Summary
本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞由来の心血管細胞を含むメッシュ状の人工心臓組織を生成し、心臓病の細胞移植療法の調査を可能にする。
Abstract
現在のプロトコルは、臨床使用の目標に向けて開発されたヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)に由来する心血管細胞で構成されるスケーラブルなメッシュ状の人工心臓組織(EEC)を生成する方法を記述しています。HiPSC由来の心筋細胞、内皮細胞、および血管壁画細胞をゲルマトリックスと混合し、長方形の内部ずらしたポストを有するポリジメチルシロキサン(PDMS)組織型に注ぎ込む。培養日までに14 ETは直径0.5mmのミオファイバーバンドルを持つ1.5 cm x 1.5 cmのメッシュ構造に成熟する。心筋細胞は各バンドルの長軸に整列し、自発的に同期的に拍動する。このアプローチは、構築成熟と機能を維持しながら、より大きな(3.0 cm x 3.0 cm)メッシュECTまでスケールアップすることができます。したがって、hiPSC由来の心臓細胞から生成されるメッシュ状のETは、心臓再生パラダイムに対して実現可能であり得る。
Introduction
数多くの前臨床試験および臨床試験は、心不全の心臓11、2、32のための細胞ベースの心臓再生療法の効率を3確認した。様々な細胞タイプの中で、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)は増殖能により有望な細胞源であり、種々の心血管系統44、5、5および同種性を発生させる可能性がある。さらに、組織工学技術により、損傷を受けた心臓5、6、7、86,に何5百万もの細胞を移すことを可能に7,しました。
以前は、3D人工組織,5,7に対する市販の培養システムを用いてhiPSC由来の心血管系から3次元(3D)線形心臓組織(EEC)の生成を報告した。5この結果、血管内皮細胞と心筋細胞との共存が、構造・電気生理学的組織成熟を促進することがわかった。さらに、免疫寛容ラット心筋梗塞モデルに移植されたhiPSC-ETの治療可能性を検証し、心機能を改善し、心筋を再生し、血管新生を増強する5。しかし、この方法で構築された線形ETは1mm×10mmシリンダーであったため、より大きな動物や臨床使用の前臨床試験における移植には適していなかった。
ラット骨格筋芽細胞および心筋細胞9、ヒトESC由来心筋細胞10およびマウスiPSCs11を用いて組織鋳型を使用して多孔質組織形成を生み出すことを成功させた結果、ポリジ11メチルシロキサン(PDMS)型を用いてスケーラブルなhiPSC由来の埋め込み型組織を生成するプロトコルを開発した。金型の形状を評価し、最も有効な金型特性を決定しました。複数のバンドルと接合部を持つメッシュ状のETは、毛穴や接合部を欠いた平素シートまたは線形フォーマットと比較して、細胞の生存率、組織機能および拡張性において優れた特性を示しました。我々は、ラット心筋梗塞モデルにメッシュ状のECTを移植し、その治療効果を、移植された円筒形ECT12と同様に確認した。ここでは、hiPSC 派生メッシュ型 ECT を生成するプロトコルについて説明します。
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Protocol
1. ハイセプチの維持と心血管分化
- ヒト基礎線維芽細胞増殖因子(hbFGF)4を有するマウス胚性線維芽細胞(MEF-CM)から抽出されたコンディション培地において、薄膜基膜マトリックス(成長因子低減、1:60希釈)上のhiPSC4を拡大・維持する。
注:私たちは、HIPSC(4ファクター(Oct3/4、Sox2、Klf4およびc-Myc)ラインを使用しました:201B6。各細胞株に適当な濃度でhbFGFを加える。ラミニン-511フラグメントは、基部膜マトリックスの代わりに培養皿のコーティングに使用することもできる。ハイポスチのフィーダーフリー培養用に設計された市販の培地は、MEF-CMの代替として使用することができる。 - セル合流率が90\u2012100%に達したときにセルを剥離し、解離するには、Versene(0.48 mMエチレンジアミネトラ酢酸(EDTA)溶液を使用してください。
注:細胞解離のための他の市販品も使用できます。 - HBFGFを用いたMEF-CMのマトリックスコーティングされた細胞培養プレート上の10,000細胞/mm2 の密度でプレート細胞を2〜3日間培養した。
- 培養が完全にコンフルエントになったら、細胞をマトリックス(MEF-CMで1:60希釈)で1日覆います。
- MEF-CMをRPMI 1640 + B27培地に交換してください。1日の間、100 ng/mLのアクティビンAと100 ng/mLのWnt3Aを培地に加えます。
注: これは、差別化の 0 日目です。正規のWntシグナル伝達をアップレコンドリングするために、WNt3Aの代わりにGSK3β阻害剤を使用することもできる。 - 分化の1日目に、BMP4の10 ng /mLおよびhbFGFの10 ng /mLの新しいRPMI 1640 + B27に媒体を変更する。培地変更なしの2日間(MCプロトコル)または4日間(CM+ECプロトコル)の培養セル5.
注意:CM+ECプロトコルは、心筋細胞(CM)と血管内皮細胞(IC)を同時に誘導するように最適化されています。MCプロトコルは、血管壁細胞(MC)を優先的に誘導するように最適化されています。 - CM+EC プロトコルは、CM と IC の誘導を行います (図 1A)。
- 5日目の分化の培地を、VEGF165の50 ng /mLで補充されたRPMI 1640 + B27で交換してください。
- 分化の日13\u201215まで48時間ごとに培地を変更します。
- 血管壁細胞の誘導のためのMCプロトコル(図1B)
- 培地を3日目の分化時にRPMI1640+ 10%ウシ胎児血清(FBS)に交換してください。
- 分化の日13\u201215まで48時間ごとに培地を変更します。
2. 分化日13\u201215における細胞収穫と系統解析
- Ca2+ およびMg2+ フリーリン酸緩衝生理食塩(PBS)で細胞を洗浄します。
- 細胞培養皿に細胞解離液(プロテアーゼ、コラジェクナーゼおよびドーナーゼを含む)を添加し、プレートを覆う。プレートを37°Cで5分間インキュベートします。
- 培養後にピペットを用いて培養培地と細胞を回収し、解合する。
- フローサイトメトリーを使用した系統解析に 1 x 106 個のセルを割り当てます。死んだ細胞を排除するには、固定可能な生き生き性染料で細胞を染色する。
- 5%FBSでPBSの膜表面マーカーで細胞を染色します。蛍光活性化細胞選別(FACS)染色バッファーにおける抗体の希釈剤を使用する:抗PDGFRβ(1:100)、抗VEカドヘリン(1:100)、抗TRA-1-60(1:20)。
- 細胞内タンパク質の場合、再懸濁し、PBSで4%パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を固定します。
- 5%FBSおよび0.75%サポニンを用いたPBSのトロポニンT(cTnT)の抗心臓アイソフォームを有する細胞を染色し、その後、488マウスIgG1(希釈1:50)でcTnT抗体に標識する。
- 5%FBSでPBSの染色された細胞を再懸濁し、細胞ストレーナーとFACSチューブに入れます。
- フローサイトメトリーを用いて各分化プロトコルから染色された細胞の細胞組成を分析し、定義された系統分布を有する細胞懸濁液の生成を容易にする。
注:この手順を実行している間、ETのための残りの細胞懸濁液は4°Cの冷却装置に保存されます。
3. PDMS組織鋳型の製造
- プレポリマーと架橋溶液を10:1の割合で混合し、80°Cで3時間硬化することにより、厚さ0.5mm、ポリジメチルシロキサン(PDMS)の30mm以上の30mm層を鋳造します。
- PDMSシートを切り、シリコーン接着剤で接着し、長さ7mm、幅0.5mm、高さ2.5mmの長方形ポストをずらした位置で21mm x 20.5mmの長方形トレイを製造します。2 行のポスト間の水平方向のポスト間隔は 2.5 mm (図 2B)です。
- トレイを120°Cで20分間オートクレーブします。
- トレイに1%ポロクサマー407をPBSで1時間コーティングします。ポロクサマー407をリンスし、使用前にPBSで十分にリンスする。
4. ECT建設
- 細胞系分分析の後、CM+ECおよびMCプロトコルの細胞を組み合わせて、MCの最終的な濃度が10〜20%になるように、構築体当たり600万個の細胞数の合計で600万個の細胞を含む。
- ECT培地中の混合600万個の細胞(10%FBS、50 μM 2-メルカプトエタノール、100 U/mLペニシリンストレプトマイシンを添加したアルファ最小必須培地)を懸濁します。
- マトリックス溶液の調製
- 133 μLの酸溶性ラットテールコラーゲンタイプI溶液(2 mg/mL、pH 3)を10倍最小必須培地(MEM)の17 μLと混合します。その後、アルカリバッファー(0.2 M NaHCO 3、0.23M HEPES、および0.1 M NaOH)の17 μLと溶液を混合します。
注:コラーゲンは氷(4°C)に保つ必要があります。バッファーの色を確認し、すべての溶液が混合されているときに、メディアがピンク色にならない場合は、培地に追加のアルカリバッファーを追加します。混合工程は、コラーゲンI+10倍MEMを混合し、アルカリバッファーを加える必要があります。この順序は変更しないでください。ミックス内の泡を生成しないでください。 - 中和されたコラーゲン溶液に67μLの基質膜マトリックスを加えます。
注:混合溶液は氷(4°C)に保たなければなりません。
- 133 μLの酸溶性ラットテールコラーゲンタイプI溶液(2 mg/mL、pH 3)を10倍最小必須培地(MEM)の17 μLと混合します。その後、アルカリバッファー(0.2 M NaHCO 3、0.23M HEPES、および0.1 M NaOH)の17 μLと溶液を混合します。
- 600万個の細胞を5分間5分間に600万個の細胞を含む調製g細胞懸濁液を遠心分離し、高グルコースDMEM+ 20%FBS+ 1%ペニシリンストレプトマイシン(100x)の167 μLで細胞を再懸濁させた。
- 細胞懸濁液とマトリックス溶液を混合します。1つの構成体の細胞/マトリックス混合物の総容積は400 μLである。
注: セル/マトリックスの混合は、このステップで非粘性とピンク色にする必要があります。ゲルは室温で固化するので氷の上に保管してください。コラーゲンタイプIの最終濃度は0.67mg/mLです。 - 細胞/マトリックス混合物をポロクサマー407コーティングPDMS組織型の上に均等に注ぎ、これは6ウェル培養プレート12に入れられる。
注:注いだゲルの充填欠陥を防ぐために、気泡が発生しないように慎重に混合物を注ぎます。 - 細胞/マトリックス混合物を標準CO2インキュベーター(37C、5%CO2)で602分間インキュベートします。
- 組織が形成された後、4 mLのECT培養培地で組織型を浸す。
メモ:セル/マトリックスは60分で架橋されていますが、構造はまだ非常に壊れやすいです。ダメージを与えないように、ミディアムをやさしく加えます。 - 毎日培地変化で14日間組織を培養する。
- ECTの注入に先立って、殺菌された細い鉗子を使用して負荷のポストからECTを穏やかに取り除く。
注: 金型から取り外した後の最終的な ECT 寸法は、元の金型よりも小さくなります。2.1 cm x 2.05 cm 型は約 1.5 cm x 1.5 cm のリリースされた ECT を発生させる。より大きい3.9 cm x 4.05 cm型はおよそ3 cm x 3 cmのECTを発生させる。アンロードされたECTは、温かい培養培地における固有の自発的な殴打を示す。最初はメッシュ構造を維持しますが、アンロードされた ECT は時間の経過とともに縮小および凝縮します。微細な鉗子で組織を柔らかく保持し、7-0シルク縫合糸を使用してECTを外陰に取り付けることができます。
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Representative Results
図 1A,B は、CM+EC および MC プロトコルの概略図を示しています。MC プロトコルから CM+EC プロトコルから CM と IC を誘導し、MC から MC を誘導した後、セルは合計セルの 10 ~ 20% を表す最終的な MC 濃度を調整して混合されます。2cm幅の組織モールドは、厚さ0.5mmのPDMSシート(図2A,B)から図面に従って製造される。600万個のCM+EC+MC細胞をコラーゲンIと組み合わせ、マトリックスをポロクサマー407でコーティングした組織型に注ぎ込んだ(図2C)。予備実験の間、様々なポスト長さと間隔を特徴とする様々なパターンを持つ組織金型を作製し、ETの最終的な幾何学を確認した(図3)。本研究では、幅2.5mmの長さ7mmの長いポストで金型を選択しました。
ポロクサマー407は、金型への細胞接着を防止し、14日間での急激なゲル圧縮後の特徴的なメッシュ構造の形成を可能にする(図4)。この構造は、ECTが金型から解放された後も維持されます。組織全体の幅は約1.5cm、厚さ0.5mmで、メッシュ内の各バンドルの幅は平均で約0.5mmです。
同じずれたポストデザインを持つ4倍の大きな金型から2400万個のセルを含む3cmの最終幅メッシュECTを生成することが可能です(図5A,B)。この大きなメッシュECTは、金型から容易に除去することができ、より小さいメッシュECTと同等の局所活性力を生成する(図5C)。
図1:心血管細胞をヒト人工多能性幹細胞から分化するプロトコル。心筋細胞および血管内皮細胞(A、CM+ECプロトコル)を誘導し、血管壁細胞(B、MCプロトコル)を誘導するために使用されるプロトコルの模式図。CM = 心筋細胞;EC = 内皮細胞;MC = 血管壁細胞;iPSC = 人工多能性幹細胞;MG = 基質膜マトリックス;ActA = アクティビン A;Wnt3a, BMP4, 骨形態形成タンパク質 4;bFGF = 基本的な線維芽細胞の成長因子;VEGF = 血管内皮細胞増殖因子;FBS = 牛胎児血清.この図は、参考文献Masumotoら 5.5この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PDMS組織型およびECT構造の製造。(A)厚さ0.5mmのPDMSシートから製造されたECT金型の代表的な画像。(B)7mm長い内部ポストをずらした位置に配置されたPDMS組織型の設計。Bフロントビュー(上パネル)とサイドビュー(下パネル)を表示します。(C)hiPSC由来の心血管細胞およびマトリックスゲルからのECT構造の概略プロトコル。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 最終的な ECT ジオメトリに対する組織金型設計の影響(A) ポスト長 (PL) と水平ポスト間隔 (HPS) の定義。(B)矩形ポスト(PL0)を含まない組織金型を、シートECTを形成した。(C\u2012E)PL/HPSとメッシュETが異なる組織金型。(F)長い平行ポストを有する組織鋳型で、複数の線形ECTを形成した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ゲル圧縮後のメッシュECTの形成。0日目から14日目までのメッシュECT成熟の代表的な一連の画像が示されている。細胞/マトリックスはPDMS組織型(Day 0_0 h)に注がれ、その後培養培地が1時間後に添加される(Day 0_1 h)。1日目には、リディングポストの周りに楕円孔が観察されます。この構築物は、急速なゲル圧縮を示し、その後メッシュ組織に成熟した。14日目に、組織はカビから放出される。アンロードされた ECT はメッシュ ジオメトリを維持します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:大型動物前臨床試験および臨床試験を目的とした大型メッシュECTの代表的な画像。(A)7mm長いポストを持つ4cm x 4 cm PDMS組織型の設計と(B)金型のイメージ。(C)3 cm x 3 cm 大きいメッシュ ECT の代表的なイメージ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:メッシュETの病理学的および電気生理学的評価 (A) 生細胞のHoechst 33342(青)と死細胞のエチジウムホモジマーIII(赤)で染色されたメッシュECT中の束の代表的な画像。スケールバー:250 μm。(B)心臓トロポニンT(緑色)で染色されたメッシュECT中の束の三次元共焦点像の代表的な画像。バンドル内の局所的な心筋細胞の向きは小さな線として視覚化され、線の色は周方向(緑)、放射状(赤)、軸方向(青)の大きさを示します。(C) 球面ヒストグラムは局所心筋細胞の配向を表示する。各レイの体積は各方向の相対カウントを表し、太い赤い線は平均CM方向を示します。(B)および(C)は、改訂と共に基準13 から適合される。(D) 収縮力測定の代表的な画像。1.5 cm x 1.5 cmメッシュECTの赤い点線でセグメントを切断し、10-0ナイロン縫合糸を使用して筋肉検査システムに取り付けました。白い矢印は力のトランスデューサーを示し、黄色の矢印は高速長さのコントローラーを示す。(E)1.5 Hz~4 Hzの異なるペーシング周波数でのアクティブストレスの代表的な波形 を表示します。
補足ビデオ 1: 14日目のメッシュ ECT のジャンクションの組み込み殴打。こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
補足ビデオ 2: 14日目にメッシュ ECT でバンドルの組み込み殴打。こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
補足ビデオ3:組織型から放出された後の14日目のメッシュECTの本質的な鼓動。こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
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Discussion
線形形式の調査が完了した後、hiPSC由来のECT5は、HiPSC由来のCM、IC、およびMCを混合して、ECT内の血管細胞のインビトロ拡張とその後のECTとレシピエント心筋の間のインビボ血管結合を容易にするプロトコルを適応させた。
より大きく埋め込み型メッシュECT形状の生成を容易にするために、薄いPDMSシートを使用して、3D金型を設計し、荷重ポストをずらした位置に配列しました。予備実験の間、我々は、EECがゲル圧縮中にPDMSポストに付着したことを指摘したので、我々は、本プロトコル9の重要なステップである細胞接着を防ぐために、界面活性剤ポロクサマーで各型をコーティングする方法を変更した。ECTは、インビトロ成熟中に内部ローディングポストとモールド底部から切り離されたままで、金型からのゲル圧縮とECT除去を容易にします。プロトコルのもう一つの重要なステップは、マトリックスが固化する前に、細胞ゲルマトリックス混合物をPDMSモールドに均等に注ぐです。短時間で手順を実行することが重要です。細胞-ゲルマトリックス混合物中の気泡は、EECの構造空離および機能的破壊を引き起こす可能性があるため、避けるべきである。
生存アッセイによれば、細胞の約97%が14の構成体の中で生きていた(補足図1A)。補足図1Bは、cTnTで染色されたマウント全体の共焦点像を示し、局所束長軸に平行なミオファイバーアライメントを表す(補足図1C)13。13すべての構造は、72時間以内にインビトロで固有の自発的な殴打を開始し、培養の期間を通じて打ち続けた(補足ビデオ1\u20123)。我々は、カスタムの単離された筋肉試験システムを用いて1.5cm x 1.5cmのETの電気機械特性を分析した(補足図1D)。EECは4 Hzの最大ペーシングキャプチャレートを表示し、2 Hzで0.55 mN /mm2の平均アクティブストレスを生成し、5 Vペーシングプロトコル(n = 11、平均= 0.063の標準誤差;補足図 1E)。
5 mm 間隔で 7 mm の長い内部荷重ポストを選択しましたが、荷重ポストの長さと隣接するポスト間の間隔を配置することで、最終的な ECT ジオメトリを変更することができます (図 3)。さらに、1.5cm x 1.5 cmのECTのスケールを3cm x 3 cmの大メッシュECTのようなより大きいフォーマットに拡大することができる。力の測定によれば、3 cm x 3 cm ETsは1.5 cm x 1.5 cmのETs12に類似した電気機械特性を示した。組織形状の柔軟性および保存された組織機能を伴うスケーラビリティは、既存の方法に関して本プロトコルの重要性である。
本プロトコルの1つの制限は、PDMS金型がPDMSシートから手で組み立てられることである。ミリ単位金型の構築は手組みによって実現可能ですが、フォトリソグラフィやマスター金型からの鋳造は、拡張され安定したECT生成に適しています。
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Disclosures
著者らは、開示する財政的または科学的な対立を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、ルイビル大学のコセア・チャリティー小児心臓研究プログラムと理化学研究所生物系ダイナミクス研究センターのオルガノイドプロジェクトによって財政的に支援されました。公開されたプロトコルで使用されているHiPSCは、京都大学iPS細胞研究応用センターが提供しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
References
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