Summary
Denne protokollen beskriver vurderingen av subcellulær romspesifikk redoksstatus i cellen. En redoksfølsom fluorescerende sonde gir praktisk ratiometrisk analyse i intakte celler.
Abstract
Måling av den intracellulære oksidasjons-/reduksjonsbalansen gir en oversikt over organismens fysiologiske og/eller patofysiologiske redoksstatus. Tioler er spesielt viktige for å belyse redoksstatusen til celler via deres reduserte dithiol og oksiderte disulfidforhold. Konstruerte cysteinholdige fluorescerende proteiner åpner en ny æra for redoksfølsomme biosensorer. En av dem, redoks-sensitive grønne fluorescerende protein (roGFP), kan lett innføres i celler med adenoviral transduksjon, slik at redoksstatusen til subcellulære rom kan evalueres uten å forstyrre cellulære prosesser. Redusertcysteiner og oksiderte cystiner av roGFP har eksitasjon maxima på henholdsvis 488 nm og 405 nm, med utslipp på 525 nm. Vurdering av forholdet mellom disse reduserte og oksiderte formene gjør det mulig å beregne redoksbalansen i cellen. I denne metodeartikkelen ble udødeliggjorte humane trippelnegative brystkreftceller (MDA-MB-231) brukt til å vurdere redoksstatus i den levende cellen. Protokollen trinnene inkluderer MDA-MB-231 cellelinje transduksjon med adenovirus å uttrykke cytosolic roGFP, behandling med H2O2,og vurdering av cystein og cystin forhold med både strømning cytometri og fluorescens mikroskopi.
Introduction
Oksidativt stress ble definert i 1985 av Helmut Sies som "en forstyrrelse i prooksidant-antioksidantbalanse i favør av den tidligere"1, og en mengde forskning har blitt utført for å oppnå sykdom-, ernæring-, og aldringsspesifikk redoksstatus avorganismer 1,2,3. Siden da har forståelsen av oksidativt stress blitt bredere. Testing av hypotesene ved å bruke antioksidanter mot sykdommer og/ eller aldring har vist at oksidativt stress ikke bare forårsaker skade, men har også andre roller i celler. Videre har forskere vist at frie radikaler spiller en viktig rolle for signaltransduksjon2. Alle disse studiene styrker viktigheten av å bestemme endringene i reduksjonsoksidasjonsforholdet (redoks) av makromolekyler. Enzymaktivitet, antioksidanter og/eller oksidanter og oksidasjonsprodukter kan vurderes med ulike metoder. Blant disse er metoder som bestemmer tioloksidasjon uten tvil den mest brukte fordi de rapporterer om balansen mellom antioksidanter og prooksidanter i celler, samtorganismer 4. Spesielt brukes forhold mellom glutation (GSH)/glutationdisulfid (GSSG) og/eller cystein (CyS)/cystin (CySS) som biomarkører for overvåking av redoksstatusen tilorganismer 2.
Metoder som brukes til å analysere balansen mellom prooksidanter og antioksidanter, er hovedsakelig avhengig av nivåene av reduserte/oksiderte proteiner eller små molekyler i celler. Vestlige blots og massespektrometri brukes til å bredt vurdere forholdet mellom reduserte / oksiderte makromolekyler (protein, lipider etc.), og GSH / GSSG-forhold kan vurderes med spektrofotometri5. Et vanlig trekk ved disse metodene er den fysiske perturbasjonen av systemet ved cellelysis og / eller vev homogenisering. Disse analysene blir også utfordrende når det er nødvendig å måle oksidasjonsstatusen til forskjellige cellulære rom. Alle disse perturbasjonene forårsaker artefakter i analysemiljøet.
Redox-sensitive fluorescerende proteiner åpnet en fordel for evaluering av redoksbalansen uten å forårsake forstyrrelser i cellene6. De kan målrette mot ulike intracellulære rom, slik at kvantifisering av kupéspesifikke aktiviteter (f.eks. analysere redokstilstanden til mitokondrier og cytosol) for å undersøke krysstale mellom cellulære organeller. Gult fluorescerende protein (YFP), grønt fluorescerende protein (GFP) og HyPeR-proteiner gjennomgås av Meyer og kolleger6. Blant disse proteinene er redoksfølsomme GFP (roGFP) unike på grunn av forskjellige fluorescerende avlesninger av cys (f. 488 nm/em. 525 nm) og CySS (f.eks. 405 nm/525 nm) rester, som tillater ratiometrisk analyse, i motsetning til andre redoks-sensitive proteiner som YFP7,8. Ratiometrisk utdata er verdifull fordi den motvekter forskjellene mellom uttrykksnivåer, deteksjonsfølsomheter og fotobleking8. Subcellulære celleavdelinger (cytosol, mitokondrier, kjerne) eller forskjellige organismer (bakterier samt pattedyrceller) kan målrettes ved å endre roGFP7,,9,,10.
roGFP-analyser utføres ved hjelp av fluorescerende bildeteknikker, spesielt for visualiseringseksperimenter i sanntid. Flow cytometriske analyser av roGFPs er også mulig for eksperimenter med forhåndsbestemte tidspunkter. Den nåværende artikkelen beskriver både bruk av fluorescerende mikroskopi og strømningscytometri for å utføre en ratiometrisk vurdering av redoksstatus hos pattedyrceller som overexpressing roGFP (målrettet mot cytosol) via adenoviral transduging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne protokollen ble optimalisert for 70 %–80 % sammenføyning av MDA-MB-231-celler. For andre cellelinjer bør antall celler og mangfold av infeksjon (MOI) reoptimeres på nytt.
1. Utarbeidelse av celler (dag 1)
- Vedlikehold MDA-MB-231 cellelinje i 75 cm2 flasker med 10 ml Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplert med 10% fostervin serum (FBS) ved 37 °C i en 5% CO2 fuktet atmosfære.
MERK: DMEM supplert med 10 % FBS, 37 °C og en 5 % CO2 fuktet atmosfære brukes til alle feste- og behandlingsinkubasjoner gjennom hele protokollen. - Klargjør MDA-MB-231-cellene for eksperiment.
- Aspirer mediet i kolben, løsner cellene med 2 ml 0,25 % trypsin-EDTA-oppløsning i 2 min, og inaktiver trypsinaktiviteten med 6 ml komplett medium (DMEM med 10 % FBS). Sentrifuger cellene ved 150 x g i 5 min. Aspirer supernatanten og suspendere cellene i 5 ml komplett medium.
- Bland en lik volum celle suspensjon og 0,4% trypan blå. Ta 10 μL av denne blandingen og telle cellene med den automatiserte celletelleren.
MERK: En Coulter teller eller et hemocytometer kan også brukes til celletelling. - Frø cellene i en 6 brønnplate for flow cytometri analyser og frø 150.000 celler i 1 ml medium per brønn. Vent 16 timer for cellevedlegg.
- Frø cellene i en 4 brønnkammer lysbilde for fluorescerende avbildning og frø 25.000 celler i 0,5 ml medium per brønn. Vent 16 timer for cellevedlegg.
MERK: Frøkontrollbrønner i tillegg til behandlingsbrønner. Bruk en av kontrollbrønnene til å bestemme cellenummer (valgfritt: Hvis vedleggsperioden for cellene er kortere enn doblingstiden, kan cellenummeret antas å være det samme som såingstettheten) og den andre for en ikke-infisert kontroll (0 MOI).
2. Adenoviral roGFP transduction (dag 2 og 3)
FORSIKTIG: Adenovirus kan forårsake sykdommer. Mens du overfører cellene, bruk filtrerte tips og dekontaminer tips, Pasteur pipetter og mikrocentrifugerør med 10% blekemiddel.
MERK: Denne protokollen ble demonstrert med cytosolspesifikk roGFP, men andre cellulære rom (f.eks. mitokondrier eller mitokondrieintermembranerom) kan målrettes med samme protokoll.
- Generer en doseresponskurve for MOI for å oppnå den høyeste transduksjonseffektiviteten ved å beregne volumet av adenovirus (ml) som kreves for hver MOI-verdi for MDA-MB-231 cellelinje (tabell 1):
MERK: Funksjonell titer av hver batch av adenoviral lager, som uttrykkes som plakk forming enhet (PFU) per ml, er levert av selskapet. Den optimale MOI for transduksjon varierer mellom celletyper. For de fleste pattedyrceller er det optimale MOI-området mellom 10 og 300. Ifølge den cellulære responsen bør MOI-verdier beregnes på nytt (f.eks. MOI-området bør reduseres hvis cellene har cytotoksisk respons, eller området bør økes hvis cellene har lav transduksjonseffektivitet). - Lag 1:100 fortynning av 6 x 1010 PFU/ml adenoviral roGFP-løsning med cellekulturmedium (DMEM med 10 % FBS) for pålitelig pipettering.
- Pipette og tilsett 0,0125 ml (12,5 μL), 0,025 ml (25 μL), 0,05 ml (50 μL) adenoviral roGFP-fortynning i hver brønn av 6-brønnplaten for å transdusere 150 000 celler med 50, henholdsvis 100 og 200 MOI for analyse av strømningscytmetri (tabell 1).
- Pipette og tilsett 0,0042 ml (4,2 μL) adenoviral roGFP-fortynning i 4-kammers skyvebrønner for å transduce 25 000 celler med 100 MOI for fluorescensavbildning (tabell 1).
MERK: En minimal mengde medium bør brukes i brønnene for å sikre den høyeste interaksjonen mellom adenoviral roGFP-konstruksjonen og cellene. Seruminnholdet i kulturmediet må kanskje reduseres for ulike cellelinjer fordi høye nivåer av serum kan påvirke transduksjonseffektiviteten negativt i enkelte celletyper. - Inkuber celler i 16–24 timer under vedlikeholdsforholdene for cellen. Neste dag (dag 3), endre medium til celle kultur medium (DMEM med 10% FBS) for å tillate celle utvinning for ytterligere 24 h. Visualisere celler under et mikroskop for å vurdere deres morfologi; celler kan uttrykke roGFP selv om de har morfologiske endringer.
MERK: På dag 3 bør cellene begynne å uttrykke roGFP; Transduksjonseffektivitet kan derfor overvåkes ved hjelp av fluorescensmikroskopi (filtre med ex. 488/em. 525). For å oppnå konsistente analyseresultater, vær oppmerksom på og dokumenter de morfologiske endringene under fasekontrastmikroskopet og observere morfologi mens du evaluerer transduksjonseffektivitet. - Konstruere en doseresponskurve ved hjelp av 50, 100 og 200 MOI-prøvene som er utarbeidet i trinn 2.3, og deres transduksjonseffektivitetsresultater oppnådd fra flowcytometrianalyse (trinn 3.1 og 4.1). Vurder optimal transduksjonseffektivitet med dokumentasjon av morfologiske endringer (trinn 2.5) og doseresponskurven til MOI.
MERK: Selv om mer enn 98 % av cellepopulasjonen ved 100 MOI og 200 MOI express roGFP (se representative resultater), viste 200 MOI-gruppen betydelige endringer i cellemorfologien til MDA-MB-231-celler. Følgelig ble den mest effektive MOI for MDA-MB-231 celler fastslått å være 100 MOI. - Etter optimal MOI (her, 100 MOI) ble valgt for MDA-MB-231 cellelinje, gjennomføre eksperiment med testmaterialer (10 μM H2O2 og dens kjøretøy 0,1% deionisert vann).
- Forbered og frø cellene i henhold til seksjon 1. Bruk adenoviral transduksjonsvolumet for 100 MOI beregnet i trinn 2.1, gjenta trinn 2.2−2.4 for 100 MOI adenoviral transduction av celler. Deretter inkubere platen og kammersklier i henhold til trinn 2.5.
3. Oppkjøp av CyS/CySS balanse
- Flow cytometri (dag 4)
- På dag 4 inkuberer cellene fra trinn 2.7.1 med 10 μM H2O2 i 1 time.
MERK: 10 μM H2O2 ble brukt som teststoff og 0,1 % deionisert vann ble brukt som kjøretøybehandling i denne protokollen. Andre oksidasjonsmidler kan brukes som positive kontroller her. - Aspirer mediet fra 6 brønnplaten, erstatt med 750 μL av 0,25% trypsin-EDTA-løsning og vent i 2 min for at cellene skal løsne. Inaktiver trypsin med 2 ml komplett medium (DMEM med 10 % FBS) og samle volumet i 15 ml koniske rør.
- Sentrifuger rørene ved 150 x g i 5 min ved 4ºC. Kast supernatant og overse cellene i 500 μL fosfatbufret saltvann (PBS).
- Gjenta trinn 3.1.3
- Filtrer cellesuspensjonene i strømningscytometrikompatible rør ved hjelp av 40 μm mesh. Hold rørene på is og borte fra lyset og følg trinn 4.1 for dataanalyse.
- På dag 4 inkuberer cellene fra trinn 2.7.1 med 10 μM H2O2 i 1 time.
- Mikroskopisk bildebehandling (dag 4)
- På dag 4, behandle celler med 10 μM H2O2, skaffe bilder umiddelbart (tidspunkt 0) og 1 t etter behandling og følg trinn 4.2 for dataanalyse.
4. Dataanalyse
- Flow cytometri kvantifisering
- Angi flow cytometrimetode for 3 forskjellige analyser via prøveinnhentingsprogramvare (se Materialkommerst): fremover scatter (FCS) på x-akse og sidespredning (SSC) på y-aksen for å vurdere cellestørrelse og kompleksitet av celler (SSC kan brukes til grov identifisering av døde og levende celler); 488 nm/em. 525 nm (fluorescein isothiocyanat [FITC]) bandpass filter på x-akse og SSC på y-aksen for å vurdere CyS-roGFP; 405 nm/em. 525 nm (Brilliant Violet 510 [BV510]) bandpassfilter på x-akse og SSC på y-aksen for å vurdere CySS-roGFP.
- Få 0 MOI kontroll og visualisere celler med prøve oppkjøp programvare. Gjenta dette trinnet for gjenværende prøver (50, 100, 200 MOI-grupper og senere på 10 μM H2O2 behandlede celler og kjøretøybehandlede celler). Lagre filene for dataanalyse.
- Åpne dataanalyseprogramvare (se Materialtabell) og åpne 0 MOI-eksempelfilen. Vurdere cellepopulasjon av interesse (Gate 1). Sett opp følgende gatings for å minimere bakgrunnsfluorescens for ex. 488 nm/em. 525 nm (Gate 2) og ex. 405 nm/em. 525 nm (Gate 3) bandpassfiltre med de ikke-infiserte (0 MOI) kontrollcellene.
- Åpne 50, 100 og 200 MOI eksempelfiler i dataanalyseprogramvare for å vurdere doseresponskurven. Analyser gjennomsnittlig fluorescensintensitet med port 2 og 3 for hver prøve. Gjenta dette trinnet for testprøver (10 μM H2O2 behandlede celler og kjøretøybehandlede celler).
- Beregn gjennomsnittlig fluorescerende intensitetsforhold mellom oksidert versus reduserte former for roGFP med følgende ligning.
- Bilde vurdering
- Bruk et mikroskop som inneholder fluorescensfiltre for henholdsvis CyS-roGFP og CySS-roGFP (f.eks. 488 nm/em. 525 nm og ex. 405 nm/em. 525 nm-filtre).
- I hver brønn i kammerlysbildet velger du 4 tilfeldige områder for å skaffe bilder ved hjelp av 4x-målet for å visualisere større områder.
MERK: 20x mål kan også brukes til bildevisninger. - Åpne bildet med ImageJ-programvare11. Søk analyse | Mål kommandoer for hvert bilde, og bruk ligningen i trinn 4.1.5 til å kvantifisere dataene.
MERK: Kvantifisering av bildene er forholdsavhengig; Derfor inkluderer protokollen ikke underfang av bakgrunn. For å kunne sammenligne bilder, må lysstyrke, kontrast og metning være den samme for hvert bilde. Statistisk signifikans ble vurdert med enveisanalyse av varians (ANOVA) og Tukeys post hoc-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Redokstilstanden til CyS/CySS analyseres lett med transdusert roGFPs. Den fluorescerende sonden kvantifiserer forholdet mellom de reduserte og oksiderte formene (eksitasjonsbølgelengder henholdsvis 488 nm og 405 nm). Fluorescensdata kan innhentes ved både strømningscytometri og mikroskopi.
Et stort antall celler kan konsekvent og praktisk anskaffes ved hjelp av strømningscytometri. Analysen består av 3 hovedtrinn: 1) velg cellepopulasjonen av interesse med FSC-områdefilteret (Figur 1A); 2) gate roGFP-uttrykkende celler med ex. 488 / em. 525 nm med et selektivt båndpassfilter (Figur 1B); og 3) gate de oksiderte roGFP-inneholdende cellene fra roGFP-uttrykkende celler med ex. 405 nm / em. 525 nm bandpass filter (Figur 1C).
Hver nye cellelinje bør evalueres for optimal adenoviral transduksjonseffektivitet av roGFPs. Transduksjonseffektivitet bør vurderes med morfologiske evaluering av celler og roGFP-uttrykksanalyser med strømningscytometri og/eller fluorescerende mikroskopi. Denne protokollen bruker strømningscytometri til å bestemme doseresponskurven for roGFP-analyser og velge den mest effektive MOI-inngangen (Figur 2A−H). Ifølge MOI dose-respons kurve (Figur 2I), 200 MOI ga det høyeste roGFP uttrykk, men celle morfologi ble påvirket, noe som tyder på cytotoksisitet. Derfor ble den optimale transduksjonseffektiviteten fastslått å være med 100 MOI.
For å evaluere effektiviteten av metoden ble H2O2 brukt som en positiv kontroll for oksidasjon. Ett hundre MOI ble brukt til optimal transduksjon. Etter gjenopprettingsperioden ble cellene behandlet med 10 μM H2O2 i 1 timer for å oppnå fluorescensforholdet via strømningscytometri. Oksidert (f.eks. 405 nm/em. 525nm) og redusert (f.eks. 488 nm/em. 525 nm) roGFP gjennomsnittlig fluorescensintensitet ble innhentet fra flow cytometrianalyser for kjøretøy (Figur 3A, B) og 10 μM H2O2 (Figur 3C, D) behandlinger. De overlagte histogrammene representerer skiftet i cellenumrene på 10 μM H2O2 og kjøretøybehandlede grupper for reduserte (figur 3E) og oksiderte (figur 3F) roGFP. Forholdet mellom oksidert og redusert roGFP viser at 10 μM H2O2 forårsaket en 3 ganger økning i oksidasjon av roGFP sammenlignet med kjøretøybehandling (figur 3G).
Fluorescerende avbildning av celler ble også utført med 10 μM H2O2 under mikroskopet i 1 t. Bilder ble tatt under 4x-målet, og representative bilder ble tatt under 20x-målet (Figur 4A). Fluorescerende intensiteter ble evaluert med ImageJ-programvare, og forholdet ble beregnet. En jevn tilstand økning i H2O2-indusert oksidasjon ble påvist (Figur 4B); inkubasjon med H2O2 i 1 timer økte oksidasjonen av roGFP-cysteiner, som viste betydelig endring mellom kjøretøykontrollene.
Figur 1: Gating oppsett for fluorescerende intensiteter av CyS-inneholdende (redusert) roGFP og CySS-inneholdende (oksidert) roGFP rester med ikke-transdusert MDA-MB-231 celler. (A)Den cellepopulasjonen av interesse ble valgt som gate 1 med SSC- og FSC-områdefiltre. (B) roGFP-uttrykkende celler ble valgt i henhold til ikke-uttrykkende celler som Gate 2 med ex. 488 / em. 525 nm bandpass filter. (C) Oksidert (cystin) roGFP-inneholdende celler ble inngjerdet med ex. 405 nm / em. 525 nm bandpassfilter fra den roGFP-uttrykkende populasjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: MOI doseresponskurvevurdering med flow cytometrianalyser for MDA-MB-231 cellelinje. (A,B) Ikke-infiserte celler og (C,D) 50 MOI, (E,F) 100 MOI og (G,H) 200 MOI roGFP-uttrykkende cellepopulasjoner ervervet for å gating oppsett, henholdsvis. (I)Transduserte celler ble evaluert og plottet som en prosentandel i henhold til cellepopulasjonen av interesse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Flow cytometri vurdering av CyS/ CySS balanse i roGFP-transduced MDA-MB-231 cellelinje. Kjøretøybehandlede celler ble evaluert som (A) % roGFP-uttrykkende celler, og (B) % oksiderte roGFP-uttrykkende celler og H2O2-behandling ble vurdert med de samme parametrene i paneler (C) og (D) henholdsvis. Celletellingssistrammer av kjøretøy og H2O2 behandling ble lagt over for (E) redusert roGFP ex. 488/em. 525 bandpassfilter og (F) oksidert roGFP ex. 405/em. 525 bandpass filter. (G) Gjennomsnittlig fluorescensintensitetsforhold mellom oksiderte/reduserte former ble plottet inn i en søylegraf. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Fluorescerende avbildning av roGFP-transdusert MDA-MB-231. (A) Representative bilder etter 1 h behandling med kjøretøy eller H2O2. (B) Forholdet mellom oksiderte/reduserte former ble evaluert i 4 tilfeldig valgte områder, og barer representerer gjennomsnitt ± standardavvik. Statistisk signifikans mellom grupper angitt som *(p < 0,05), **(p < 0,01) eller ***(p < 0,005). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Analyse type | Cellenummer per brønn | Adenoviral roGFP PFU/mL | 1:100 fortynning av adenoviral roGFP PFU/ml | Moi | Transduksjonsvolum (ml) |
| Flow cytometri | 150,000 | 6 x 1010 | 6 x 108 | 0 | 0 |
| 50 | 0.0125 | ||||
| 100 | 0.025 | ||||
| 200 | 0.05 | ||||
| Fluorescensmikroskopi | 25,000 | 6 x 1010 | 6 x 108 | 100 | 0.0042 |
Tabell 1: Beregning av MOI-verdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tiol/disulfidbalansen i kroppen reflekterer rødoksstatusen til celler. Levende organismer har glutation, cystein, proteintioler og lavmolekylærvekttioler, som alle påvirkes av oksidasjonsnivået og ekko redoksstatusen til celler4. Konstruerte roGFPs tillater ikke-forstyrrende kvantifisering av tiol/disulfidbalansen via cysestene7. Den forholdsmetriske egenskapen til roGFP gir pålitelige redoksmålinger for pattedyrceller. roGFP kan enkelt introduseres i celler med transfeksjonsmetoder og/eller transduksjonsvektorer, men adenoviral transduksjon har høyere effektivitet.
Redoksstatusen til celler påvirkes lett av det cellulære miljøet (f.eks. samløpet mellom celler og mediumvolum). For denne protokollen ble den optimaliserte cellesedede samløpet fastslått å være 60%–70%, med 15 000 celler per cm2; på analysedagen var cellene 70 %–80 % sammenføyning. Cellemorfologi og doblingstid varierer imidlertid mellom cellelinjer. Av denne grunn, hvis forskeren har til hensikt å bruke en annen cellelinje, bør cellesammenheng justeres mens de anskaffer målinger med strømningscytometri og / eller fluorescensmikroskopi; Dette vil sikre nøyaktige resultater basert på deres eksperimentelle design og behov.
roGFPs kan enkelt introduseres til celler med flere transfeksjonsmetoder og/eller transduksjonsvektorer. Den nåværende protokollen bruker cytosol-spesifikk roGFP konstruksjon, som er transdusert til celler med et adenovirus. Før du starter et eksperiment, er det viktig å bestemme MOI doserespons for en cellelinje; Dette gjør det mulig å bestemme maksimal transduksjonseffektivitet med minimal celletoksisitet for å designe den optimale, reproduserbare protokollen.
CyS/CySS-statusen til roGFP-transduserte celler kan vurderes med både fluorescerende avbildning og strømningscytometri. Begge analysene har sine fordeler og ulemper; strømningscytometri gjør det mulig for en større cellepopulasjon å evalueres raskt, men fluorescensavbildning har høyere følsomhet overfor roGFP-spesifikke celler. Videre bekrefter den også riktig subcellulær lokalisering av GFP (f.eks. cytosolisk versus mitokondrie). Her ble både strømningscytometri og fluorescerende avbildning brukt av forskerne. Selv om H2O2 regnes som et svakt oksidant for roGFP-konstruksjonen7,viste protokollen at begge metodene er følsomme nok til å oppdage forholdsendringer mellom oksiderte og reduserte former for roGFP etter H2O2-behandling.
Denne roGFP-protokollen kan brukes til å bestemme redoksstatusen til forskjellige pattedyrcelletyper. For å forstå menadion-indusert kardiomyocyte død i sammenheng med prooksidant / antioksidant balanse, Loor og kolleger brukte både cytosolic og mitokondrie roGFP merking i kardiomyocytes12. roGFP tillater visualisering av redoksstatusen til celler mens de er i live, og den romspesifikke målrettingen gir en bedre forståelse av sykdommer. Esposito og kolleger vurderte bruken av roGFP for å bestemme redoksstatusen til celler i nevrodegenerative sykdommer13. Fordi roGFP transduction i forskjellige organismer, inkludert planter14 og bakterier9, er lett å oppnå, overvåking av redox status for både bakterielle og vertsceller under sykdomstilstander kan lette innovative behandlingstilnærminger. Videre kan in vivo-studier utført med kupéspesifikk roGFP hos transgene dyr kaste lys over redoksstatusen tilorganismer 15,16.
I visse situasjoner er imidlertid roGFP biosensor utilstrekkelig for å undersøke fysiologisk relevante redoksendringer5 og H2O2 oksidasjon 7 i cellene. Peroksidase selektivitet for H2O2 ble brukt til å konstruere mer følsomme sonder6. Gjærperoksidasjon ORP1 var knyttet til roGFP for å muliggjøre delikat måling av H2O2-mediert tioloksidasjon 17,,18,,19. På samme måte overvåker inkorporeringen av humant glutaredoxin (Grx1) i roGFP-sensoren spesifikt GSH/GSSG likevekt i cellerommene6,,18,,19.
Denne lett anvendelige protokollen gjør det mulig for forskere å overvåke romspesifikk redoksstatus i intakte celler, noe som minimerer artefaktisk oksidasjon på grunn av fysisk stress under celle homogenisering. Den nåværende protokollen viser 2 kvantifiseringsmetoder: strømningscytometri (gunstig for raske analyser av store cellepopulasjoner) og fluorescerende mikroskopi (noe som muliggjør kontinuerlig tidsforløpsavbildning og bestemme cellenes morfologi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Konstruksjonen og rekombinant adenovirus for å uttrykke cytosol-spesifikk roGFP i celler ble generert i laboratoriet til Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University, og ViraQuest Inc., henholdsvis. Denne studien ble støttet av Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy grant P20GM109005 gjennom NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program grant T32 GM106999, UAMS Foundation / Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor's Awards AWD00053484. Flow cytometri kjerne anlegget ble støttet delvis av Center for Microbial Pathogenesis og Host Inflammatory Responses gi P20GM103625 gjennom COBRE NIGMS. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til NIH. ATA ble støttet av The Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2214-A stipend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | Cell culture |
| 4-well chamber slide | Thermo Scientific | 154526 | Cell seeding material for fluorescent imaging |
| 5 ml tubes with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Single cell suspension tube for flow cytometry analysis |
| 6-well plate | Corning | 353046 | Cell seeding material for flow cytometry analysis |
| 15 ml conical tubes | MidSci | C15B | Cell culture |
| 75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks | Corning | 4306414 | Cell culture |
| Adenoviral cytosol specific roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker |
| Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | Cell culture |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting |
| Countess cell counter chamber slides | Invitrogen | C10283 | Cell counting |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Cell culture |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 20 µl | Fisherbrand | 02-717-161 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl | Fisherbrand | 02-717-166 | Cell culture |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses |
| Fluorescent Microscope | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | Fluorescent imaging |
| Hydrogen Peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Positive control |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | Human epithelial breast cancer cell line |
| Microcentrifuge tubes, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Cell culture |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | Cell culture |
| Pipet controller | Drummond | Hood Mate Model 360 | Cell culture |
| Serologycal pipet, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Cell culture |
| Serologycal pipet, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Cell culture |
| Serologycal pipet, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Cell culture |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 incubator for cell culture |
| Trypan blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell counting |
References
- Sies, H. Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Jones, D. P.
- Pizzino, G., et al. Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).
- Go, Y. M., Jones, D. P. Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).
- Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).
- Meyer, A. J., Dick, T. P.
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Björnberg, O., Østergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).
- Bhaskar, A., et al. Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).
- Loor, G., et al. Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Loor, G., et al. Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis. Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).
- Esposito, S., et al. Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).
- Meyer, A. J., et al. Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer. Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).
- Galvan, D. L., et al. Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy. Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).
- Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology. Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).
- Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes. Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).
