Summary
يولد هذا البروتوكول أنسجة قلبية هندسية على شكل شبكة تحتوي على خلايا القلب والأوعية الدموية المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان للسماح بالتحري عن علاج زرع الخلايا لأمراض القلب.
Abstract
يصف البروتوكول الحالي طرقًا لتوليد أنسجة قلبية هندسية قابلة للتطوير على شكل شبكة (ECTs) تتكون من خلايا القلب والأوعية الدموية المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريًا (hiPSCs) ، والتي يتم تطويرها لتحقيق هدف الاستخدام السريري. يتم خلط خلايا القلب ذات المشتقات القلبية المستمدة من HiPSC وخلايا البطانية وخلايا جدارية الأوعية الدموية مع مصفوفة هلام ثم تصب في قالب أنسجة متعدد الإثيل (PDMS) مع وظائف داخلية مستطيلة متداخلة. حسب الثقافة اليوم 14 ECTs تنضج في 1.5 سم × 1.5 سم هيكل شبكة مع 0.5 ملم قطر حزم myofiber. تتوافق الخلايا القلبية القلبية مع المحور الطويل لكل حزمة وتضرب بشكل متزامن. ويمكن توسيع نطاق هذا النهج إلى أكبر (3.0 سم × 3.0 سم) شبكة ECT مع الحفاظ على بناء النضج وظيفة. وهكذا، قد تكون ECTs على شكل شبكة ولدت من خلايا القلب المشتقة من hiPSC قابلة للتطبيق لنماذج تجديد القلب.
Introduction
وقد أكدت العديد من الدراسات قبل السريرية والتجارب السريرية كفاءة العلاجات تجديد القلب القائم على الخلايا لفشل قلوب1,2,3. من بين أنواع الخلايا المختلفة ، والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) هي مصادر الخلايا الواعدة بحكم قدرتها على التكاثر ، وإمكانية توليد مختلف الأنساب القلبية الوعائية4،5،و التلوي. وبالإضافة إلى ذلك، جعلت تكنولوجيات هندسة الأنسجة من الممكن نقل الملايين من الخلايا إلى قلبالتالفة 5،6،7،8.
سابقا، أبلغنا عن توليد ثلاثي الأبعاد (3D) أنسجة القلب هندسة خطية (ECTs) من أنساب القلب والأوعية الدموية المستمدة من هيبسك باستخدام نظام الثقافة المتاحة تجاريا للأنسجة 3D الارتفتيفial5،7. وجدنا أن التعايش بين الخلايا البطانية الوعائية والخلايا الجدارية مع خلايا القلب داخل العلاج بالصدمات الكهربائية سهل نضج الأنسجة الهيكلية والكهروائية. وعلاوة على ذلك، قمنا بالتحقق من صحة الإمكانات العلاجية للهبسة-ECTs مزروعة في نموذج احتشاء فئران عضلة القلب المتسامحة من أجل تحسين وظيفة القلب، وتجديد عضلة القلب، وتعزيز تولد الأوعية5. ومع ذلك، كانت ECTs الخطية التي شيدت من خلال هذه الطريقة 1 مم من 10 ملم اسطوانات وبالتالي ليست مناسبة لزرع في الدراسات قبل السريرية مع الحيوانات الكبيرة أو الاستخدام السريري.
استنادا إلى الاستخدام الناجح لقوالب الأنسجة لتوليد تشكيل الأنسجة هندسية المسامية باستخدام الفئران الهيكل العظمي myoblasts وdyoblasttes cardiomyocytes9, الإنسان ESC المشتقة cardiomyocytes10 والفأر iPSCs11, وضعنا بروتوكول لتوليد القابلات التوسعية hiPSC المشتقة من الأنسجة الكبيرة المزروعة باستخدام قوالب polydimethylsiloxane (PDMS). قمنا بتقييم مجموعة من هندسات العفن لتحديد خصائص العفن الأكثر فعالية. أظهرت ECTs على شكل شبكة مع حزم وتقاطعات متعددة خصائص ممتازة في جدوى الخلية ، وظيفة الأنسجة وقابلية التوسع مقارنة مع الورق العادي أو الأشكال الخطية التي تفتقر إلى المسام أو الوصلات. قمنا بزرع العلاج بالصدمات الكهربائية على شكل شبكة في نموذج احتشاء عضلة القلب الفئران وأكد آثاره العلاجية مماثلة لECTs أسطواني مزروع12. هنا نحن وصف البروتوكول لتوليد ECT على شكل شبكة hiPSC المستمدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الحفاظ على الهيبات والتمايز القلب والأوعية الدموية
- توسيع والحفاظ على hiPSCs على طبقة رقيقة مصفوفة غشاء الطابق السفلي (عامل النمو خفضت، 1:60 تخفيف) في المتوسطة مكيفة المستخرجة من الليفية الجنينية الماوس (MEF-CM) مع عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية البشرية (hbFGF)4.
ملاحظة: استخدمنا خط hiPSCs (4-factor (Oct3/4 و Sox2 و Klf4 و c-Myc): 201B6). إضافة hbFGF في التركيز المناسب لكل خط الخلية. يمكن أيضا أن تستخدم لامينين-511 جزء لطلاء طبق الثقافة بدلا من مصفوفة غشاء الطابق السفلي. ويمكن استخدام المتوسطة المتاحة تجارياً والمصممة لثقافة الأعلاف الخالية من الهفوات المكلّف بـ MEF-CM. - استخدم رابطة الأمهات (0.48 mM Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) محلول) لفصل وتفكك الخلايا عندما يصل التقاء الخلايا إلى 90\u2012100%.
ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام منتجات أخرى متاحة تجارياً للتفكك الخلوي. - خلايا لوحة بكثافة 10،000 الخلايا / ملم2 على لوحات ثقافة الخلية المغلفة بالمصفوفة في MEF-CM مع hbFGF والثقافة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.
- عندما تصبح الثقافة التقاء كامل، تغطية الخلايا مع مصفوفة (1:60 تخفيف مع MEF-CM) ليوم واحد.
- استبدل المتوسط المتوسط MEF-CM مع 1640 1640 + B27 المتوسطة. إضافة 100 نانوغرام / مل من أكتيفين A و 100 نانوغرام / مل من Wnt3A إلى المتوسطة ليوم واحد.
ملاحظة: هذا هو اليوم 0 من التمايز. ل upregulate الإشارات WNT الكنسي، يمكن أيضا أن تستخدم مثبطات GSK3β بدلا من Wnt3A. - في اليوم 1 من التمايز، وتغيير متوسطة إلى جديدة 1640 + B27 مع 10 نانوغرام / مل من BMP4 و 10 نانوغرام / مل من hbFGF. خلايا الثقافة لاثنين (بروتوكول MC) أو أربعة أيام (CM + EC بروتوكول) دون تغيير متوسط5.
ملاحظة: تم تحسين CM + EC بروتوكول في وقت واحد لحث cardiomyocytes (CMs) والخلايا البطانية الوعائية (ECs). تم تحسين بروتوكول MC للحث بشكل تفضيلي على الخلايا الجدارية الوعائية (MCs). - CM + EC بروتوكول لحث CMs وECs (الشكل 1A).
- استبدال المتوسطة في اليوم 5 من التمايز مع 1640 + B27 1640 27 غم / مل من VEGF165.
- تغيير الثقافة المتوسطة كل 48 ح حتى يوم 13\u201215 من التمايز.
- بروتوكول MC لاستقرار الخلايا الجدارية الأوعية الدموية (الشكل 1B)
- استبدال المتوسطة مع RPMI1640 + 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) في اليوم 3 من التمايز.
- تغيير الثقافة المتوسطة كل 48 ح حتى يوم 13\u201215 من التمايز.
2. الخلية الحصاد وتحليل النسب في يوم التمايز 13\u201215
- اغسل الخلايا بـ Ca2+ و Mg2+ محلول ملحي خالي من الفوسفات (PBS).
- إضافة حل تفكك الخلية (التي تحتوي على البروتياز، الكولاجين وDNAses) في طبق ثقافة الخلية لتغطية لوحة. احتضان لوحة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.
- جمع وفصل الخلايا مع المتوسطة الثقافة باستخدام ماصة بعد الحضانة.
- تخصيص 1 × 106 خلايا لتحليل النسب مع عملية استئصال الخلايا التدفق. للقضاء على الخلايا الميتة، وصمة عار الخلايا مع صبغة قابلة للإصلاح قابلة للحياة.
- وصمة عار الخلايا مع علامات سطح الغشاء في برنامج تلفزيوني مع 5٪ FBS. استخدام التخفيفات التالية من الأجسام المضادة في الفلوريسنس تنشيط فرز الخلايا (FACS) تلطيخ العازلة: المضادة PDGFRβ (1:100)، المضادة لـ VE cadherin (1:100)، مكافحة TRA-1-60 (1:20).
- بالنسبة للبروتينات داخل الخلايا، قم بإعادة تثبيت الخلايا وإصلاحها بنسبة 4% شبه شكلي (PFA) في PBS.
- وصمة عار الخلايا مع isoform المضادة للقلب من تي تروبونين (cTnT) في برنامج تلفزيوني مع 5٪ FBS و 0.75٪ سابونين، ثم تسمية الأجسام المضادة cTnT مع IgG1 ماوس 488 (تخفيف 1:50).
- resuspend الخلايا الملطخة في برنامج تلفزيوني مع 5٪ FBS ووضعها في أنابيب FACS مع مصفاة الخلية.
- تحليل تكوين الخلية من الخلايا الملطخة من كل بروتوكول التمايز مع تدفق عملية استئصال الخلايا لتسهيل توليد تعليق الخلية مع توزيعات النسب المحددة.
ملاحظة: أثناء تنفيذ هذا الإجراء، يتم الاحتفاظ بتعليق الخلية المتبقية لـ ECTs في ثلاجة 4 درجة مئوية.
3. تصنيع قالب أنسجة PDMS
- يلقي 0.5 مم سميكة وأكثر من 30 مم × 30 مم طبقة من بوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) عن طريق خلط حل prepolymer وربط عبر بنسبة 10:1 ثم علاج في 80 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
- قطع ورقة PDMS والسندات مع لاصق سيليكون لتصنيع 21 مم × 20.5 مم علبة مستطيلة مع 7 مم طويلة، 0.5 مم واسعة، و 2.5 مم وظائف مستطيلة عالية في وضع متداخل. الأفقي تباعد ما بعد بين سطرين من الوظائف هو 2.5 ملم(الشكل 2B).
- اُنسج الصلب على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- معطف صينية مع 1٪ poloxamer 407 في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة. شطف poloxamer 407 وشطف القالب مع برنامج تلفزيوني بما فيه الكفاية قبل الاستخدام.
4. ECT البناء
- بعد تحليل نسب الخلية، والجمع بين الخلايا من CM + EC والبروتوكولات MC بحيث التركيز النهائي من MCs هو 10 إلى 20٪ في عدد الخلايا الإجمالية من ستة ملايين خلية لكل بناء5.
- تعليق مختلطة ستة ملايين خلية في ECT ثقافة المتوسطة (ألفا الحد الأدنى المتوسطة الأساسية تكملها 10٪ FBS، 50 μM 2-mercaptoethanol و 100 U/mL البنسلين-ستريبتوميسين).
- إعداد حل المصفوفة
- مزيج 133 ميكرولتر من حمض للذوبان في ذيل الفئران نوع الحل الأول (2 ملغ / مل، درجة الحموضة 3) مع 17 ميكرولتر من 10x الحد الأدنى المتوسطة الأساسية (MEM). ثم اخلطي الحل مع 17 ميكرولتر من العازلة القلوية (0.2 M NaHCO3و 0.2 M HEPES و 0.1 M NaOH).
ملاحظة: يجب أن يوضع الكولاجين على الجليد (4 درجات مئوية). تحقق من لون المخزن المؤقت وإذا لم تصبح الوسيطة وردية اللون عندما تكون جميع الحلول مختلطة، أضف عازلة قلوية إضافية إلى الوسط. يجب أن تكون خطوات الخلط مزيج الكولاجين أنا + 10x MEM، ثم إضافة العازلة القلوية. لا تقم بتغيير هذا الترتيب. لا تولد فقاعات في هذا المزيج. - إضافة 67 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى حل الكولاجين تحييد.
ملاحظة: يجب أن تبقى على الجليد حل مختلط (4 درجة مئوية).
- مزيج 133 ميكرولتر من حمض للذوبان في ذيل الفئران نوع الحل الأول (2 ملغ / مل، درجة الحموضة 3) مع 17 ميكرولتر من 10x الحد الأدنى المتوسطة الأساسية (MEM). ثم اخلطي الحل مع 17 ميكرولتر من العازلة القلوية (0.2 M NaHCO3و 0.2 M HEPES و 0.1 M NaOH).
- الطرد المركزي تعليق الخلية المعدة التي تحتوي على ستة ملايين خلية في 1100 دورة في الدقيقة (240 × ز)لمدة 5 دقائق و resuspend الخلايا مع 167 ميكرولتر من DMEM عالية الجلوكوز + 20٪ FBS + 1٪ بنسلين-ستريبتوميسين (100x).
- مزيج من تعليق الخلية والحل مصفوفة. الحجم الإجمالي للخلية / خليط مصفوفة لبنية واحدة هو 400 ميكرولتر.
ملاحظة: يجب أن يكون خليط الخلية/المصفوفة غير لزج ولون وردي في هذه الخطوة. يبقيه على الجليد كما هلام سوف تتوطد في درجة حرارة الغرفة. التركيز النهائي من نوع الكولاجين الأول هو 0.67 ملغ / مل. - صب الخلية / خليط مصفوفة بالتساوي على 407 poloxamer المغلفة PDMS العفن الأنسجة، والتي وضعت في ستة بئر لوحة ثقافة12.
ملاحظة: صب الخليط بعناية لتجنب توليد فقاعات من أجل منع ملء العيوب في هلام سكب. - احتضان الخلية / خليط مصفوفة في حاضنة CO2 القياسية (37C، 5 ٪ CO2) لمدة 60 دقيقة.
- بعد تشكيل الأنسجة، نقع العفن الأنسجة مع 4 مل من ECT ثقافة المتوسطة.
ملاحظة: على الرغم من أن الخلية/المصفوفة يتم crosslinked في 60 دقيقة، بناء لا يزال هشا جدا. إضافة متوسطة بلطف لتجنب إتلافه. - زراعة الأنسجة لمدة 14 يوما مع تغيير متوسطة كل يوم.
- قبل زرع العلاج بالصدمات الكهربائية، قم بإزالة العلاج بالصدمات الكهربائية من وظائف التحميل بلطف باستخدام ملقط دقيقة معقمة.
ملاحظة: أبعاد العلاج بالصدمات الكهربائية النهائية بعد الإزالة من القالب هي أقل من القالب الأصلي. يولد قالب 2.1 سم × 2.05 سم جهاز ECT صدر من حوالي 1.5 سم × 1.5 سم. أكبر 3.9 سم × 4.05 سم العفن يولد العلاج بالصدمات الكهربائية من حوالي 3 سم × 3 سم. يُظهر ECT المفرغ الضرب العفوي الجوهري في وسط الثقافة الدافئة. على الرغم من أنه يحتفظ في البداية هيكل شبكة، يتقلص العلاج بالصدمات الكهربائية التفريغ ويتكثف مع مرور الوقت. فمن الممكن لعقد الأنسجة بهدوء مع ملقط غرامة ومن ثم استخدام خياطة الحرير 7-0 لإرفاق العلاج بالصدمات الكهربائية إلى epicardium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1ألف وباء مخططات بروتوكول CM +EC وMC. بعد تحريض CMs وECs من بروتوكول CM + EC و MCs من بروتوكول MC ، يتم خلط الخلايا تعديل تركيزات MC النهائية لتمثل 10 إلى 20٪ من إجمالي الخلايا. يتم تصنيعها 2 قالب نسيج واسعة سم وفقا لرسم تصميم من 0.5 مم ورقة PDMS سميكة (الشكل 2A, B). يتم الجمع بين ستة ملايين من CM + EC + MC الخلايا مع الكولاجين الأول، ومصفوفة وسكب على قالب الأنسجة مكسوة بالبولوكسامر 407(الشكل 2C). خلال التجارب الأولية، ونحن ملفقة قوالب الأنسجة مع أنماط مختلفة تتميز بأطوال مختلفة وظيفة والتباعد وأكد هندستها النهائية من ECTs (الشكل 3). اخترنا القالب مع 7 مم وظائف طويلة مع 2.5 مم فواصل واسعة لهذه الدراسة.
Poloxamer 407 يمنع التصاق الخلية إلى القالب ومكّن تشكيل بنية شبكة مميزة بعد ضغط هلام سريع في 14 يوما (الشكل 4). يتم الحفاظ على هذا الهيكل حتى بعد تحرير العلاج بالصدمات الكهربائية من قالبه. النسيج كله هو حوالي 1.5 سم واسعة و 0.5 مم سميكة، وعرض كل حزمة في شبكة هو تقريبا 0.5 ملم في المتوسط.
فمن الممكن لتوليد 3 سم النهائي عرض شبكة ECT التي تحتوي على أربعة وعشرين مليون خلية من أربع مرات أكبر العفن مع نفس تصميم آخر متداخلة(الشكل 5A, B). هذا أكبر شبكة ECT يمكن إزالتها من القالب بسهولة ويولد قوة نشطة المحلية ما يعادل أصغر شبكة ECT(الشكل 5C).
الشكل 1: بروتوكولات للتمييز بين خلايا القلب والأوعية الدموية والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. المخططات التخطيطية للبروتوكولات المستخدمة للحث على خلايا القلب والخلايا البطانية الوعائية (A, CM + EC البروتوكول) والحث على الخلايا الجدارية الوعائية (B, بروتوكول MC). CM = عضلة القلب; EC = خلية بطانة; MC = خلية جدارية الأوعية الدموية; iPSC = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات؛ MG = مصفوفة غشاء الطابق السفلي؛ Acta = أكتيفين أ; Wnt3a, BMP4, البروتين مورفوجينيك العظام 4; bFGF = عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية؛ VEGF = عامل نمو الخلايا البطانية الوعائية; FBS = مصل الأبقار الجنينية. وهذا الرقم مقتبس من المرجع Masumoto et al.5. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصنيع قالب أنسجة PDMS وبناء ECT. (أ) صورة تمثيلية لقالب ECT ملفقة من 0.5 مم سميكة أوراق PDMS. (B) تصميم قالب أنسجة PDMS مع وظائف داخلية طويلة 7 مم مرتبة في وضع متداخل؛ عرض أمامي (اللوحة العلوية) وجانب (اللوحة السفلية). (C)البروتوكول التخطيطي للبناء ECT من خلايا القلب والأوعية الدموية المستمدة من hiPSC وجل المصفوفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تأثير تصاميم قالب الأنسجة على هندسته العلاج بالصدمات الكهربائية النهائية. (A) تعريفات طول آخر (PL) وتباعد الوظائف الأفقي (HPS). (B) قالب الأنسجة دون وظائف مستطيلة (PL0) وشكلت ورقة ECT. (C\u2012E) قوالب الأنسجة مع مختلف PL / HPS و ECTs شبكة. (F) قالب الأنسجة مع وظائف متوازية طويلة وشكلت متعددة ECT الخطية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تشكيل شبكة ECT بعد ضغط هلام. يتم عرض سلسلة تمثيلية من الصور لنضج ECT شبكة من اليوم 0 إلى 14. خلية / مصفوفة سكب في قالب أنسجة PDMS (يوم 0_0 ح)، ثم تتم إضافة متوسط الثقافة ساعة واحدة في وقت لاحق (يوم 0_1 ح). في اليوم 1 ، لوحظ المسام البيضاوي حول وظائف التحميل. وأظهر بناء ضغط هلام سريع ونضجت في نسيج شبكي بعد ذلك. في اليوم 14 ، يتم تحرير الأنسجة من القالب. يحافظ ECT الذي تم تفريغه على هندسة الشبكة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور تمثيلية لشبكة أكبر من العلاج بالصدمات الكهربائية مخصصة لتجارب الحيوانات الكبيرة قبل السريرية والتجارب السريرية. (A) تصميم 4 سم × 4 سم 4 سم قالب الأنسجة PDMS مع وظائف طويلة 7 مم و (B)صورة للقالب. (C) صورة تمثيلية 3 سم × 3 سم أكبر ECT شبكة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: التقييم المرضي والكهروفولوجي لشبكات ECTs. (أ)صورة تمثيلية لحزمة في شبكة ECT ملطخة مع Hoechst 33342 (الأزرق) للخلايا الحية و Ethidium Homodimer الثالث (الأحمر) للخلايا الميتة. شريط مقياس: 250 μm. (B) صورة تمثيلية لصورة نقوق ثلاثية الأبعاد من حزمة في شبكة ECT ملطخة القلب تروبونين تي (الأخضر). يتم تصور اتجاهات cardiomyocyte المحلية داخل الحزمة كخطوط صغيرة، حيث يشير لون الخط إلى حجم في الاتجاهات المحيطة (الخضراء) والشعاعية (الحمراء) والمحورية (الزرقاء). (C) الرسم البياني الكروي يعرض توجهات cardiomyocyte المحلية. حجم كل شعاع يمثل عدد النسبية لكل اتجاه والخط الأحمر سميكة يظهر متوسط CM الاتجاه. (ب) و (ج) تم تكييفها من المرجع13 مع التنقيح. (D) صورة تمثيلية لقياس القوة المتعاقدة. تم قطع قطعة في خط منقط الأحمر في 1.5 سم × 1.5 سم شبكة ECT وتعلق على نظام اختبار العضلات باستخدام خياطة النايلون 10-0. يشير رأس السهم الأبيض إلى محول القوة ويشير رأس السهم الأصفر إلى وحدة تحكم طول عالية السرعة. (هـ) الطول الموجي التمثيلي للإجهاد النشط في ترددات سرعة مختلفة من Please click here to download this figure. 1.5 هرتز إلى 4 هرتز.
فيديو تكميلي 1: الضرب الجوهري لمفرق في شبكة العلاج بالصدمات الكهربائية في اليوم 14. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو تكميلي 2: الضرب الجوهري لحزمة في شبكة ECT في اليوم 14. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو تكميلي 3: الضرب الجوهري للشبكة العلاج بالصدمات الكهربائية في اليوم 14 بعد إطلاقها من قالب الأنسجة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بعد الانتهاء من التحقيق لدينا من شكل خطي، hiPSC اشتق ECT5، نحن تكييف بروتوكول لخلط هيبسك المستمدة من CMs، ECs، وMCs لتسهيل التوسع في المختبر من الخلايا الوعائية داخل ECTs ولاحقا في اقتران الأوعية الدموية الحية بين ECTs وميريكارديوم المتلقي.
لتسهيل توليد أكبر، هندسة ECT شبكة قابلة للزرع استخدمنا أوراق PDMS رقيقة لتصميم قوالب 3D مع وظائف التحميل مصفوفة في مواقف متداخلة. خلال التجارب الأولية، لاحظنا أن ECTs التزمت وظائف PDMS أثناء ضغط هلام وهكذا قمنا بتعديل طريقتنا لمعطف كل قالب مع poloxamer السطحي لمنع التصاق الخلية التي هي خطوة حاسمة من البروتوكول الحالي9. تظل ECTs منفصلة عن وظائف التحميل الداخلية وأسفل العفن أثناء النضج في المختبر ، مما يسهل ضغط الجل وإزالة ECT من القالب. آخر خطوة حاسمة من البروتوكول هو صب بالتساوي خليط مصفوفة الخلية هلام في قالب PDMS قبل المصفوفة يقوي. ومن الأهمية بمكان إنجاز الإجراء في غضون فترة زمنية قصيرة. وينبغي أيضا تجنب فقاعات في خليط مصفوفة هلام الخلية لأنه قد يسبب الاضطرابات الهيكلية وتعطيل وظيفية من ECTs.
وفقا لمقارات البقاء، ما يقرب من 97٪ من الخلايا كانت على قيد الحياة في غضون اليوم 14 يبني(الشكل التكميلي 1A). الشكل التكميلي 1B يظهر صورة كاملة جبل confocal ملطخة cTnT تمثل myofiber محاذاة موازية للمحور حزمة المحلية طويلة(تكميلية الشكل 1C)13. جميع الانشاءات تبدأ في الضرب العفوي الجوهري في المختبر داخل 72 ساعة واستمر الضرب طوال مدة الثقافة (تكميلية فيديوهات 1\u20123). قمنا بتحليل خصائص الكهروميكانيكية من 1.5 سم × 1.5 سم ECTs باستخدام نظام مخصص لفحص العضلات المعزولة(الشكل التكميلي 1D). ECTs عرض أقصى سرعة سرعة التقاط معدلات 4 هرتز وتولد متوسط الضغط النشط من 0.55 mN / mm2 في 2 هرتز، 5 V سرعة بروتوكول (ن = 11، خطأ قياسي من الوسائل = 0.063؛ الشكل التكميلي 1E).
على الرغم من أننا اخترنا 7 مم طويلة وظائف التحميل الداخلية مع فواصل 5 ملم، فمن الممكن أن تختلف الهندسة ECT النهائي من خلال ترتيب طول وظائف التحميل والفاصل الزمني بين الوظائف المجاورة (الشكل 3). وعلاوة على ذلك، من الممكن توسيع نطاق 1.5 سم × 1.5 سم ECTs إلى تنسيقات أكبر مثل 3 سم × 3 سم ECT شبكة كبيرة. وفقا لقياس القوة، 3 سم × 3 سم ECTs أظهرت خصائص الكهروميكانيكية مماثلة ل1.5 سم × 1.5 سم ECTs12. مرونة أشكال الأنسجة وقابلية التوسع مع وظيفة الأنسجة المحفوظة هي أهمية البروتوكول الحالي فيما يتعلق بالطرق الموجودة بالفعل.
أحد القيود المفروضة على هذا البروتوكول هو أن قوالب PDMS يتم تجميعها يدويا من أوراق PDMS. على الرغم من أن بناء القوالب وحدة ملليمتر يكون ممكنا عن طريق تجميع اليد، قوالب من التصوير الضوئي أو الصب من قوالب رئيسية تكون أكثر ملاءمة لتوليد العلاج بالصدمات الكهربائية الموسعة ومستقرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب مالي أو علمي للكشف عنها.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل ماليا من قبل Kosair الجمعيات الخيرية برنامج أبحاث القلب للأطفال في جامعة لويزفل ومشروع Organoid في مركز ريكين لبحوث ديناميات النظم الحيوية. تم توفير مراكز البحث الهيدروفلورية المستخدمة في بروتوكولاتنا المنشورة من قبل المركز لأبحاث وتطبيق خلايا iPS ، جامعة كيوتو ، كيوتو ، اليابان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
References
- Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
- Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
- Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
- Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716 (2014).
- Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933 (2016).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
- Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
- Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
- Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
- Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963 (2013).
- Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641 (2017).
- Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).
