Summary
El presente protocolo genera tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla que contienen células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para permitir la investigación de la terapia de implantación celular para enfermedades del corazón.
Abstract
El protocolo actual describe métodos para generar tejidos cardíacos (ECT) de ingeniería en forma de malla escalables compuestos por células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), que se desarrollan hacia el objetivo del uso clínico. Los cardiomiocitos derivados de HiPSC, las células endoteliales y las células murales vasculares se mezclan con matriz de gel y luego se vierten en un molde de tejido de polidimetilsiloxano (PDMS) con postes escalonados internos rectangulares. Por día de cultivo 14 ECT maduran en una estructura de malla de 1,5 cm x 1,5 cm con paquetes de miofibra de 0,5 mm de diámetro. Los cardiomiocitos se alinean con el eje largo de cada haz y golpean espontáneamente sincrónicamente. Este enfoque se puede escalar hasta un ECT de malla más grande (3,0 cm x 3,0 cm) conservando la maduración y función de construcción. Por lo tanto, los ECT en forma de malla generados a partir de células cardíacas derivadas de hiPSC pueden ser factibles para los paradigmas de regeneración cardíaca.
Introduction
Numerosos estudios preclínicos y ensayos clínicos han confirmado la eficiencia de las terapias regenerativas cardíacas basadas en células para corazones en quiebra1,2,3. Entre varios tipos de células, las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) son fuentes celulares prometedoras en virtud de su capacidad proliferativa, potencial para generar varios linajes cardiovasculares4,,5,y alogenicidad. Además, las tecnologías de ingeniería de tejidos han hecho posible transferir millones de células a un corazón dañado5,,6,7,8.
Anteriormente, informamos de la generación de tejidos cardíacos de ingeniería lineal tridimensional (3D) (ECT) a partir de linajes cardiovasculares derivados de hiPSC utilizando un sistema de cultivo disponible comercialmente para tejidos bioartificiales 3D5,,7. Encontramos que la coexistencia de células endoteliales vasculares y células murales con cardiomiocitos dentro de la ECT facilitaba la maduración del tejido estructural y electrofisiológico. Además, validamos el potencial terapéutico de los hiPSC-ECT implantados en un modelo de infarto de miocardio de rata tolerante al inmunelí para mejorar la función cardíaca, regenerar el miocardio y mejorar la angiogénesis5. Sin embargo, los ECT lineales construidos por este método eran cilindros de 1 mm por 10 mm y, por lo tanto, no eran adecuados para la implantación en estudios preclínicos con animales más grandes o uso clínico.
Basándonos en el uso exitoso de moldes tisulares para generar la formación de tejidos de ingeniería porosa utilizando mioblastos esqueléticos de rata y cardiomiocitos9,cardiomiocitos humanos derivados de ESC10 y iPSCsde ratón 11,desarrollamos un protocolo para generar tejido implantable más grande derivado de hiPSC escalable utilizando moldes de polidimemetilsiloxano (PDMS). Evaluamos una gama de geometrías de moldes para determinar las características más efectivas del molde. Los ECT en forma de malla con múltiples haces y uniones presentaban excelentes características en viabilidad celular, función de tejido y escalabilidad en comparación con formatos lineales o de hojas lisas que carecía de poros o uniones. Implantamos el ECT en forma de malla en un modelo de infarto de miocardio de rata y confirmamos sus efectos terapéuticos similares a los ECT cilíndricos implantados12. Aquí describimos el protocolo para generar un ECT en forma de malla derivado de hiPSC.
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Protocol
1. Mantenimiento de hiPSC y diferenciación cardiovascular
- Ampliar y mantener hiPSCs en la matriz de membrana del sótano de capa delgada (factor de crecimiento reducido, 1:60 dilución) en medio condicionado extraído de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF-CM) con factor de crecimiento de fibroblastos básico humano (hbFGF)4.
NOTA: Utilizamos una línea hiPSCs (4 factores (Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc): 201B6). Agregue hbFGF a la concentración adecuada para cada línea celular. El fragmento de Laminin-511 también se puede utilizar para el recubrimiento de la placa de cultivo en lugar de la matriz de membrana del sótano. El medio disponible comercialmente diseñado para la cultura libre de alimentadores de hiPSC se puede utilizar como sustituto de MEF-CM. - Utilice Versene (0,48 mM de solución de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA)) para separar y disociar las células cuando la confluencia celular alcanza los 90o U2012100%.
NOTA: También se pueden utilizar otros productos disponibles comercialmente para la disociación celular. - Células de placa a una densidad de 10.000 células/mm2 en placas de cultivo celular recubiertas de matriz en MEF-CM con hbFGF y cultivo durante dos o tres días.
- Cuando el cultivo se vuelva completamente confluente, cubra las células con matriz (1:60 dilución con MEF-CM) durante un día.
- Sustituya el MEF-CM por el medio RPMI 1640 + B27. Añadir 100 ng/mL de Activin A y 100 ng/mL de Wnt3A al medio durante un día.
NOTA: Este es el día 0 de diferenciación. Para regular la señalización canónica de Wnt, también se pueden utilizar inhibidores GSK3 en lugar de Wnt3A. - En el día 1 de diferenciación, cambie el medio a la nueva RPMI 1640 + B27 con 10 ng/mL de BMP4 y 10 ng/mL de hbFGF. Células de cultivo para dos (protocolo MC) o cuatro (protocolo CM+EC) días sin cambio medio5.
NOTA: El protocolo CM+EC está optimizado para inducir simultáneamente cardiomiocitos (CM) y células endoteliales vasculares (CE). El protocolo MC está optimizado para inducir preferentemente células murales vasculares (MC). - Protocolo CM+EC para la inducción de CM y ECs(Figura 1A).
- Sustituya el medio en el día 5 de diferenciación por RPMI 1640 + B27 complementado con 50 ng/ml de VEGF165.
- Cambiar el medio de cultivo cada 48 h hasta el día 13-u201215 de diferenciación.
- Protocolo MC para la inducción de células murales vasculares(Figura 1B)
- Sustituya el medio por el suero bovino fetal RPMI1640 + 10% (FBS) en el día 3 de diferenciación.
- Cambiar el medio de cultivo cada 48 h hasta el día 13-u201215 de diferenciación.
2. Cosecha celular y análisis de linaje en el día de diferenciación 13-u201215
- Lavar las células con Ca2+ y Mg2+ solución salina libre de fosfato amortiguado (PBS).
- Añadir solución de disociación celular (que contiene proteasas, colagenasas y DNAses) en el plato de cultivo celular para cubrir la placa. Incubar la placa durante 5 min a 37oC.
- Recoger y disociar las células con medio de cultivo utilizando una pipeta después de la incubación.
- Asigne 1 x 106 celdas para el análisis de linaje con citometría de flujo. Para eliminar las células muertas, manche las células con un tinte de viabilidad fijable.
- Manche las células con marcadores de superficie de membrana en PBS con 5% FBS. Utilice las siguientes diluciones de anticuerpos en la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) tampón de tinción: anti-PDGFR (1:100), anti-VE cadherina (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
- Para proteínas intracelulares, resuspender y fijar las células con 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS.
- Manchar las células con isoforma anti-cardiaca de Troponina T (cTnT) en PBS con 5% FBS y 0.75% Saponina, luego etiquetar el anticuerpo cTnT con 488 ratón IgG1 (dilución 1:50).
- Resuspender las células manchadas en PBS con 5% FBS y ponerlas en tubos FACS con colador celular.
- Analizar la composición celular de las células manchadas de cada protocolo de diferenciación con citometría de flujo para facilitar la generación de suspensiones celulares con distribuciones de linaje definidas.
NOTA: Durante la realización de este procedimiento, la suspensión celular restante para las ECT se conserva en un refrigerador de 4 oC.
3. Fabricación de moho tisular PDMS
- Funde una capa de 0,5 mm de espesor y más de 30 mm x 30 mm de polidimetilsiloxano (PDMS) mezclando el prepolímero y la solución de reticulación a una relación de 10:1 y luego cura a 80 oC durante 3 h.
- Corte la hoja PDMS y adhiera con adhesivo de silicona para fabricar una bandeja rectangular de 21 mm x 20,5 mm con 7 mm de largo, 0,5 mm de ancho y postes rectangulares de 2,5 mm de alto en una posición escalonada. El espaciado horizontal de los postes entre dos líneas de los postes es de 2,5 mm(Figura 2B).
- Autoclave la bandeja a 120oC durante 20 min.
- Cubrir la bandeja con 1% de poloxámero 407 en PBS durante 1 h. Enjuague el poloxámero 407 y enjuague el molde con PBS lo suficiente antes de usarlo.
4. Construcción de TEC
- Después del análisis del linaje celular, combine las células de los protocolos CM+EC y MC para que la concentración final de MCs sea de 10 a 20% en un número de células total de seis millones de células por construcción5.
- Suspenda seis millones de células mixtas en el medio de cultivo de ECT (medio esencial mínimo alfa complementado con 10% FBS, 50 m 2-mercaptoetanol y 100 U/mL Penicilina-Estreptomicina).
- Preparación de la solución de matriz
- Mezclar 133 l de solución de colágeno de cola de rata soluble en ácido tipo I (2 mg/ml, pH 3) con 17 l de 10x medio esencial mínimo (MEM). A continuación, mezcle la solución con 17 l de tampón alcaldiano (0,2 M NaHCO3, 0,2 M HEPES y 0,1 M NaOH).
NOTA: El colágeno debe mantenerse sobre hielo (4 oC). Compruebe el color del búfer y si el medio no se vuelve rosado cuando todas las soluciones se mezclan, agregue búfer alcaldizo adicional al medio. Los pasos de mezcla deben ser mezclar colágeno I + 10x MEM, y luego añadir buffer alcalico. NO cambie este orden. NO genere burbujas en la mezcla. - Añadir 67 l de matriz de membrana del sótano a la solución de colágeno neutralizado.
NOTA: La solución mixta debe mantenerse sobre hielo (4 oC).
- Mezclar 133 l de solución de colágeno de cola de rata soluble en ácido tipo I (2 mg/ml, pH 3) con 17 l de 10x medio esencial mínimo (MEM). A continuación, mezcle la solución con 17 l de tampón alcaldiano (0,2 M NaHCO3, 0,2 M HEPES y 0,1 M NaOH).
- Centrifugar la suspensión celular preparada que contiene seis millones de células a 1.100 rpm (240 x g)durante 5 min y resuspenda las células con 167 l de DMEM de alta glucosa + 20% FBS + 1% penicilina-estreptomicina (100x).
- Mezclar la suspensión celular y la solución de matriz. El volumen total de la mezcla de células/matrices para una construcción es de 400 l.
NOTA: La mezcla de celda/matriz debe ser no viscosa y de color rosado en este paso. Manténgalo sobre hielo, ya que el gel se solidificará a temperatura ambiente. La concentración final de colágeno tipo I es de 0,67 mg/ml. - Vierta la mezcla celular/matriz uniformemente sobre el molde de tejido PDMS recubierto de poloxámero 407, que se coloca en una placa de cultivo de seis pozos12.
NOTA: Vierta la mezcla cuidadosamente para evitar la generación de burbujas con el fin de evitar defectos de llenado en el gel vertido. - Incubar la mezcla celular/matriz en una incubadora estándar deCO2 (37C, 5 % CO2) durante 60 min.
- Después de que se forme el tejido, remoje el molde tisular con 4 ml de medio de cultivo de TEC.
NOTA: Aunque la celda/matriz está reticulada en 60 min, la construcción sigue siendo muy frágil. Agregue suavemente el medio para evitar dañarlo. - Cultivo del tejido durante 14 días con cambio medio todos los días.
- Antes de la implantación de la TEC, retire la TEC de los postes de carga con fórceps finos esterilizados.
NOTA: Las dimensiones finales de ECT después de la eliminación del molde son menores que el molde original. Un molde de 2,1 cm x 2,05 cm genera un ECT liberado de aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm. Un molde más grande de 3,9 cm x 4,05 cm genera un ECT de aproximadamente 3 cm x 3 cm. La TEC descargada muestra golpes espontáneos intrínsecos en un medio de cultivo cálido. Aunque inicialmente mantiene una estructura de malla, un ECT descargado se encoge y se condensa con el tiempo. Es posible sostener el tejido suavemente con fórceps finos y luego usar sutura de seda 7-0 para unir el ECT al epicardio.
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Representative Results
El cuadro 1A, B muestra los esquemas del protocolo CM+EC y MC. Después de inducir los CM y los FC del protocolo CM+EC y los MC del protocolo MC, las células se mezclan ajustando las concentraciones finales de MC para representar entre el 10 y el 20% del total de células. El molde de tejido de 2 cm de ancho se fabrica de acuerdo con el dibujo de diseño de una hoja PDMS de 0,5 mm de espesor(Figura 2A,B). Seis millones de células CM+EC+MC se combinan con colágeno I, y la matriz y se vierten en el molde de tejido recubierto con poloxámero 407 (Figura 2C). Durante los experimentos preliminares, fabricamos moldes de tejidos con varios patrones caracterizados por varias longitudes de poste y espaciado y geometrías finales confirmadas de ECTs (Figura 3). Seleccionamos el molde con postes de 7 mm de largo con intervalos de 2,5 mm de ancho para este estudio.
Poloxamer 407 evita la adhesión celular al molde y permitió la formación de estructura de malla característica después de la compactación rápida del gel en 14 días(Figura 4). Esta estructura se mantiene incluso después de que el ECT se libera de su molde. Todo el tejido tiene aproximadamente 1,5 cm de ancho y 0,5 mm de espesor, y el ancho de cada haz en la malla es de aproximadamente 0,5 mm de media.
Es posible generar una malla de 3 cm de ancho final ECT que contiene veinticuatro millones de celdas de un molde cuatro veces más grande con el mismo diseño de poste escalonado (Figura 5A, B). Esta malla más grande ECT se puede quitar del molde fácilmente y genera fuerza activa local equivalente a la malla más pequeña ECT (Figura 5C).
Figura 1: Protocolos para diferenciar las células cardiovasculares de las células madre pluripotentes inducidas por el ser humano. Diagramas esquemáticos de protocolos utilizados para inducir cardiomiocitos y células endoteliales vasculares (protocolo A, CM+EC) e inducir células murales vasculares (protocolo B, MC). CM - cardiomiocitos; EC - célula endotelial; MC - célula mural vascular; iPSC - célula madre pluripotente inducida; MG - matriz de membrana del sótano; ActA - Activin A; Wnt3a, BMP4, Proteína morfogenética ósea 4; bFGF - factor básico de crecimiento del fibroblasto; VEGF - factor de crecimiento de células endoteliales vasculares; FBS - suero bovino fetal. Esta cifra se adapta de referencia Masumoto et al.5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fabricación de molde de tejido PDMS y construcción DE ECT. (A) Imagen representativa de un molde ECT fabricado a partir de hojas PDMS de 0,5 mm de espesor. (B) Diseño del molde de tejido PDMS con postes internos de 7 mm de largo dispuestos en posición escalonada; vista frontal (panel superior) y vista lateral (panel inferior). (C) El protocolo esquemático de construcción de ECT a partir de células cardiovasculares derivadas de hiPSC y gel de matriz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Impacto de los diseños de moldes de tejido en geometrías de ECT finales. (A) Definiciones de longitud de poste (PL) y espaciado horizontal de postes (HPS). (B) Un molde de tejido sin postes rectangulares (PL0) y formado una hoja ECT. (Cá2012E) Moldes de tejido con diferentes ECT PL/HPS y malla. (F) Un molde de tejido con postes paralelos largos y formó una ECT lineal múltiple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Formación de malla ECT después de la compactación de gel. Se muestran series representativas de imágenes de una maduración ECT de malla del día 0 a 14. La celda/matriz se vierte en el molde de tejido PDMS (Día 0_0 h), luego el medio de cultivo se agrega una hora más tarde (Día 0_1 h). El día 1, se observan poros elípticos alrededor de los postes de carga. La construcción mostró una rápida compactación del gel y maduró en un tejido de malla a partir de entonces. El día 14, el tejido se libera del moho. El ECT descargado mantiene la geometría de malla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes representativas de un ECT de malla más grande destinado a ensayos preclínicos de animales grandes y ensayos clínicos. (A) Diseño del molde de tejido PDMS de 4 cm x 4 cm con postes de 7 mm de largo y (B) una imagen del molde. (C) Imagen representativa de una malla ECT de malla de 3 cm x 3 cm más grande. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Evaluación patológica y electrofisiológica de las ECT de malla. (A) Imagen representativa de un haz en una malla ECT teñida con Hoechst 33342 (azul) para células vivas y Ethidium Homodimer III (rojo) para células muertas. Barra de escala: 250 m. (B) Imagen representativa de una imagen confocal tridimensional de un haz en una malla ECT manchada con troponina cardiaca T (verde). Las orientaciones locales de cardiomiocitos dentro del haz se visualizan como líneas pequeñas, donde el color de la línea indica la magnitud en las direcciones circunferencial (verde), radial (rojo) y axial (azul). (C) El histograma esférico muestra las orientaciones locales de los cardiomiocitos. El volumen de cada rayo representa el recuento relativo para cada dirección y la línea roja gruesa muestra la orientación CM media. (B) y (C) se adaptan a partir de la referencia13 con revisión. (D) Imagen representativa de la medición de la fuerza contráctil. Un segmento fue cortado en la línea de puntos rojos en una ECT de malla de 1,5 cm x 1,5 cm y unido al sistema de pruebas musculares utilizando sutura de nylon 10-0. La punta de flecha blanca indica el transductor de fuerza y la punta de flecha amarilla indica el controlador de longitud de alta velocidad. (E) Formas de onda representativas de tensión activa en diferentes frecuencias de ritmo de 1,5 Hz a 4 Hz. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Video Suplementario 1: Latido intrínseco de un cruce en una malla ECT el día 14. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.
Video Suplementario 2: Latido intrínseco de un haz en una malla ECT el día 14. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.
Video Suplementario 3: Golpe intrínseco de una malla ECT el día 14 después de liberarse del molde de tejido. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Tras la finalización de nuestra investigación de un formato lineal, derivado de hiPSC ECT5,adaptamos el protocolo para mezclar CM, EC y MC derivados de hiPSC para facilitar la expansión in vitro de las células vasculares dentro de las ECT y el posterior acoplamiento vascular in vivo entre las ECT y el miocardio receptor.
Para facilitar la generación de geometrías ECT de malla más grandes e implantables, utilizamos láminas delgadas de PDMS para diseñar los moldes 3D con postes de carga dispuestos en posiciones escalonadas. Durante los experimentos preliminares, observamos que los ECT se adhirieron a los postes PDMS durante la compactación del gel y por lo tanto modificamos nuestro método para recubrir cada molde con el poloxámero tensioactivo para evitar la adhesión celular que es un paso crítico del presente protocolo9. Los ECT permanecen separados de los postes de carga internos y de la parte inferior del molde durante la maduración in vitro, lo que facilita la compactación del gel y la eliminación de ECT del molde. Otro paso crítico del protocolo es verter uniformemente la mezcla de matriz de células y gel en el molde PDMS antes de que la matriz se solidifique. Es fundamental llevar a cabo el procedimiento en poco tiempo. También se deben evitar las burbujas en la mezcla de matriz de células-gel porque puede causar vacuolación estructural y alteración funcional de las ECT.
Según los ensayos de viabilidad, aproximadamente el 97% de las células estaban vivas en el día 14 construcciones(Figura Suplementaria 1A). La Figura Suplementaria 1B muestra toda la imagen confocal de montaje manchada con cTnT que representa la alineación de miofiber paralela al eje largo del haz local (Figura suplementaria 1C)13. Todas las construcciones comienzan la paliza espontánea intrínseca in vitro dentro de 72 h y continuaron latiendo durante toda la duración del cultivo(Videos Suplementarios 1-u20123). Analizamos propiedades electromecánicas de ECT de 1,5 cm x 1,5 cm utilizando un sistema de pruebas musculares aislados personalizado(Figura suplementaria 1D). Los ECT mostraron velocidades máximas de captura de ritmo de 4 Hz y generaron una tensión activa media de 0,55 mN/mm2 a 2 Hz, protocolo de ritmo de 5 V (n a 11, error estándar de medias a 0,063; Figura complementaria 1E).
Aunque seleccionamos postes de carga internos de 7 mm de largo con intervalos de 5 mm, es posible variar la geometría final del ECT organizando la longitud de los postes de carga y el intervalo entre los postes adyacentes (Figura 3). Además, es posible ampliar la escala de 1,5 cm x 1,5 cm DE TCE a formatos más grandes como 3 cm x 3 cm de malla grande ECT. Según la medición de la fuerza, los TCE de 3 cm x 3 cm mostraron propiedades electromecánicas similares a 1,5 cm x 1,5 cm DE TCE12. La flexibilidad de las formas de tejido y la escalabilidad con la función de tejido preservada es una importancia del protocolo actual con respecto a los métodos ya existentes.
Una limitación del protocolo actual es que los moldes PDMS se ensamblan a mano desde hojas PDMS. Aunque la construcción de moldes de milímetros sería factible mediante el montaje a mano, los moldes de fotolitografía o fundición de moldes maestros serían más adecuados para la generación de ECT expandida y estable.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos financieros o científicos que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado financieramente por el Programa de Investigación pediátrica del corazón de Kosair Charities en la Universidad de Louisville y el Proyecto Organoid en el CENTRO RIKEN para la Investigación de Dinámica de Biosistemas. HiPSCs utilizados en nuestros protocolos publicados fueron proporcionados por el Centro de Investigación y Aplicación de Células iPS, Universidad de Kioto, Kioto, Japón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
References
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