Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

甲基化RNA免疫沉淀分析研究m5C在阿拉伯的修改

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/61231
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua, 3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

甲基化RNA免疫沉淀检测是一种基于抗体的方法，用于丰富甲基化RNA片段。再加上深度测序，它导致识别承载m5C修改的抄本。

Abstract

RNA上的二次碱基修饰（如m5C）会影响改性RNA分子的结构和功能。甲基化RNA免疫沉淀和测序（MeRIP-seq）是一种旨在丰富甲基化RNA并最终识别修改后成绩单的方法。简言之，声波化RNA与5甲基化细胞素的抗体一起孵育，并在蛋白质G珠的帮助下沉淀。然后对浓缩碎片进行测序，并根据读数分布和峰值检测绘制潜在的甲基化位点。MeRIP可以应用于任何有机体，因为它不需要任何先前的序列或修改酶知识。此外，除了碎片外，RNA不接受任何其他化学或温度处理。然而，MeRIP-seq不像其他方法那样提供甲基化位点的单核苷酸预测，尽管甲基化区域可以缩小到几个核苷酸。使用不同的改性特异性抗体，可以根据RNA上存在的不同碱基修饰对MeRIP进行调整，从而扩展此方法的可能应用。

Introduction

在所有三个生命王国中，RNA物种都经过了转录后修改，对这些功能相关的生化修饰的研究被称为"表征学"。Epitranscript经济学是一个不断增长的领域，正在开发各种方法来研究和绘制RNA分子的修饰图（在1，2中回顾）。已发现一百多个RNA修改，检测到在rRNA，tRNA，其他ncRNA，以及mRNA3，4。虽然在tRNA和rNA中化学多样化的转录后修改的存在和功能被广泛研究5，6，7，8，直到最近才有mRNA修改的特点。在植物中，许多mRNA修改已被确定至今，包括m7G在帽结构9，m1A10，hm5C11，12，和尿化13。然而，只有米6A10，14，15，米5C11，16，17，和伪尿丁18被映射在阿拉比多普西斯全转录。后转录mRNA基地修改涉及几个发展过程19，20。

表皮经济学中最常用的方法之一是甲基化RNA免疫沉淀，以及深度测序（MeRIP-seq）。MeRIP-seq于2012年开发，以研究哺乳动物细胞21，22的m6A。它需要使用抗体进行所需的修改，旨在丰富携带改性核苷酸的RNA片段。之后通常进行深度测序，以识别和映射丰富的碎片或定量 PCR 以验证特定的 RNA 目标。MeRIP 的准确性基于抗体的特异性，以识别经过类似修改的改性核苷酸（例如，m 5 C 和 hm5C11，23）。除了m6A外，MeRIP-seq还应用于研究11、17、23、24、25等多种生物体的m1A和m5CRNA甲基化。

细胞素在第五碳位（m5C）的甲基化是最普遍的DNA修饰26，27和最常见的RNA修饰之一太3，4。虽然m5C在1975年28年在真核mRNA中被发现，但最近才有研究重点绘制修改转录全，在编码和非编码RNA11，16，17，23，29，30，31，32，33，34。

m5C RNA 研究中使用的替代方法包括将非甲基化细胞氨酸化学转化为尿素（双硫化物测序）和基于已知RNA细胞氨酸甲基转移酶与其RNA靶点不可逆转的结合的免疫沉淀检测（miCLIP，aza-IP）。简言之，双硫化物测序利用了5甲基化细胞素的特性，对二硫化钠治疗具有抗药性，这种治疗将未修饰的细胞素去除尿素。该方法最初是为DNA开发的，但也适用于RNA，许多研究都选择了这种方法来检测RNA16、23、29、32、34、35中的m 5C位点。miCLIP 和 aza-IP 都需要以前对 RNA 细胞氨酸甲基转移酶的了解和各自抗体的使用。在miCLIP（甲基化单核苷酸分辨率交叉链接和免疫沉淀）的情况下，甲基转移酶携带单个氨基酸突变，使其与RNA基板结合，但不能释放30。在 aza-IP （5-阿扎西丁 - 中介RNA免疫预测） 中，当 RNA 聚合酶由 RNA 聚合酶结合到目标 RNA 分子31时，5-azaC 核苷和 RNA 细胞素甲基转移酶之间形成不可逆转的结合。

这三种方法的主要优点是允许单核苷酸分辨率映射m5C。此外，miCLIP 和 aza-IP 提供有关选定的 RNA 细胞氨酸甲基转移酶的具体目标的信息，深入破译转录后 RNA 修改的机制和作用。但是，MeRIP-seq 方法可以在不需要任何事先知识的情况下识别全转录体 m5C 区域，并避免苛刻的化学和温度条件，例如双硫酸盐处理或 5-azaC 的孵化。梅里普和双硫酸盐测序都可以通过二级RNA结构36抑制。免疫沉淀前 MeRIP 检测中包含的碎片步骤旨在促进抗体结合并增加 m5C 识别的分辨率。

另一个值得一提的方法是RNA核苷的质谱（MS）。MS 可以在 DNA 和 RNA 上检测和区分任何类型的修饰。简言之，RNA被提取和DNase消化，然后脱盐和消化到单核苷酸。RNA核苷由质谱仪分析。这种方法可用于量化每个修改的水平，它不依赖于抗体或化学转换。然而，一个主要缺点是，它提供了大量有关RNA修改存在的信息。为了绘制修改图，MS 需要与 RNase 消化和特定RNA分子的测序信息相结合，例如人类 tRNALeu（CAA）37。

在这里，我们描述和讨论梅里普测定用于研究m5C RNA甲基化在阿拉比多普西斯17。

Protocol

1. 准备RNA

  1. 将200毫克的植物组织研磨到液氮粉末中，确保组织在整个过程中保持冷冻。
  2. 按照硫酸-苯酚-氯仿提取方案，从所需的植物组织中提取RNA。为了减少在相分离过程中用DNA污染RNA的可能性，请使用1-溴-3-氯丙烷代替氯仿。
    1. 将含有瓜尼丁硫酸酸和苯酚酸的RNA提取试剂加入研磨植物组织（每100毫克组织500μL）。通过倒置混合好，并确保所有的组织都是湿的。在室温下孵化10分钟，分离核糖核蛋白复合物。
    2. 离心机10分钟，在12，000 x g 在4°C，并将超纳坦转移到一个新的1.5 mL管。
    3. 加入 200 μL 的 1-bromo-3-氯丙烷（每 500 μL RNA 提取试剂 100 μL）和涡流。
    4. 离心机在 4 °C 下在 12，000 x g 下旋转 15 分钟，并将上水相（约 500 μL）转移到新的 1.5 mL 管中。
    5. 加入 1 卷异丙酚 （500μL） 和 0.1 卷 3 M 醋酸钠 pH 5.5 （50 μL），在 -20 °C 下倒置和沉淀 10 分钟，混合均好。
      注：建议使用醋酸钠（NaOAc），以增强RNA降水。此时，通过将RNA的降水时间延长数小时甚至一夜之间，可以暂停协议。
    6. 离心机 30 分钟， 在 12，000 x g 在 4 °C 和丢弃超纳坦。
    7. 用 80% EtOH 的 500 μL 清洗颗粒两次，在 4 °C 下在 12，000 x g 下将离心机洗涤 5 分钟，然后丢弃。
    8. 用 500 μL 99% EtOH 清洗颗粒一次，离心机在 4 °C 下在 12，000 x g 下清洗 5 分钟，然后丢弃。
    9. 干燥颗粒5-10分钟，溶解在30μL无RNase H2O。
      注：相反，使用任何选择的RNA提取协议（例如，基于列的系统）。如果协议中包含 DNase 消化，请在以下步骤中跳过它（步骤 1.3）。
  3. 测量RNA浓度（例如，使用光谱仪），并用DNase消化20μg的RNA。
    注：DNA富含m5C，抗体不区分DNA和RNA。
    1. 在典型的 DNase 反应中，在 50 μL 反应中处理 10μg 的RNA。混合以下组件，在 37 °C 下孵化反应 30 分钟：
      10μg 的RNA x μL
      10x 稀会缓冲区 5 μL
      D纳塞 1 μL （2 单位）
      无鼻 H2O 高达 50μL
    2. 通过添加适量的 DNase 灭活试剂（如果该试剂盒包含在 DNase 套件中并根据制造商的说明），或执行清理步骤（例如柱净化或苯酚/氯仿萃取），去除酶。
  4. 检查毛细纤维电泳分离RNA的质量和纯度，如果RNA完整性数字（RIN）高于7，则继续检查，以确保样品质量良好。
  5. 可选：删除核糖体RNA，以丰富mRNA含量的样品使用rRNA去除套件，并根据制造商的协议。
    1. 使用前一步骤的 DNase 处理 RNA 进行 rRNA 耗竭反应。如果总RNA的量超过反应建议的最大量，则执行多个反应。
    2. 请注意，只有 5-10% 的输入量将在 rRNA 耗尽后恢复。继续使用RNA耗尽RNA（所有样品的等量），忽略以下步骤中提到的金额，因为它们指的是总RNA。
      注：有关现有RNA耗竭方法的比较和描述，请参阅参考文献38、39、40。rRNA 是总RNA的主要部分，在许多生物体中甲基化为m5C。
  6. 提前准备体外成绩单 （IVT）， 用作对照 RNA 序列，并将其添加到样本中。
    1. 使用体外转录套件生产两种不同的 IVT，一种是非甲基化核苷，另一种是 rCTP 被 5-甲基-rCTP 取代，分别用作 MeRIP 中的负对照和正对照。编写的抄本是 埃格夫普 和 雷尼拉· 卢西费拉塞的笔录。
      注：IVT不应存在于您正在分析的生物体的转录体中。如果 IVT 来自同一个模板（例如，两个 EGFP），则在两个不同的样本中添加正负对照。如果他们的序列不同（例如，EGFP和雷尼拉），它们可以添加到同一个样本中。
    2. 作为对照组，每个样本中每 3 μg RNA 的峰值为 0.1 ng IVT。
  7. 将RNA声波化为大约100nt片段。
    注：RNA剪切的条件必须提前调整，每个声波器的条件也不同。对于此处使用的模型，声波处理具有以下条件：峰值功率 174、负载因子 10、循环/爆裂 200、17 分钟。
    1. 所有样品的RNA量相同，在总体积的80μL（最小60微升，最大100微升）中，每个样品至少12μg RNA，填充无RNase H 2 O。
  8. 通过毛细纤维化确认声波效率和RNA样品浓度。碎片RNA的平均大小应在100 nt左右。

2. 甲基化RNA免疫沉淀（梅里普）

  1. 在低绑定管中，添加 9 μg 的声波RNA 和无 RNase H2O 高达 60 μL（或更多，具体取决于浓度）。
  2. 在水浴中以70°C加热RNA10分钟，在冰水中再冷却10分钟，从而分离二级结构。
  3. 将样品分成三部分：三分之一（20 μL，如果在步骤 2.1 中取了 60 μL）保存在单独的管子中，以 -80 °C 作为输入样本。将剩余的 40 μL 填充无 Rnase H2O 至 860 μL，然后分成两个低绑定管：一个用于 IP，另一个用于模拟控制（每个管 430μL）。
  4. 添加到两个管子：
    50μL 的 10 倍梅里普缓冲区
    10μL 的 RNase 抑制剂
    模拟样品中每 10 μL H2O 的 IP 样本中的 10 μl α-m5C 抗体 （10 微克）
    注：以前使用的抗体克隆不再在商业上使用。然而，任何抗5-甲基西氨酸单克隆抗体都应该同样起作用。抗体应测试的特异性之前，用于梅里普11，23。
  5. 用准胶片密封管子，在4°C下孵育12-14小时，头顶旋转。
  6. 第二天，准备蛋白质G磁珠结合。
    1. 对于每个管（IP 或模拟控制），使用 40μL 的珠子。添加珠子总数（#管x 40μL， 例如，对于 2 个 IP 和 2 个模拟样品，需要 160μL 的珠子）在 15 mL 管中，用每个样品 800μL 的 1 倍 MeRIP 缓冲器洗三次（#管 x 800 μL 缓冲区，例如，2 个 IP 和 2 个模拟样品需要 3.2 mL）。
    2. 在室温下进行5分钟的头顶旋转清洗，在磁架的帮助下收集珠子，并丢弃洗涤缓冲区。第三次清洗后，将珠子重新悬在与采集的珠子初始体积相同的 1 倍 MeRIP 缓冲区中（管 x 40 μL 的#，例如，160μL 的 1x MeRIP 缓冲区，用于 2 个 IP 和 2 个模拟样品）。
      注：所使用的蛋白质G珠的量由特定抗体类型的珠子的结合能力和所使用的抗体量决定。在这种情况下，珠子的结合能力为每毫克珠子约8μg的鼠标IgG和30毫克/mL浓度。因此，40 μL 足以结合约 9.6 μg 的抗体。
  7. 在每个 IP 和 Mock 样本中添加 40 μL 的重新悬生珠子，并在 4 °C 下孵育 2 小时，并进行开销旋转。
  8. 将管子放在磁架上 1 分钟，丢弃超纳坦或将其保存为对照（非绑定 RNA 样本）。
  9. 通过在 1x MeRIP 缓冲器的 700 μL 中重新悬念 5 次，用 0.01% Tween 20 进行冲洗珠子，并在室温下通过头顶旋转孵育 10 分钟。
  10. 在 200 μL 蛋白酶 K 消化缓冲液中重新悬生洗过的珠子，并在 50 °C 下加入 3.5 μL 蛋白酶 K. 孵化剂 3 小时，在 800 rpm 时摇晃。偶尔，如果在孵化过程中形成珠子沉积物，则手动轻拂管底。
  11. 通过添加 800 μL 的RNA 提取试剂并遵循硫酸钛酸-苯酚-氯仿提取方案提取RNA，并按步骤 1.2 继续。为了提高RNA颗粒的能见度，在降水步骤中可以在异丙醇中加入彩色共沉淀剂。在无 RNaseH2 O 的 20 μL 中重新悬念颗粒（或等于第 2.3 步保持的输入体积）。

3. 下游分析

  1. 提交输入和 IP 样本，进行单端测序，50 个碱基读取长度 （SE50）。
  2. 使用切口41 修剪 3' 端适配器，丢弃小于 48 nt 的读数。
  3. 使用 STAR42 对阿拉比多普西斯基因组 （TAIR10 注释） 进行地图修剪读取，因不匹配和最大内子大小为 10 kb 而截止 6%。保持唯一映射读数以供进一步分析。
  4. 使用两种不同的方法识别 IP 样本中丰富的 RNA 片段与输入中的丰富RNA 片段，并考虑发现两者都显著丰富的片段。
    1. 首先，使用 MACS2 峰值呼叫者43 在汇集的 IPs 与输入上检测 MeRIP-seq 峰值。
    2. 其次，按照迈耶等人22 号和杨等人17号描述的梅里普-塞克峰呼叫分析。
      1. 使用自定义 R 脚本，将基因组分成不同的 25 nt 窗口，并根据上次映射的核苷酸的位置（因为读数源自 100 nt RNA 片段）计算每个窗口唯一映射读数。
      2. 与费舍尔精确测试的输入相比， 计算 IP 样本中的明显丰富窗口。使用本杰明尼 - 霍奇伯格程序纠正多个测试。
      3. 保留至少连续两个窗口和仅覆盖一个窗口的废弃山峰的显著丰富山峰。
  5. 通过这两种方法发现具有显著丰富峰值的基因组（成绩单）的注释区域。
  6. 或者，或补充，测试特定的RNA目标，以丰富其在IP样本。
    1. 反向转录RNA（输入、IP和模拟样本的相同体积）与随机六角形。
    2. 对所选目标执行定量实时 PCR，通过ΔΔCt方法比较输入、IP 和模拟。
      注：生成的产品不应长于 100 bp，因为这是平均碎片大小。

Representative Results

图1提供了该方法的示意图。协议的第一个关键步骤是获得质量良好的RNA（RIN ≥ 7），并将其声波化到大约 100 nt 片段。两个步骤的效率都由芯片毛细细的电泳机检查。在图 2A中，显示了一个好的RNA样本的代表性运行。样品在装载到芯片上之前被稀释 1：10，以便浓度在所用套件检测范围 （5-500 ng/μL） 中。同一样本也在声波后运行，并显示在图2B 中。请注意，图左侧有一个统一的峰值，大小约为 100 个核苷酸。浓度降低既是由于碎片过程中RNA损失造成的，也是由于样品体积增加（60-100 μL，步骤1.7.1）。

IP 和模拟样品的质量可以通过 qRT-PCR 进行评估。为此，尖峰IVT充当正负对照：甲基化IVT，在所有细胞素位置有m5C，预计将在IP样本中高度丰富：相反，非甲基化试管婴儿不应该有IP和模拟之间的区别。用于两个控制 IVT（EGFP 和 雷尼拉 卢西费拉斯） 的 qRT-PCR 检测的引物列在 表 1中。事实上，如 图3所示，大约80%的甲基化IVT是在IP样本中恢复的，而在模拟中只有大约2%。对于非甲基化控制，IP 和模拟样本的恢复率均低于 1%。这验证了 MeRIP 的效率，即甲基化 RNA 片段沉淀和丰富，并且是样品可用于下游分析的良好指标。此外，非甲基化 IVT（IP 与模拟比）的折叠浓缩可用作估计 qRT-PCR 检测中浓缩意义的阈值。

将读数对齐到基因组（图4）后，应用步骤 3.4.1 和 3.4.2 中描述的峰值调用算法来识别具有统计学意义的窗口，与输入相比，IP 样本中的内容丰富。与这些窗口相对应的序列可以进一步使用，例如搜索保存的甲基化相关图案11，17。

Figure 1
图1：梅里普-塞克协议的示意图表示。
RNA样本用5-甲基化细胞氨酸的抗体孵化，复合物用蛋白质G磁珠拉下，与绑定RNA一起捕获抗体。通过深度测序和 qRT-PCR 分析已分离的 RNA 样本。 请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 2
图2：RNA样品质量分析的代表性结果。
（A） 合格总RNA工厂样本的代表性概况。（B） 声波化后RNA样本的代表性配置文件至100nt片段。毛细纤维电泳软件的输出文件。 请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 3
图3：控制IVT的qRT-PCR分析。
甲基化和非甲基化体外记录分别用作 MeRIP 检测的正对照和负对照。免疫沉淀后，甲基化IVT在IP样品（绿色）中高度丰富，但在模拟样品中（无抗m5C抗体;紫色）。非甲基化 IVT 显示没有丰富，IP 和模拟之间没有区别。 请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 4
图 4： 阅读 MeRIP 前后的对齐，围绕有代表性的脚本。
读取与输入示例（上行）中的特定成绩单对齐，并在两个 IP 副本（中间和下行）中读取。黑匣子显示一个根据 MACS243 和 MeRIP-seq22 峰值调用分析识别的丰富 50 nt 长窗口。 请点击这里查看此数字的较大版本。

目标 引子对 产品序列 产品长度
埃格夫普 对于： 5'- 格卡塔卡加克 - 3' 格卡塔卡加加格
格特加卡茨格
格特加奇卡格特加格茨加格茨		 72 bp
修订： 5'- 格茨卡格特加特 -3'
雷尼拉·卢西费拉斯 对于： 5'- 加加塔特克特加特加加 - 3' 加加塔特克特加加克
阿特格卡特卡塔加
阿格塔加卡加加特加特加茨		 75 bp
修订： 5'- 格茨卡特克塔 -3'

表1：有关qRT-PCR分析的引物和生成产品的信息。

缓冲食谱。请点击这里下载此文件。

Discussion

RNA携带超过一百个不同的基础修改4，形成表征44。这些修改增加了一层对翻译和信号的监管（在5、6、8、20、45、46中审查）。早期的研究能够检测RNA28，47的转录后修改的存在，但具体的修改RNA需要确定，以了解表皮学的作用。MeRIP被设计成一种绘制RNA甲基化位点图的方法，全谱21，22。它可以适应任何修改，如果一个特定的抗体可用。

此协议的主要优点是，对于RNA和用户来说相对简单、安全（例如，5-azaC对植物和人类具有剧毒），不需要序列或修改酶信息。此外，与不包含浓缩步骤的双硫酸盐测序不同，IP 对甲基化RNA的浓缩增加了检测低丰度 mRNA 的机会。当执行两轮连续的梅里普时，含有甲基化位点的RNA片段的浓缩量进一步增加22。MeRIP的局限性之一，特别是应用于mRNA甲基化研究时，是作为检测输入所需的大量RNA。核糖核酸消耗（或聚（A）浓缩）步骤将减少严重改性核糖体RNA造成的背景，但它可去除总RNA的90%以上。DNA也必须完全去除，因为它富含5甲基化细胞素。另一个缺点是甲基化精确位置的分辨率较低。用抗体孵化前RNA的声波有助于朝这个方向发展，将含有改性剂的区域缩小到100-200核苷酸。当 MeRIP 与深度测序相结合时，m5C 站点预测的分辨率会随着测序读数形成围绕潜在甲基化站点的高斯分布而增加。此外，抗体的特异性需要在检测前得到确认（例如，用RNA点斑点检测，用改性核苷酸合成的寡头进行），然而，抗体在多大程度上实际上可以区分密切相关的修饰（例如，m6A 和 m6Am）是该领域48、49中的一个争论点。此外，高度结构化的RNA可能会干扰抗体-抗原相互作用，另一个限制主要通过在IP之前RNA的分裂和自然来解决。相反，同样受二次结构影响的双硫酸盐测序不包括碎片步骤，这可能是造成m5C位点与双硫酸盐测序16和MeRIP-seq11、17预测的mRNA之间差异的原因之一。其他细胞氨酸修饰（例如，hm5C）也对双硫酸盐介质脱氨35具有抗药性。

MeRIP-seq 的修改包括交叉链接步骤， 要么引入光活性核糖核苷酸（光交叉链接辅助m6A-seq，PA-m6A-seq 50），要么使用紫外线在IP（miCLIP49，不同于导言30中描述的miCLIP，但也与单核苷酸分辨率不同）后创建抗体-RNA交叉链路。将来，随着有关RNA甲基化的知识的积累，基于甲基化出现的修改酶和/或协商一致的序列，更有针对性的方法可能更可取。读取蛋白的识别对于理解转录后修改的分子和信号功能至关重要。Nanopore 测序技术已经允许在没有事先处理 RNA17 的情况下直接识别改性核苷酸，但在序列深度和生物信息分析方面仍有改进的余地。总体而言，MeRIP-seq 目前是识别甲基化RNA成绩单的既定、可靠和公正的方法。

Disclosures

作者没有利益冲突可以披露。

Acknowledgments

这项工作得到了E.S的IMPS博士津贴、EMBO对V.P.的长期研究金和对F.K.的MPI-MPP内部资金的支持。 这项工作的一部分也通过PLAMORF提供资金，该项目已获得欧洲研究理事会（ERC）根据欧洲联盟的Horizan 2020研究与创新方案（赠款协议第810131号）提供资金。作者要感谢费德里科·阿佩尔特对手稿的生物信息分析和评论，以及马蒂厄·巴欣和阿米拉·克拉姆迪的生物信息分析。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-m5C antibody ZymoResearch A3001 (discontinued), A3002 available Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available
Chip and reagents for capillary electrophoresis Agilent 5067-1511 RNA 6000 Nano kit
Dnase Ambion AM1907 TURBO DNA-free kit
Co-precipitant of nucleic acids Ambion AM9515 Glycoblue, 15 mg/mL
In vitro transcription kit Promega P1300 T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System
Low-binding reaction tubes Kisker Biotech G017 1.7 ml microcentrifuge tubes
Protein G magnetic beads Invitrogen 10003D Dynabeads Protein G
Proteinase K Ambion AM2546 20mg/mL stock solution, RNA grade
RNase inhibitor Promega N2615 RNasin Plus 40 U/μl
rRNA removal kit Epicentre RZPL11016 Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)
Sonication tubes Covaris 520045 microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm
RNA extraction reagent Ambion 15596018 TRIzol reagent
Equipment
Capillary electrophoresis machine Agilent G2939BA 2100 Bioanalyzer System
Magnetic rack Invitrogen 12321D DynaMag-2
Microcentrifuge Eppendorf discontinued 5417R model
Rotator Benchmark R4040 RotoBot Mini
Sonicator Covaris 500217 S220 Focused-ultrasonicator
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONEC-W NanoDrop OneC
Waterbath GFL 1012 1012 Incubation bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trixl, L., Lusser, A. The dynamic RNA modification 5-methylcytosine and its emerging role as an epitranscriptomic mark. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), 1-17 (2019).
  2. Mongan, N. P., Emes, R. D., Archer, N. Detection and analysis of RNA methylation. F1000Research. 8, 559 (2019).
  3. Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, SUPPL 1 195-201 (2011).
  4. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 303-307 (2018).
  5. Agris, P. F. Bringing order to translation: the contributions of transfer RNA anticodon-domain modifications. EMBO reports. 9 (7), 629-635 (2008).
  6. Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. Expanding the Nucleotide Repertoire of the Ribosome with Post-Transcriptional Modifications. ACS Chemical Biology. 2 (9), 610-619 (2007).
  7. Gigova, A., Duggimpudi, S., Pollex, T., Schaefer, M., Koš, M. A cluster of methylations in the domain IV of 25S rRNA is required for ribosome stability. RNA. 20 (10), New York, N.Y. 1632-1644 (2014).
  8. Motorin, Y., Helm, M. tRNA Stabilization by Modified Nucleotides. Biochemistry. 49 (24), 4934-4944 (2010).
  9. Shatkin, A. Capping of eucaryotic mRNAs. Cell. 9 (4), 645-653 (1976).
  10. Shen, L., et al. N 6 -Methyladenosine RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate in Arabidopsis. Developmental Cell. 38 (2), 186-200 (2016).
  11. Cui, X., et al. 5-Methylcytosine RNA Methylation in Arabidopsis Thaliana. Molecular Plant. 10 (11), 1387-1399 (2017).
  12. Huber, S. M., et al. Formation and abundance of 5-hydroxymethylcytosine in RNA. ChemBioChem. 16 (5), 752-755 (2015).
  13. Zuber, H., et al. Uridylation and PABP Cooperate to Repair mRNA Deadenylated Ends in Arabidopsis. Cell Reports. 14 (11), 2707-2717 (2016).
  14. Luo, G. Z., et al. Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana. Nature Communications. 5 (1), 5630 (2014).
  15. Wan, Y., et al. Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana. Genome Biology. 16 (1), 1-26 (2015).
  16. David, R., et al. Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs. The Plant Cell. 29 (3), 445-460 (2017).
  17. Yang, L., et al. m5C Methylation Guides Systemic Transport of Messenger RNA over Graft Junctions in Plants. Current Biology. 29 (15), 2465-2476 (2019).
  18. Sun, L., et al. Transcriptome-wide analysis of pseudouridylation of mRNA and non-coding RNAs in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 70 (19), 5089 (2019).
  19. Chmielowska-Bąk, J., Arasimowicz-Jelonek, M., Deckert, J. In search of the mRNA modification landscape in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 421 (2019).
  20. Liang, Z., Riaz, A., Chachar, S., Ding, Y., Du, H., Gu, X. Epigenetic Modifications of mRNA and DNA in Plants. Molecular Plant. 13 (1), 14-30 (2020).
  21. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  22. Meyer, K. D., et al. Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3' UTRs and near Stop Codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  23. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m5C within archaeal mRNAs. PLoS genetics. 9 (6), 1003602 (2013).
  24. Dominissini, D., et al. The dynamic N1-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
  25. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N1-methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
  26. Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. Journal of Biological Chemistry. 175 (175), 315-332 (1948).
  27. Wyatt, G. R. Occurence of 5-Methyl-Cytosine in Nucleic Acids. Nature. 166, 237-238 (1950).
  28. Dubin, D. T., Taylor, R. H. The methylation state of poly A-containing- messenger RNA from cultured hamster cells. Nucleic Acids Research. 2 (10), 1653-1668 (1975).
  29. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1-16 (2017).
  30. Hussain, S., et al. NSun2-mediated cytosine-5 methylation of vault noncoding RNA determines its processing into regulatory small RNAs. Cell Reports. 4 (2), 255-261 (2013).
  31. Khoddami, V., Cairns, B. R. Identification of direct targets and modified bases of RNA cytosine methyltransferases. Nature biotechnology. 31 (5), 458-464 (2013).
  32. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  33. Yang, X., et al. 5-methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27 (5), 606-625 (2017).
  34. Burgess, A., David, R., Searle, I. R. Conservation of tRNA and rRNA 5-methylcytosine in the kingdom Plantae. BMC Plant Biology. 15 (1), 199 (2015).
  35. Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Research. 37 (2), (2009).
  36. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nature Genetics. 37 (8), 853-862 (2005).
  37. Auxilien, S., Guérineau, V., Szweykowska-Kulińska, Z., Golinelli-Pimpaneau, B. The human tRNA m (5) C methyltransferase Misu is multisite-specific. RNA Biology. 9 (5), 1331-1338 (2012).
  38. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  39. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7 (1), 41114 (2017).
  40. Huang, Y., Sheth, R. U., Kaufman, A., Wang, H. H. Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics. Nucleic Acids Research. 48 (4), 20 (2020).
  41. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  42. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  43. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).
  44. Saletore, Y., et al. The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications. Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).
  45. Schwartz, S. Cracking the epitranscriptome. RNA. 22 (2), 169-174 (2016).
  46. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2016).
  47. Keith, G. Mobilities of modified ribonucleotides on two-dimensional cellulose thin-layer chromatography. Biochimie. 77 (1-2), 142-144 (1995).
  48. Feederle, R., Schepers, A. Antibodies specific for nucleic acid modifications. RNA Biology. 14 (9), 1089-1098 (2017).
  49. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  50. Chen, K., et al. High-Resolution N 6 -Methyladenosine (m 6 A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m 6 A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).

Tags

遗传学， 第 159 期， RNA 甲基化， 5 甲基西氨酸 （m5C）， 免疫预测 （IP）， 阿拉比多普西斯， 表皮学， mRNA， RNA 测序

Erratum

Formal Correction: Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis
Posted by JoVE Editors on 05/19/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. The author list was updated.

The author list was updated from:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua

to:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

甲基化RNA免疫沉淀分析研究m<sup>5C</sup>在阿拉伯的修改
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saplaoura, E., Perrera, V., Colot,… More

Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (159), e61231, doi:10.3791/61231 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter