSC) på y-aksen for at vurdere cellernes cellestørrelse og kompleksitet (SSC kan anvendes til grov identifikation af døde og levende celler); eks. 488 nm/em. 525 nm (fluorescein isothiocyanat [FITC]) bandpass filter på x-akse og SSC på y-akse til at vurdere CyS-roGFP; eks. 405 nm/em. 525 nm (Brilliant Violet 510 [BV510]) bandpass filter på x-akse og SSC på y-akse til at vurdere CySS-roGFP.
- Anskaf 0 MOI-kontrol, og visualiser celler med prøveerhvervelsessoftware. Dette trin gentages for resterende prøver (50, 100, 200 MOI-grupper og senere 10 μM H2O2 behandlede celler og køretøjsbehandlede celler). Gem filerne til dataanalyse.
- Åbn dataanalysesoftware (se Tabel over materialer)og åbn eksempelfilen 0 MOI. Vurder cellepopulation af interesse (Gate 1). Opsæt følgende gatings for at minimere baggrundsfluorid for ex. 488 nm/em. 525 nm (Gate 2) og ex. 405 nm/em. 525 nm (Gate 3) bandpass filtre med de ikke-inficerede (0 MOI) kontrolceller.
- Åbn 50, 100 og 200 MOI-prøvefiler i dataanalysesoftware for at vurdere dosis-respons-kurven. Analysér gennemsnitlige fluorescensintensiteter med Gates 2 og 3 for hver prøve. Dette trin gentages for prøveemner (10 μM H2O2 behandlede celler og køretøjsbehandlede celler).
- Det gennemsnitlige fluorescerende intensitetsforhold mellem oxiderede og reducerede former for roGFP beregnes med følgende ligning.
- Vurdering af billeder
- Brug et mikroskop, der indeholder fluorescensfiltre til henholdsvis CyS-roGFP og CySS-roGFP (eks. 488 nm/em. 525 nm og ex. 405 nm/em. 525 nm-filtre).
- I hver brønd af kammeret dias, vælge 4 tilfældige områder for at erhverve billeder, ved hjælp af 4x mål at visualisere større områder.
BEMÆRK: 20x mål kan også bruges til billedskærme. - Åbn billedet med ImageJ-software11. Anvend Analysér | Mål kommandoer for hvert billede, og brug ligningen i trin 4.1.5 til at kvantificere dataene.
BEMÆRK: Kvantificeringen af billederne er ratiometrisk; Protokollen omfatter derfor ikke subtraktion af baggrund. Men for at kunne sammenligne billeder skal lysstyrke, kontrast og mætning være den samme for hvert billede. Statistisk signifikans blev vurderet med envejsanalyse af varians (ANOVA) og Tukey's post hoc-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den redox tilstand CyS / CySS er let assayed med transduced roGFPs. Den fluorescerende sonde kvantificerer forholdet mellem de reducerede og oxiderede former (excitationsbølgelængder henholdsvis 488 nm og 405 nm). Fluorescensdata kan opnås ved både flowcytometri og mikroskopi.
Et stort antal celler kan konsekvent og bekvemt erhverves ved hjælp af flow cytometri. Analysen består af 3 hovedtrin: 1) vælge den interessegruppe for cellerne med FSC-områdefilteret (figur 1A); 2) gate roGFP-udtrykkende celler med ex. 488/em. 525 nm med et selektivt bandpassfilter (figur 1B) og 3) gate de oxiderede roGFP-holdige celler fra de roGFP-udtrykkende celler med ex. 405 nm/em. 525 nm bandpass filter (Figur 1C).
Hver ny cellelinje bør evalueres for den optimale adenoviral transduction effektivitet roGFPs. Transduktionseffektiviteten bør vurderes med morfologisk vurdering af celler og roGFP-ekspressionsanalyser med flowcytometri og/eller fluorescerende mikroskopi. Denne protokol bruger flowcytometri til at bestemme dosis-respons-kurven for roGFP-analyser og til at vælge den mest effektive MOI-indgang (Figur 2A−H). Ifølge MOI dosis-respons kurven (figur 2I) gav 200 MOI det højeste roGFP-udtryk, men cellemorfologi blev påvirket, hvilket tyder på cytotoksicitet. Derfor blev den optimale transduktionseffektivitet bestemt til at være med 100 MOI.
For at vurdere metodens effektivitet blev H2O2 anvendt som en positiv kontrol for oxidation. Et hundrede MOI blev brugt til optimal transduktion. Efter restitutionsperioden blev cellerne behandlet med 10 μM H2O2 i 1 time for at opnå fluorescensforholdet via flowcytometri. Oxideret (f.eks. 405 nm/em. 525nm) og reduceret (f.eks. 488 nm/em. 525 nm) roGFP, hvor fluorescensintensiteten blev opnået ved flowcytometrianalyser for køretøjer (figur 3A, B) og 10 μM H2O2 (Figur 3C, D) behandlinger. De overlejrede histogrammer repræsenterer forskydningen i celletallet på 10 μM H2O2 og køretøjsbehandlede grupper for reducerede (figur 3E) og oxideret (figur 3F) roGFP. Forholdet mellem oxideret og reduceret roGFP viser, at 10 μM H2O2 forårsagede en 3-dobling af oxidation af roGFP sammenlignet med køretøjsbehandling (Figur 3G).
Fluorescerende billeddannelse af celler blev også udført med 10 μM H2O2 under mikroskopet for 1 h. Billeder blev taget under 4x målet, og repræsentative billeder blev taget under 20x målet (figur 4A). Fluorescerende intensiteter blev evalueret med ImageJ software, og nøgletal blev beregnet. Der blev påvist en stabil stigning i H2O2-induceret oxidation (figur 4B); inkubation med H2O2 i 1 time øgede oxideringen af roGFP cystein, som udviste en signifikant ændring mellem køretøjets kontrol.
Figur 1: Gating-opsætning for fluorescerende intensiteter af CyS-holdige (reducerede) roGFP- og CySS-hold (oxiderede) roGFP-restkoncentrationer med ikke-transkucerede MDA-MB-231-celler. (A) Den interessegruppe, der er af interesse for cellerne, blev valgt som gate 1 med SSC- og FSC-områdefiltre. (B) roGFP-ekspresserende celler blev udvalgt i henhold til celler, der ikke udtrykker celler, som Gate 2 med ex. 488/em. 525 nm bandpass filter. (C) Oxiderede (cystin) roGFP-holdige celler blev gated med ex. 405 nm/em. 525 nm bandpass filter fra roGFP-ekspresserende befolkning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: MOI-dosis-respons-kurvevurdering med flowcytometrianalyser for MDA-MB-231-cellelinje. (A,B) Ikke-inficerede celler og (C,D) 50 MOI, (E,F) 100 MOI og (G,H) 200 MOI roGFP-ekspressende cellepopulationer erhvervet til gating opsætning. (I) Trans inducerede celler blev evalueret og afbildet i procent i henhold til den cellepopulation, der var af interesse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Flow cytometrivurdering af CyS/CySS-balancen i roGFP-trans induceret MDA-MB-231 cellelinje. Køretøjsbehandlede celler blev vurderet som (A) % roGFP-ekspressende celler, og (B) % oxiderede roGFP-ekspresserende celler og H2O2-behandling blev vurderet med de samme parametre i henholdsvis paneler (C) og (D). Histogrammer i køretøjer og H2O2-behandling blev overlejret for (E) reduceret roGFP ex. 488/em. 525 bandpass filter og (F) oxideret roGFP ex. 405/em. 525 bandpass filter. (G) De gennemsnitlige fluorescensintensitetsforhold mellem oxiderede/reducerede former blev afbildet i en søjlegraf. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fluorescerende billeddannelse af roGFP-trans induceret MDA-MB-231. aA) Repræsentative billeder efter 1 h behandling med køretøj eller H2O2. (B) Forholdet mellem oxiderede/reducerede former blev evalueret i 4 tilfældigt udvalgte områder, og stænger repræsenterer gennemsnitlig ± standardafvigelse. Statistisk signifikans mellem grupper angivet som *(p < 0,05), **(p < 0,01) eller ***(p < 0,005). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Analysetype | Cellenummer pr. brønd | Adenoviral roGFP PFU/mL | 1:100 fortynding af adenoviral roGFP PFU/ml | Moi | Transduktionsvolumen (ml) |
| Flow cytometri | 150,000 | 6 x 1010 | 6 x 108 | 0 | 0 |
| 50 | 0.0125 | ||||
| 100 | 0.025 | ||||
| 200 | 0.05 | ||||
| Fluorescensmikroskopi | 25,000 | 6 x 1010 | 6 x 108 | 100 | 0.0042 |
Tabel 1: Beregning af MOI-værdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Thiol/disulfidbalancen i en organisme afspejler cellernes redox-status. Levende organismer har glutathion, cystein, protein thioler, og lav-molekylær-vægt thioler, som alle er påvirket af niveauet af oxidation og ekko redox status af celler4. Konstruerede roGFP'er gør det muligt at kvantificere thiol/disulfidbalancen uden forstyrrende kvantificering via deres CyS-restkoncentrationer7. Den ratiometriske egenskab af roGFP giver pålidelige redox-målinger for pattedyrceller. roGFP kan let indføres i celler med transfektionsmetoder og/eller transduktionsvektorer, men adenoviral transduktion har højere effektivitet.
Cellernes redox-status påvirkes let af det cellulære miljø (f.eks. sammenløb af celler og volumen af medium). For denne protokol blev den optimerede cellesåningskonfluency bestemt til at være 60%-70% med 15.000 celler pr. cm2; analysedagen, var cellerne 70%-80% sammenløb. Men celle morfologi og fordobling tid varierer mellem cellelinjer. Af denne grund, hvis forskeren har til hensigt at bruge en anden cellelinje, celle sammenløb bør justeres, mens erhverve målinger med flow cytometri og / eller fluorescens mikroskopi; dette vil sikre nøjagtige resultater baseret på deres eksperimentelle udformning og behov.
roGFP'er kan let introduceres til celler med flere transfektionsmetoder og/eller transduktionsvektorer. Den nuværende protokol bruger cytosol-specifikke roGFP konstruktion, som er transduced i celler med en adenovirus. Før du starter et eksperiment, er det vigtigt at bestemme MOI dosis-respons for en cellelinje; Dette gør det muligt at bestemme maksimal transduktionseffektivitet med minimal celletoksicitet for at designe den optimale, reproducerbare protokol.
CyS/CySS-status for roGFP-transucerede celler kan vurderes med både fluorescerende billeddannelse og flowcytometri. Begge analyser har deres fordele og ulemper; flowcytometri gør det muligt hurtigt at evaluere en større cellepopulation, men fluorescensbilleddannelse har større følsomhed over for roGFP-specifikke celler. Desuden bekræfter den også den korrekte subcellulære lokalisering af GFP (f.eks. cytosolic versus mitokondriel). Her, både flow cytometri og fluorescerende billeddannelse blev brugt af forskerne. Selv om H2O2 betragtes som et svagt oxidant for roGFP-konstruktionen7, viste protokollen, at begge metoder er følsomme nok til at detektere ratiometriske ændringer mellem oxiderede og reducerede former for roGFP efter H2O2-behandling.
Denne roGFP protokol kan bruges til at bestemme redox status af forskellige pattedyr celletyper. For at forstå menadion-induceret kardiomyocyt død i forbindelse med prooxidant / antioxidant balance, Loor og kolleger brugte både cytosolic og mitokondrielle roGFP mærkning i kardiomyocytter12. roGFP giver mulighed for visualisering af redox status af celler, mens de er i live, og den rumspecifikke målretning giver en bedre forståelse af sygdomme. Esposito og kolleger gennemgik brugen af roGFP til at bestemme redox-status for celler ved neurodegenerative sygdomme13. Fordi roGFP transduktion i forskellige organismer, herunder planter14 og bakterier9, er let opnås, overvågning af redox status af både bakterielle og værtsceller under sygdomstilstande kunne lette innovative behandlingsmetoder. Endvidere kan in vivo-undersøgelser, der er udført med segmentspecifikke roGFP hos transgenedyr,kaste lys over redox-status for organismer15,16.
I visse situationer er roGFP-biosensoren imidlertid utilstrækkelig til at undersøge fysiologisk relevante redox-ændringer5 og H2O2 2 oxidation 7 i cellerne. Peroxidase selektivitet for H2O2 blev brugt til at konstruere mere følsomme sonder6. Gærperoxidase ORP1 var knyttet til roGFP for at muliggøre en delikat måling af H2O2-medieret thioloxidation17,18,19. Ligeledes overvåger inkorporeringen af humant glutaredoxin (Grx1) i roGFP-sensoren specifikt GSH/GSSG-ligevægten icellerummene 6,18,19.
Denne let anvendelige protokol giver forskerne mulighed for at overvåge rumspecifik redox-status i intakte celler, hvilket minimerer artifactual oxidation på grund af fysisk stress under cellehomogenisering. Den nuværende protokol viser 2 kvantificeringsmetoder: flowcytometri (gavnlig for hurtige analyser af store cellepopulationer) og fluorescerende mikroskopi (giver mulighed for kontinuerlig tidsforskydningsbilleddannelse og bestemmelse af cellernes morfologi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Konstruktionen og rekombinant adenovirus til at udtrykke cytosol-specifikke roGFP i celler blev genereret i laboratoriet af Paul T. Schumacker, ph.d., Freiberg School of Medicine, Northwestern University, og ViraQuest Inc., hhv. Denne undersøgelse blev støttet af Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy grant P20GM109005 gennem NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Farmakologi og Toksikologi Training Program tilskud T32 GM106999, UAMS Foundation / Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor's Awards AWD00053484. Flowcytomeriets kernefacilitet blev delvist støttet af Center for Mikrobiel patogenese og værtsinflammatorisk respons giver P20GM103625 gennem COBRE NIGMS. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis NIH's officielle synspunkter. ATA blev støttet af The Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2214-A stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | Cell culture |
| 4-well chamber slide | Thermo Scientific | 154526 | Cell seeding material for fluorescent imaging |
| 5 ml tubes with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Single cell suspension tube for flow cytometry analysis |
| 6-well plate | Corning | 353046 | Cell seeding material for flow cytometry analysis |
| 15 ml conical tubes | MidSci | C15B | Cell culture |
| 75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks | Corning | 4306414 | Cell culture |
| Adenoviral cytosol specific roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker |
| Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | Cell culture |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting |
| Countess cell counter chamber slides | Invitrogen | C10283 | Cell counting |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Cell culture |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 20 µl | Fisherbrand | 02-717-161 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl | Fisherbrand | 02-717-166 | Cell culture |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses |
| Fluorescent Microscope | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | Fluorescent imaging |
| Hydrogen Peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Positive control |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | Human epithelial breast cancer cell line |
| Microcentrifuge tubes, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Cell culture |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | Cell culture |
| Pipet controller | Drummond | Hood Mate Model 360 | Cell culture |
| Serologycal pipet, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Cell culture |
| Serologycal pipet, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Cell culture |
| Serologycal pipet, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Cell culture |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 incubator for cell culture |
| Trypan blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell counting |
References
- Sies, H. Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Jones, D. P.
- Pizzino, G., et al. Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).
- Go, Y. M., Jones, D. P. Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).
- Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).
- Meyer, A. J., Dick, T. P.
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Björnberg, O., Østergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).
- Bhaskar, A., et al. Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).
- Loor, G., et al. Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Loor, G., et al. Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis. Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).
- Esposito, S., et al. Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).
- Meyer, A. J., et al. Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer. Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).
- Galvan, D. L., et al. Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy. Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).
- Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology. Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).
- Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes. Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).
