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Genetics

मिथाइलेटेड आरएनए इम्यूनोप्रिपिपिटेशन परख अरबीडोप्सिस में एम5सी संशोधन का अध्ययन करने के लिए

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/61231
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua, 3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

मिथाइलेटेड आरएनए इम्यूनोप्रिपिटेशन परख एक एंटीबॉडी-आधारित विधि है जो मेथिलेटेड आरएनए टुकड़ों के लिए समृद्ध करने के लिए उपयोग की जाती है। गहरी अनुक्रमण के साथ मिलकर, यह एम 5 सी संशोधन ले जाने वाले टेप की पहचान की ओरजाताहै।

Abstract

आरएनए पर माध्यमिक आधार संशोधन, जैसे एम5सी, संशोधित आरएनए अणुओं की संरचना और कार्य को प्रभावित करते हैं। मिथाइलेटेड आरएनए इम्यूनोप्रिपिटेशन एंड सीक्वेंसिंग (मेरीरिप-एसईक्यू) एक ऐसी विधि है जिसका उद्देश्य मिथाइलेटेड आरएनए के लिए समृद्ध करना और अंततः संशोधित टेप की पहचान करना है। संक्षेप में, सोनिकेटेड आरएनए को 5-मिथाइलेटेड साइटोसाइन के लिए एक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटेड किया जाता है और प्रोटीन जी मोतियों की सहायता से उपजी होती है। समृद्ध टुकड़ों को अनुक्रमित किया जाता है और संभावित मिथाइलेशन साइटों को रीड्स और पीक डिटेक्शन के वितरण के आधार पर मैप किया जाता है। MeRIP किसी भी जीव के लिए लागू किया जा सकता है, क्योंकि यह किसी भी पूर्व अनुक्रम या एंजाइम ज्ञान को संशोधित करने की आवश्यकता नहीं है । इसके अलावा, विखंडन के अलावा, आरएनए किसी अन्य रासायनिक या तापमान उपचार के अधीन नहीं है। हालांकि, MeRIP-seq अन्य तरीकों के रूप में मिथाइलेशन साइट की एकल न्यूक्लियोटाइड भविष्यवाणी प्रदान नहीं करता है, हालांकि मिथाइलेटेड क्षेत्र को कुछ न्यूक्लियोटाइड तक संकुचित किया जा सकता है। विभिन्न संशोधन-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग इस विधि के संभावित अनुप्रयोगों का विस्तार करते हुए आरएनए पर मौजूद विभिन्न आधार संशोधनों के लिए MeRIP को समायोजित करने की अनुमति देता है।

Introduction

जीवन के सभी तीन राज्यों में, आरएनए प्रजातियां पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों से गुजरती हैं और इन कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक जैव रासायनिक संशोधनों पर अनुसंधान को "एपिट्राएंस्क्रिप्टोमिक्स" कहा जाता है। एपिट्राएंस्क्रिप्टोमिक्स एक बढ़ता हुआ क्षेत्र है और आरएनए अणुओं(1,2में समीक्षा) पर संशोधनों का अध्ययन करने और उन्हें मैप करने के लिए विभिन्न तरीकों को विकसित किया जा रहा है। आरएनए, टीआरएनए, अन्य एनसीआरएन, साथ ही एमआरएएनए3,4में सौ से अधिक आरएनए संशोधन पाए गए हैं। यद्यपि टीआरएनए और आरआरएएनए में रासायनिक रूप से विविध पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों की उपस्थिति और कार्य का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया जाता है5,6,7,8,केवल हाल ही में एमआरएनए संशोधनों की विशेषता है। पौधों में, कई एमआरएनए संशोधनों की पहचान की गई है, जिनमें कैप संरचना9,एम 1 ए10,एचएम5सी11,12और यूडिलेशन13पर एम7जी शामिल हैं। हालांकि, अरबीडोप्सिस में केवल एम6ए10,14,15,एम5सी11,16,17और छद्म डाइन18 को ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड मैप किया गया है। पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल एमआरएनए बेस संशोधन कई विकास प्रक्रियाओं में शामिल हैं19,20।

एपिट्राएंस्क्रिप्टॉमिक्स में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोणों में से एक मिथाइलेटेड आरएनए इम्यूनोप्रिपिटेशन है जो डीप सीक्वेंसिंग (MeRIP-seq) के साथ मिलकर है। मेरीरिप-सेक्यू को 2012 में स्तनधारी कोशिकाओं21, 22में एम6ए का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गयाथा। यह वांछित संशोधन के लिए एक एंटीबॉडी के उपयोग की आवश्यकता है और आरएनए के टुकड़े संशोधित न्यूक्लियोटाइड (एस) ले जाने के लिए समृद्ध करने के लिए करना है । इसके बाद आमतौर पर विशिष्ट आरएनए लक्ष्यों को सत्यापित करने के लिए समृद्ध टुकड़ों या मात्रात्मक पीसीआर की पहचान करने और उन्हें मैप करने के लिए गहन अनुक्रमण किया जाता है। मेरीरिप की सटीकता इसी तरह के संशोधनों (जैसे, एम 5 सी औरएचएम5सी11,23)पर संशोधित न्यूक्लियोटाइड को पहचानने के लिए एंटीबॉडी की विशिष्टता पर आधारित है। एम6ए के अलावा, कईजीवों 11, 17, 23,24,25में एम1ए और एम 5 सी आरएनए मिथाइलेशन का अध्ययन करनेकेलिए भी MeRIP-seq लागू किया गया है।

पांचवें कार्बन स्थान (एम5सी) पर साइटोसाइन का मिथाइलेशन सबसे प्रचलित डीएनए संशोधन26,27 और सबसे आम आरएनए संशोधनों में से एक है जो3,4है। जबकि 1 97528में यूकेरियोटिक एमआरएएनए में एम 5 सी का पता लगाया गया था, हाल ही में अध्ययनों में कोडिंग और गैर-कोडिंग आरएनए11, 16,17,23, 29,30, 32,33, 34में संशोधन ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड मानचित्रण पर ध्यान केंद्रित किया गया है।

एम5सी आरएनए अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले वैकल्पिक तरीकों में गैर-मिथाइलेटेड साइटोसाइन को यूरासिल (बिसुल्फिट अनुक्रमण) में रासायनिक रूपांतरण और इम्यूनोप्रिपिपिटेशन एक ज्ञात आरएनए साइटोसाइन मेथिलट्रांसफेरेज के एक अपरिवर्तनीय बाध्यकारी के आधार पर अपने आरएनए लक्ष्यों (एमआईक्लिप, एज़ा-आईपी) में शामिल है। संक्षेप में, बिसुल्फिट अनुक्रमण 5-मिथाइलेटेड साइटोसिन की विशेषता को सोडियम बिसुल्फिट उपचार के लिए प्रतिरोधी बनाता है जो असंशोधित साइटोसिन को उरासिल से अलग करता है। यह विधि पहले डीएनए के लिए विकसित की गई थी लेकिन आरएनए के लिए भी अनुकूलित की गई थी और कई अध्ययनों ने आरएनए16, 23 , 29 , 34, 34,35में एम5सी साइटों का पता लगानेकेलिए इस दृष्टिकोण को चुना है । मिशिप और अज़ा-आईपी दोनों को आरएनए साइटोसाइन मिथाइलट्रांसफेरेज और संबंधित एंटीबॉडी के उपयोग के पिछले ज्ञान की आवश्यकता होती है। मिक्लिप (मिथाइलाइजेशन इंडिविजुअल-न्यूक्लियोटाइड-रिजॉल्यूशन क्रॉसलिंकिंग और इम्यूनोप्रिपिटेशन) के मामले में, मिथाइलट्रांसफरेज में एक ही अमीनो एसिड उत्परिवर्तन होता है ताकि यह आरएनए सब्सट्रेट से बांध सके लेकिन30को जारी नहीं किया जा सकता । अज़ा-आईपी (5-अज़ासाइटिडीन-मध्यस्थता आरएनए इम्यूनोप्रिपिटेशन) में, अपरिवर्तनीय बाध्यकारी 5-अज़ैक न्यूक्लियोसाइड और आरएनए साइटोसाइन मिथाइलट्रांसेफेरेज के बीच बनता है जब एक्सोजेनोसली प्रदान किया जाता है 5-azaC आरएनए बहुलक द्वारा एक लक्ष्य आरएनए अणु31में शामिल किया जाता है।

इन तीन तरीकों का मुख्य लाभ यह है कि वे एम5सी के एकल न्यूक्लियोटाइड संकल्प मानचित्रण की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, मिशिप और अज़ा-आईपी एक चयनित आरएनए साइटोसाइन मिथाइलट्रांसफेरेज के विशिष्ट लक्ष्यों के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, जो पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए संशोधनों के तंत्र और भूमिका को गहराई से समझते हैं। हालांकि, MeRIP-seq दृष्टिकोण किसी भी पिछले आवश्यक ज्ञान के बिना ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड एम5सी क्षेत्रों की पहचान कर सकता है और कठोर रासायनिक और तापमान की स्थिति से बचा जाता है, जैसे कि 5-azaC के साथ बिसुल्फिट उपचार या इनक्यूबेशन। मेरिप और बिसुलफिट अनुक्रमण दोनों को माध्यमिक आरएनए संरचनाओं द्वारा बाधित किया जा सकता है36. इम्यूनोप्रिपिcipitेशन से पहले मेरिप परख में शामिल विखंडन कदम का उद्देश्य एंटीबॉडी बाइंडिंग को सुविधाजनक बनाना और एम5सी पहचान के संकल्प को बढ़ाना है।

उल्लेख के लायक एक और विधि आरएनए न्यूक्लियोसाइड्स की मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) है। एमएस डीएनए और आरएनए दोनों पर किसी भी प्रकार के संशोधन का पता लगा सकता है और अलग कर सकता है। संक्षेप में, आरएनए निकाला जाता है और DNase पचा जाता है, फिर एक न्यूक्लियोसाइड्स को कम और पचा दिया जाता है। आरएनए न्यूक्लियोसाइड्स का विश्लेषण मास स्पेक्ट्रोमीटर से किया जाता है। इस विधि का उपयोग प्रत्येक संशोधन के स्तर को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है और यह एंटीबॉडी या रासायनिक रूपांतरण पर भरोसा नहीं करता है। हालांकि, एक बड़ी खामी यह है कि यह आरएनए संशोधनों की उपस्थिति के बारे में थोक जानकारी प्रदान करता है। संशोधनों को मैप करने के लिए, एमएस को मानव टीआरएनएएलयू(सीएए)37के मामले में, विशिष्ट आरएनए अणुओं के बारे में आरएनएएस पाचन और अनुक्रमण जानकारी के साथ जोड़ा जाना चाहिए।

यहां, हम अरबीडोप्सिस17में एम5सी आरएनए मिथाइलेशन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले MeRIP परख का वर्णन और चर्चा करते हैं।

Protocol

1. आरएनए की तैयारी

  1. तरल नाइट्रोजन में पाउडर के लिए 200 मिलीग्राम पौधे के ऊतकों को पीसें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि ऊतक पूरी प्रक्रिया में जमे हुए रहता है।
  2. एक एसिड ग्वानिउद्दीनियम थिओसाइनेट-फिनॉल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण प्रोटोकॉल के बाद वांछित पौधे के ऊतकों से आरएनए निकालें। चरण पृथक्करण के दौरान डीएनए के साथ आरएनए को दूषित करने की संभावना को कम करने के लिए, क्लोरोफॉर्म के बजाय 1-ब्रोमो-3-क्लोरोप्रोपेन का उपयोग करें।
    1. पीस पौधे के ऊतकों (500 माइक्रोन प्रति 100 मिलीग्राम ऊतक) में ग्वानिडीन थिओसाइनेट और एसिड फिनोल युक्त आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट का 1 एमएल जोड़ें। उलटा करके अच्छी तरह से मिलाएं और सुनिश्चित करें कि सभी ऊतक गीले हैं। राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन परिसरों को अलग करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज और एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में सुपरनैंट स्थानांतरित करें।
    3. 1-ब्रोमो-3-क्लोरोप्रोपेन (100 माइक्रोन प्रति 500 माइक्रोन आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट) और भंवर के 200 माइक्रोल को सख्ती से जोड़ें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 x ग्राम पर 15 मिनट के लिए सेंट्रलाइज और ऊपरी जलीय चरण (लगभग 500 μL) को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. आइसोप्रोपैनॉल (500 माइक्रोन) की 1 मात्रा और 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच 5.5 (50 माइक्रोन) की 0.1 मात्रा जोड़ें, -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट को उलटा और तेज़ करके अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: आरएनए वर्षा को बढ़ाने के लिए सोडियम एसीटेट (नाओएसी) के उपयोग की सिफारिश की जाती है। प्रोटोकॉल कुछ घंटों या यहां तक कि रात भर के लिए आरएनए की वर्षा को लंबा करके इस बिंदु पर रोका जा सकता है।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 x ग्राम पर 30 मिनट के लिए सेंट्रलाइज और सुपरनैंट को त्यागें।
    7. 80% एटोह के 500 माइक्रोन के साथ दो बार गोली धोएं, 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें और त्यागें।
    8. 500 माइक्रोन 99% एटोह के साथ एक बार गोली धोएं, 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें और त्यागें।
    9. 5-10 मिनट के लिए गोली सूखी और RNase मुक्त एच2O के 30 μL में भंग ।
      नोट: इसके बजाय, पसंद के किसी भी आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, एक कॉलम आधारित प्रणाली)। यदि एक DNase पाचन प्रोटोकॉल में शामिल है, यह निम्नलिखित चरण (चरण 1.3) में छोड़ दें।
  3. आरएनए एकाग्रता को मापें (उदाहरण के लिए, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के उपयोग के साथ) और DNase के साथ आरएनए के 20 माइक्रोग्राम को पचाें।
    नोट: डीएनए एम5सी में समृद्ध है और एंटीबॉडी डीएनए और आरएनए के बीच अंतर नहीं करता है ।
    1. एक ठेठ DNase प्रतिक्रिया में, एक 50 μL प्रतिक्रिया में आरएनए के 10 माइक्रोन का इलाज करें। निम्नलिखित घटकों को मिलाएं और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया (ओं) को इनक्यूबेट करें:
      आरएनए एक्स माइक्रोन के 10 माइक्रोग्राम
      10x DNase बफर 5 माइक्रोन
      DNase 1 μL (2 इकाइयों)
      RNase मुक्त एच2O अप करने के लिए 50 μL
    2. एंजाइम को या तो DNase निष्क्रियता अभिवाचण की एक उपयुक्त मात्रा जोड़कर हटा दें (यदि इसे DNase किट में और निर्माता के निर्देशों के अनुसार शामिल किया गया है) या एक सफाई कदम (जैसे, कॉलम शुद्धिकरण या फिनोल/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण) का प्रदर्शन करके।
  4. केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग आरएनए की गुणवत्ता और शुद्धता की जांच करें और आगे बढ़ें यदि आरएनए अखंडता संख्या (आरआईआर) 7 से अधिक है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूने अच्छी गुणवत्ता के हैं।
  5. वैकल्पिक: एक RRNA हटाने किट का उपयोग कर mRNA सामग्री में नमूनों को समृद्ध करने के लिए रिबोसोमल आरएनए निकालें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ।
    1. आरएनए की कमी प्रतिक्रिया (एस) के लिए पिछले चरण से DNase इलाज आरएनए का उपयोग करें। यदि कुल आरएनए की मात्रा प्रतिक्रिया के लिए सुझाए गए अधिकतम राशि से अधिक है तो कई प्रतिक्रियाएं करें।
    2. ध्यान रहे कि आरआरएनए की कमी के बाद इनपुट राशि का केवल 5-10 फीसद ही वसूल किया जाएगा। आरएनए समाप्त आरएनए (सभी नमूनों के लिए समान राशि) के साथ आगे बढ़ें और निम्नलिखित चरणों में उल्लिखित राशियों की अनदेखी करें, क्योंकि वे कुल आरएनए का उल्लेख करते हैं।
      नोट: उपलब्ध आरआरएनए की कमी के तरीकों की तुलना और विवरण के लिए संदर्भ 38,39,40देखें। आरएनए कुल आरएनए का प्रमुख हिस्सा है और कई जीवों में एम5सी मेथिलेटेड है।
  6. नियंत्रण आरएनए दृश्यों के रूप में उपयोग किए जाने वाले इन विट्रो ट्रांसक्रिप्ट (आईवीटी) में अग्रिम रूप से तैयार करें और उन्हें नमूनों में जोड़ें।
    1. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करके दो अलग-अलग आईवीटी का उत्पादन करें, एक गैर-मिथाइलेटेड न्यूक्लियोसाइड के साथ और एक जहां आरसीटीपी को 5-मिथाइल-आरसीटीपी द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, क्रमशः मेरिप में नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करता है। तैयार किए गए ट्रांसक्रिप्ट ईजीएफपी और रेनिला लूसिफ़ेरेस के थे ।
      नोट: IVTs जीव आप विश्लेषण कर रहे है की प्रतिलिपि में मौजूद नहीं होना चाहिए । यदि IVTs एक ही टेम्पलेट (जैसे, दोनों ईजीएफपी) से हैं, तो दो अलग-अलग नमूनों में सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण जोड़ें। यदि उनका अनुक्रम अलग है (उदाहरण के लिए, ईजीएफपी और रेनिला), तो उन्हें एक ही नमूने में जोड़ा जा सकता है।
    2. प्रत्येक नमूने में स्पाइक 0.1 एनजी आईवीटी प्रति 3 माइक्रोन आरएनए, नियंत्रण के रूप में।
  7. लगभग 100 nt टुकड़ों के लिए आरएनए का दर्जा।
    नोट: आरएनए कतरनी के लिए शर्तों को पहले से समायोजित किया जाना चाहिए और वे प्रत्येक सोनिकेटर के लिए अलग हैं। यहां उपयोग किए जाने वाले मॉडल के लिए, सोनिकेशन निम्नलिखित शर्तों के साथ किया जाता है: पीक पावर 174, ड्यूटी फैक्टर 10, चक्र/
    1. सभी नमूनों के लिए आरएनए की एक ही राशि को सोनिकेट करें, कुल मात्रा के 80 माइक्रोन (न्यूनतम 60 माइक्रोन, अधिकतम 100 माइक्रोल) में प्रति नमूना कम से कम 12 माइक्रोन आरएनए, आरएनएसई-मुक्त एच2ओ से भरा हुआ।
  8. केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा सोनीशन की दक्षता और आरएनए नमूनों की एकाग्रता की पुष्टि करें। खंडित आरएनए का औसत आकार लगभग 100 एनटी होना चाहिए।

2. मिथाइलेटेड आरएनए इम्यूनोप्रिपिटेशन (मेरीरिप)

  1. कम बाध्यकारी ट्यूबों में, 9 माइक्रोन सोनिकेटेड आरएनए और आरएनए-फ्री एच2ओ को 60 माइक्रोन (या अधिक, एकाग्रता के आधार पर) तक जोड़ें।
  2. 10 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में 70 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए गर्म करके माध्यमिक संरचनाओं को अलग करें और बर्फ-पानी मिश्रण में अतिरिक्त 10 मिनट के लिए ठंडा करें।
  3. नमूना को तीन भागों में विभाजित करें: एक तिहाई (20 माइक्रोल, यदि 60 माइक्रोन चरण 2.1 में लिया गया था) इनपुट नमूने के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर एक अलग ट्यूब में बचाया जाता है। शेष 40 माइक्रोन को आरएनएसई-मुक्त एच2ओ के साथ 860 माइक्रोन तक भरें और फिर दो कम बाध्यकारी ट्यूबों में विभाजित करें: आईपी के लिए एक और मॉक कंट्रोल के लिए एक (430 माइक्रोन प्रत्येक)।
  4. दोनों ट्यूबों में जोड़ें:
    10x MeRIP बफर के 50 माइक्रोन
    RNase अवरोधक के 10 माइक्रोन
    नकली नमूने में एच 2 ओ के प्रति 10 माइक्रोन आईपी नमूने में α-एम5सी एंटीबॉडी(10माइक्रोग्राम) के 10 माइक्रोन
    नोट: पहले इस्तेमाल किया एंटीबॉडी क्लोन व्यावसायिक रूप से अब उपलब्ध नहीं है । हालांकि, किसी भी विरोधी 5-मिथाइलसाइटोसाइन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी इसी तरह काम करना चाहिए। मेरीप11,23के लिए उपयोग करने से पहले एंटीबॉडी का विशिष्टता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए ।
  5. पैराफिल्म के साथ ट्यूबों को सील करें और ओवरहेड रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 12-14 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. अगले दिन प्रोटीन जी चुंबकीय मोती को बाइंडिंग के लिए तैयार करें।
    1. प्रत्येक ट्यूब (या तो आईपी या मॉक कंट्रोल) के लिए, मोतियों के 40 माइक्रोन का उपयोग करें। मोतियों की कुल मात्रा जोड़ें (ट्यूब x 40 μL के #, उदाहरण के लिए, 2 आईपी और 2 मॉक नमूनों के लिए, 15 एमएल ट्यूब में 160 माइक्रोन मोतियों की आवश्यकता होती है और प्रति नमूना 1x मेरीप बफर के 800 माइक्रोन के साथ तीन बार धोएं (# ट्यूब x 800 माइक्रोन बफर, उदाहरण के लिए, 2 आईपी और 2 मॉक नमूनों के लिए 3.2 mL)।
    2. ओवरहेड रोटेशन के साथ 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धोता प्रदर्शन करें, एक चुंबकीय रैक की मदद से मोतियों को इकट्ठा करें और वाशिंग बफर को त्यागें। तीसरे धोने के बाद, मोतियों को 1x मेरीप बफर की प्रारंभिक मात्रा के रूप में फिर से खर्च करें (# ट्यूब x 40 माइक्रोल, उदाहरण के लिए, 2 आईपी और 2 मॉक नमूनों के लिए 1x MeRIP बफर के 160 माइक्रोन)।
      नोट: प्रोटीन जी मोतियों की मात्रा का उपयोग विशिष्ट एंटीबॉडी प्रकार के लिए मोतियों की बाध्यकारी क्षमता और इस्तेमाल किए गए एंटीबॉडी की मात्रा से निर्धारित होता है। इस मामले में, मोतियों में लगभग 8 माइक्रोन माउस आईजीजी प्रति मिलीग्राम मोतियों और 30 मिलीग्राम/एमएल एकाग्रता की बाध्यकारी क्षमता होती है। इसलिए, 40 माइक्रोन एंटीबॉडी के लगभग 9.6 माइक्रोग्राम को बांधने के लिए पर्याप्त हैं।
  7. प्रत्येक आईपी और मॉक सैंपल में पुनर्नक्षित मोतियों के 40 माइक्रोन जोड़ें और ओवरहेड रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. ट्यूबों को 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर रखें और सुपरनैंट को त्याग दें या इसे नियंत्रण (गैर-बाध्य आरएनए नमूना) के रूप में सहेजें।
  9. 1x मेरीप बफर के 700 माइक्रोन में पुनर्व्यय करके मोतियों को 5 बार धोएं 0.01% ट्वीन 20 के साथ आपूर्ति की जाती है और ओवरहेड रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग करती है।
  10. प्रोटीन के पाचन बफर के 200 माइक्रोन में धोए गए मोतियों को फिर से रीस करें और 800 आरपीएम पर मिलाते हुए 50 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए प्रोटीनेज के इन्क्यूबेट का 3.5 माइक्रोन जोड़ें। कभी-कभी, इनक्यूबेशन के दौरान मोतियों की तलछट बनाने पर ट्यूब के नीचे मैन्युअल रूप से झटका दें।
  11. आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट के 800 माइक्रोल के अलावा और एक एसिड ग्वानिउद्दीनियम थिओसाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण प्रोटोकॉल का पालन करके आरएनए निकालें, और चरण 1.2 में जारी रखें। आरएनए गोली की दृश्यता बढ़ाने के लिए, वर्षा चरण में आइसोप्रोपैनॉल में एक रंगीन सह-तेज़ जोड़ा जा सकता है। आरएनएसई-मुक्त एच 2 ओ (या स्टेप 2.3 में रखे इनपुट वॉल्यूम के बराबर) के20माइक्रोल में गोली को फिर से र्ल्सल करें।)

3. डाउनस्ट्रीम विश्लेषण

  1. 50 कुर्सियां पढ़ने की लंबाई (SE50) के साथ एकल अंत अनुक्रमण के लिए इनपुट और आईपी नमूने जमा करें।
  2. कटॅ्पल41 का उपयोग करके ट्रिम 3'एंड एडाप्टर और डिस्कार्ड रीड्स जो 48 एनटी से कम हैं।
  3. मैप ट्रिम्ड बेमेल के लिए 6% की कटऑफ और 10 केबी के अधिकतम इंट्रॉन आकार के साथ स्टार42 का उपयोग करके अरबीडोप्सिस जीनोम (TAIR10 एनोटेशन) को पढ़ता है। आगे के विश्लेषण के लिए विशिष्ट मैप किए गए पढ़ता रखें।
  4. दो अलग-अलग तरीकों का उपयोग करके इनपुट की तुलना में आईपी नमूनों में समृद्ध आरएनए टुकड़ों की पहचान करें और उन लोगों पर विचार करें जो दोनों द्वारा काफी समृद्ध पाए जाते हैं।
    1. सबसे पहले, जमा आईपीएस बनाम इनपुट पर MACS2 पीक कॉलर43 का उपयोग करके MeRIP-seq चोटियों का पता लगाएं।
    2. दूसरे, MeRIP-seq पीक कॉलिंग के लिए विश्लेषण का पालन करें के रूप में मेयेर एट अल में वर्णित है22 और यांग एट अल17।
      1. कस्टम आर लिपियों का उपयोग करना, अलग 25 nt खिड़कियों में जीनोम विभाजित और पिछले मैप न्यूक्लियोटाइड की स्थिति के आधार पर प्रत्येक खिड़की के लिए विशिष्ट मैप पढ़ता है की संख्या गिनती (के बाद से पढ़ता है १०० nt आरएनए टुकड़े से उद्भव) ।
      2. फिशर सटीक परीक्षण के साथ इनपुट की तुलना में आईपी नमूनों में काफी समृद्ध खिड़कियों की गणना करें। कई परीक्षणों के लिए सही करने के लिए बेंजामिन-होचबर्ग प्रक्रिया का उपयोग करें।
      3. काफी समृद्ध चोटियों को रखें जो कम से कम दो लगातार खिड़कियों पर फैले हुए हैं और चोटियों को त्यागें जो केवल एक खिड़की को कवर करते हैं।
  5. दोनों तरीकों से पाए जाने वाले काफी समृद्ध चोटियों के साथ जीनोम (ट्रांसक्रिप्ट) के एनोटेटेड क्षेत्रों की पहचान करें।
  6. वैकल्पिक रूप से या पूरक रूप से, आईपी नमूनों में उनके संवर्धन के लिए विशिष्ट आरएनए लक्ष्यों का परीक्षण करें।
    1. रिवर्स यादृच्छिक हेक्सामर्स के साथ आरएनए (इनपुट, आईपी और मॉक नमूनों की एक ही मात्रा) को टाइप करें।
    2. चुने गए लक्ष्यों पर मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन करें, इनपुट, आईपी और मॉक की तुलना ACt विधि के माध्यम से करें।
      नोट: उत्पन्न उत्पाद 100 बीपी से अधिक नहीं होना चाहिए, क्योंकि यह औसत विखंडन आकार है।

Representative Results

चित्रा 1में विधि का एक योजनाबद्ध प्रदान किया गया है । प्रोटोकॉल के पहले महत्वपूर्ण कदम अच्छी गुणवत्ता (आरआईएन ≥ 7) के आरएनए प्राप्त करने के लिए और लगभग 100 nt टुकड़े करने के लिए इसे sonicate कर रहे हैं। दोनों चरणों की दक्षता की जांच चिप आधारित केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस मशीन द्वारा की जाती है। चित्रा 2Aमें, एक अच्छे आरएनए नमूने का एक प्रतिनिधि रन दिखाया गया है। नमूना चिप पर लोड होने से पहले 1:10 पतला है ताकि एक एकाग्रता है जो उपयोग की गई किट (5-500 एनजी/μL) का पता लगाने की सीमा में है। इसी नमूने को सोनीफिकेशन के बाद भी चलाया जाता है और चित्र 2बी में दिखाया जाता है। लगभग 100 न्यूक्लियोटाइड के आकार में आरेख के बाईं ओर स्थानांतरित एक समान चोटी की उपस्थिति पर ध्यान दें। कम एकाग्रता विखंडन के दौरान आरएनए के नुकसान के कारण होती है, लेकिन नमूनों की बढ़ी हुई मात्रा (60-100 माइक्रोन, चरण 1.7.1) के कारण भी होती है।

आईपी और मॉक नमूनों की गुणवत्ता का मूल्यांकन क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा किया जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए, नुकीला-इन IVTs सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करता है: मिथाइलेटेड आईवीटी, जहां सभी साइटोसाइन पदों में एम5सी है, आईपी नमूने में अत्यधिक समृद्ध होने की उम्मीद है; इसके विपरीत, गैर-मिथाइलेटेड आईवीटी में आईपी और मॉक के बीच अंतर नहीं होना चाहिए। दो नियंत्रण IVTs(ईजीएफपी और रेनिला लूसिफ़ेरेस) के लिए क्यूआरटी-पीसीआर परख में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर तालिका 1में सूचीबद्ध हैं। दरअसल, जैसा कि चित्रा 3में दिखाया गया है, लगभग 80% मिथाइलेटेड आईवीटी आईपी नमूने में बरामद किया गया था, और मॉक में केवल लगभग 2% था। नॉन मिथाइलेटेड कंट्रोल के लिए आईपी और मॉक दोनों सैंपल में रिकवरी 1% से नीचे थी । यह MeRIP की दक्षता की पुष्टि करता है कि मिथाइलेटेड आरएनए के टुकड़े उपजी और समृद्ध थे, और एक अच्छा संकेतक है कि नमूनों का उपयोग डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, गैर-मिथाइलेटेड आईवीटी (आईपी से मॉक रेशियो) के गुना संवर्धन को क्यूआरटी-पीसीआर परख में संवर्धन के महत्व का अनुमान लगाने के लिए एक सीमा के रूप में लागू किया जा सकता है।

जीनोम(चित्रा 4)के लिए पढ़ता है संरेखित करने के बाद, 3.4.1 और 3.4.2 चरणों में वर्णित पीक कॉलिंग एल्गोरिदम इनपुट की तुलना में आईपी नमूनों में समृद्ध सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण खिड़कियों की पहचान करने के लिए लागू किए जाते हैं। इन खिड़कियों के अनुरूप दृश्यों का उपयोग आगे किया जा सकता है, उदाहरण के लिए संरक्षित मिथाइलेशन से संबंधित रूपांकनों की खोज करने के लिए11,17।

Figure 1
चित्रा 1: MeRIP-seq प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।
आरएनए नमूनों को 5-मेथाइलेटेड साइटोसाइन के लिए एक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटेड किया जाता है और परिसरों को प्रोटीन जी चुंबकीय मोतियों के साथ नीचे खींचा जाता है जो बंधे आरएनए के साथ एंटीबॉडी को कैप्चर करते हैं। एल्यूटेड आरएनए नमूनों का विश्लेषण डीप सीक्वेंसिंग और क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आरएनए नमूनों की गुणवत्ता विश्लेषण से प्रतिनिधि परिणाम।
(एक)एक योग्य कुल आरएनए संयंत्र के नमूने का प्रतिनिधि प्रोफ़ाइल। (ख)100 एनटी टुकड़ों को सोनीसेन करने के बाद आरएनए के नमूने का प्रतिनिधि प्रोफाइल। केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस सॉफ्टवेयर से आउटपुट फाइलें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: नियंत्रण IVTs के qRT-पीसीआर विश्लेषण।
मिथाइलेटेड और नॉन-मेथिलेटेड इन विट्रो ट्रांसक्रिप्ट्स का उपयोग क्रमशः मेरिप परख के सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता था। इम्यूनोप्रिपिटेशन के बाद, मिथाइलेटेड आईवीटी आईपी नमूने (हरे) में अत्यधिक समृद्ध होता है लेकिन नकली नमूने में नहीं (एंटी-एम5सी एंटीबॉडी; बैंगनी के बिना)। गैर मिथाइलेटेड आईवीटी ने कोई संवर्धन नहीं दिखाया और आईपी और मॉक के बीच कोई अंतर नहीं दिखाया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: एक प्रतिनिधि प्रतिलिपि के आसपास MeRIP से पहले और बाद में संरेखण पढ़ें।
इनपुट नमूने (शीर्ष पंक्ति) में और दो आईपी प्रतिकृति (मध्य और नीचे पंक्ति) में एक विशिष्ट प्रतिलिपि के साथ गठबंधन पढ़ता है। ब्लैक बॉक्स MACS2४३ और MeRIP-seq 22 पीक कॉलिंग विश्लेषण के आधार पर एक पहचान समृद्ध५० nt लंबी खिड़की से पता चलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

लक्ष्य प्राइमर जोड़ी उत्पाद अनुक्रम उत्पाद की लंबाई
ईजीएफपी के लिए: 5'-GGCAACTCAAGACCCGGCC-3 ' GGCAACTACAAGACCCCGGG
जीटीगागटटीसीजीसीसीसीसीटीसीटीजी
जीटीगाकैकगेक्गाजीटीसी		 72 बीपी
रेव: 5'-GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT-3 '
रेनिला लूसिफ़ेरेस के लिए: 5'-GGAGAATAACTTCTCTCGTGGAAAC-3 ' GGAGAATAACTTCTCCGTGGAAAACC
ATGTTGCCATCAAATCATCATAGAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AGTTAGAACCAAGAAGAAGAATTTGGC		 75 बीपी
रेव: 5'-GCTGCAAATTCTTTCTAA-3 '

तालिका 1: क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण के लिए प्राइमर और उत्पन्न उत्पादों के बारे में जानकारी।

बफर व्यंजनों। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

आरएनए में एक सौ से अधिक अलग - अलग आधार संशोधन होते हैं4 जो एपिट्राएंस्क्रिप्टोम44बनाते हैं । इन संशोधनों में अनुवाद और सिग्नलिंग के नियमन की एक अतिरिक्त परत(5, 6,8,20,45, 46में समीक्षा) शामिल है। प्रारंभिक अध्ययन आरएनए28,47 पर पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों की उपस्थिति का पता लगाने में सक्षम थे लेकिन एपिट्राएंस्क्रिप्टॉमिक्स की भूमिका को समझने के लिए विशिष्ट संशोधित आरएनए की पहचान की जानी चाहिए। मेरीप को आरएनए मिथाइलेशन साइटों ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड21, 22को मैप करने के लिए एक विधिकेरूप में डिजाइन किया गया था। यदि कोई विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध है, तो इसे किसी भी संशोधन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल की मुख्य ताकत यह है कि आरएनए और उपयोगकर्ता के लिए अपेक्षाकृत सरल, सुरक्षित है (उदाहरण के लिए, 5-azaC पौधों और मनुष्यों के लिए अत्यधिक विषाक्त है) और एंजाइम जानकारी को अनुक्रम या संशोधित करने की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, आईपी द्वारा मिथाइलेटेड आरएनए के संवर्धन से कम प्रचुर मात्रा में mRNAs का पता लगाने की संभावना बढ़ जाती है, बिसुलफिट अनुक्रमण के विपरीत जिसमें संवर्धन कदम नहीं होता है। जब MeRIP के दो धारावाहिक दौर किए जाते हैं, तो मिथाइलेशन साइटों वाले आरएनए के टुकड़ों में संवर्धन और22बढ़ जाता है। MeRIP की सीमाओं में से एक, खासकर जब एमआरएनए मिथाइलेशन अध्ययन के लिए लागू किया जाता है, तो परख के लिए इनपुट के रूप में आवश्यक आरएनए की उच्च मात्रा होती है। रिबोडेप्लेशन - या पॉली (ए) संवर्धन - चरण भारी संशोधित राइबोसोमल आरएनए के कारण पृष्ठभूमि को कम करेगा लेकिन यह कुल आरएनए के 90% से अधिक को हटा देता है। डीएनए को भी पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए क्योंकि यह 5-मेथिलेटेड साइटोसाइन में समृद्ध है। एक और खामी मिथाइलेशन की सही स्थिति का निचला संकल्प है। एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन से पहले आरएनए का सोनीशन 100-200 न्यूक्लियोटाइड्स में संशोधन वाले क्षेत्र को कम करके इस दिशा की ओर मदद करता है। जब MeRIP गहरी अनुक्रमण के साथ संयुक्त है, एम5सी साइट भविष्यवाणी के संकल्प के रूप में अनुक्रमण पढ़ता है संभावित मिथाइलेशन साइट के आसपास एक गॉसियन वितरण फार्म बढ़ जाती है । इसके अतिरिक्त, एंटीबॉडी की विशिष्टता को परख से पहले पुष्टि करने की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, आरएनए डॉट दाग परख के साथ, संशोधित न्यूक्लियोटाइड के साथ संश्लेषित ओलिगोस के साथ किया जाता है), हालांकि, एक एंटीबॉडी वास्तव में बारीकी से संबंधित संशोधनों (जैसे, एम6ए और एम6एएम) के बीच अंतर कर सकता है, क्षेत्र48,49में तर्क का एक बिंदु है। इसके अलावा, अत्यधिक संरचित आरएनए एंटीबॉडी-एंटीजन इंटरैक्शन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, एक और प्रतिबंध जो ज्यादातर आईपी से पहले आरएनए के विखंडन और विकृति के साथ संबोधित किया जाता है। इसके विपरीत, बिसुलफिट अनुक्रमण जो माध्यमिक संरचनाओं से भी प्रभावित होता है, में विखंडन कदम शामिल नहीं है और यह एक कारण हो सकता है जो एम5सी साइटों और mRNAs के बीच विसंगति का कारण बनता है, जिसकी भविष्यवाणी बिसुलफिट अनुक्रमण16 और MeRIP-seq11,17द्वारा की गई है। अन्य साइटोसाइन संशोधन (उदाहरण के लिए, एचएम5सी) भी बिसुलफिट-मध्यस्थता वाले विमशन35के लिए प्रतिरोधी हैं।

MeRIP-seq के संशोधनों में एक क्रॉसलिंकिंग चरण शामिल है, या तो एक फोटोएक्टिवेट रिबोन्यूक्लियोसाइड (फोटो-क्रॉसलिंकिंग-असिस्टेड एम6ए-सेक्यू, पीए-एम6ए-एसईक्यू 50)की शुरुआत के साथ या आईपी (टीसीलिप49,परिचय30में वर्णित मिशाल से अलग विधि) के बाद एंटीबॉडी-आरएनए क्रॉसलिंक बनाने के लिए यूवी लाइट का उपयोग करना, लेकिन व्यक्तिगत-न्यूक्लियोटाइड संकल्प के साथ भी)। भविष्य में, और आरएनए मिथाइलेशन पर ज्ञान के रूप में जमते है, और अधिक लक्षित दृष्टिकोण बेहतर हो सकता है, संशोधित एंजाइमों और/ रीडर प्रोटीन की पहचान पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों के आणविक और सिग्नलिंग कार्य की समझ के लिए आवश्यक है। नैनोपोर अनुक्रमण प्रौद्योगिकी पहले से ही आरएनए17 के पूर्व उपचार के बिना संशोधित न्यूक्लियोटाइड की सीधी पहचान की अनुमति देती है लेकिन अनुक्रम गहराई और जैव सूचना विश्लेषण के बारे में इस क्षेत्र में सुधार की अभी भी गुंजाइश है। कुल मिलाकर, MeRIP-seq वर्तमान में मिथाइलेटेड आरएनए टेप की पहचान करने के लिए एक स्थापित, विश्वसनीय और निष्पक्ष दृष्टिकोण है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को ईपीएस के लिए एक IMPRS पीएचडी वजीफा, वीपी के लिए एक EMBO दीर्घकालिक फैलोशिप, और एमपीआई-एमपीपी आंतरिक धन द्वारा इस काम के F.K. भाग के लिए भी वित्त पोषित किया गया था, एक परियोजना है कि यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान समझौता नहीं ८१०११) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से धन प्राप्त किया है । लेखक पांडुलिपि पर बायोइंफॉर्मेटिक विश्लेषण और टिप्पणियों के लिए फेडरिको एपेल्ट को धन्यवाद देना चाहते हैं, और बायोइन्फॉर्मेमैटिक विश्लेषण के लिए मैथ्यु बाहिन और अमीरा क्रामडी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-m5C antibody ZymoResearch A3001 (discontinued), A3002 available Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available
Chip and reagents for capillary electrophoresis Agilent 5067-1511 RNA 6000 Nano kit
Dnase Ambion AM1907 TURBO DNA-free kit
Co-precipitant of nucleic acids Ambion AM9515 Glycoblue, 15 mg/mL
In vitro transcription kit Promega P1300 T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System
Low-binding reaction tubes Kisker Biotech G017 1.7 ml microcentrifuge tubes
Protein G magnetic beads Invitrogen 10003D Dynabeads Protein G
Proteinase K Ambion AM2546 20mg/mL stock solution, RNA grade
RNase inhibitor Promega N2615 RNasin Plus 40 U/μl
rRNA removal kit Epicentre RZPL11016 Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)
Sonication tubes Covaris 520045 microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm
RNA extraction reagent Ambion 15596018 TRIzol reagent
Equipment
Capillary electrophoresis machine Agilent G2939BA 2100 Bioanalyzer System
Magnetic rack Invitrogen 12321D DynaMag-2
Microcentrifuge Eppendorf discontinued 5417R model
Rotator Benchmark R4040 RotoBot Mini
Sonicator Covaris 500217 S220 Focused-ultrasonicator
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONEC-W NanoDrop OneC
Waterbath GFL 1012 1012 Incubation bath

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जेनेटिक्स अंक 159 आरएनए मिथाइलेशन 5-मिथाइलसाइटोसाइन (एम5सी) इम्यूनोप्रिपसिटेशन (आईपी) अरेबिडोप्सिस एपिट्राएंस्क्रिप्टोमिक्स एमआरएनए आरएनए अनुक्रमण

Erratum

Formal Correction: Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis
Posted by JoVE Editors on 05/19/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. The author list was updated.

The author list was updated from:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua

to:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

मिथाइलेटेड आरएनए इम्यूनोप्रिपिपिटेशन परख अरबीडोप्सिस में एम<sup>5</sup>सी संशोधन का अध्ययन करने के लिए
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Saplaoura, E., Perrera, V., Colot,… More

Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (159), e61231, doi:10.3791/61231 (2020).

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