Summary
O presente protocolo gera tecidos cardíacos projetados em forma de malha contendo células cardiovasculares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para permitir a investigação da terapia de implantação celular para doenças cardíacas.
Abstract
O protocolo atual descreve métodos para gerar tecidos cardíacos escaláveis em forma de malha (ECTs) compostos por células cardiovasculares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs), que são desenvolvidas para o objetivo do uso clínico. Cardiomiócitos derivados do HiPSC, células endoteliais e células mural vasculares são misturados com matriz de gel e, em seguida, despejados em um molde de tecido polidimetilsiloxano (PDMS) com postes retangulares e escalonados internos. No dia da cultura, 14 ECTs amadurecem em uma estrutura de malha de 1,5 cm x 1,5 cm com feixes de miofibra de 0,5 mm de diâmetro. Os cardiomiócitos alinham-se ao eixo longo de cada feixe e batem espontaneamente sincronizadamente. Essa abordagem pode ser dimensionada até uma malha ECT de malha maior (3,0 cm x 3,0 cm), preservando a maturação e a função do construto. Assim, os ECTs em forma de malha gerados a partir de células cardíacas derivadas do hiPSC podem ser viáveis para paradigmas de regeneração cardíaca.
Introduction
Inúmeros estudos pré-clínicos e ensaios clínicos confirmaram a eficiência das terapias regenerativas cardíacas baseadas em células para corações falhando1,,2,3. Entre vários tipos de células, as células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs) são fontes celulares promissoras em virtude de sua capacidade proliferativa, potencial para gerar várias linhagens cardiovasculares4,,5e alergenicidade. Além disso, as tecnologias de engenharia de tecidos permitiram transferir milhões de células para um coração danificado5,,6,,7,8.
Anteriormente, relatamos a geração de tecidos cardíacos tridimensionais (3D) de engenharia linear (ECTs) a partir de linhagens cardiovasculares derivadas do hiPSC usando um sistema de cultura comercialmente disponível para tecidos bioartíficos 3D5,,7. Verificou-se que a coexistência de células endoteliais vasculares e células mural com cardiomiócitos dentro da ECT facilitou a maturação estrutural e eletrofisiológica do tecido. Além disso, validamos o potencial terapêutico de hiPSC-ECTs implantados em um modelo de infarto do miocárdio de rato tolerante imunológico para melhorar a função cardíaca, regenerar o miocárdio e melhorar a angiogênese5. No entanto, os ECTs lineares construídos por este método foram cilindros de 1 mm por 10 mm e, portanto, não são adequados para a implantação em estudos pré-clínicos com animais maiores ou uso clínico.
Com base no uso bem sucedido de moldes de tecido para gerar formação de tecido poroso projetado usando míbios esqueléticos de rato e cardiomiócitos9,cardiomiócitos derivados do ESC humano10 e iPSCs11,desenvolvemos um protocolo para gerar moldes implantáveis derivados de hiPSC escaláveis usando moldes polidimetiloxano (PDMS). Avaliamos uma série de geometrias de moldes para determinar as características mais eficazes do molde. Os ECTs em forma de malha com múltiplos feixes e junções apresentaram excelentes características na viabilidade celular, função tecidual e escalabilidade em comparação com formatos de folha simples ou lineares que não tinham poros ou junções. Implantamos o ECT em forma de malha em um modelo de infarto do miocárdio de rato e confirmamos seus efeitos terapêuticos semelhantes aos ECTs cilíndricos implantados12. Aqui descrevemos o protocolo para gerar um ECT em forma de malha derivado do hiPSC.
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Protocol
1. Manutenção de hiPSCs e diferenciação cardiovascular
- Expandir e manter hiPSCs na matriz de membrana de porão de camada fina (fator de crescimento reduzido, diluição de 1:60) em meio condicionado extraído de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF-CM) com fator de crescimento do fibroblasto básico humano (hbFGF)4.
NOTA: Usamos uma linha hiPSCs (4 fatores (Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc): 201B6). Adicione hbFGF na concentração apropriada para cada linha celular. Fragmento laminin-511 também pode ser usado para o revestimento do prato de cultura em vez de matriz de membrana porão. O meio comercialmente disponível projetado para a cultura livre de alimentador de hiPSCs pode ser usado como um substituto para o MEF-CM. - Use versene (0,48 mM de ácido cinacético (EDTA) para desprender e dissociar células quando a confluência celular atingir 90\u2012100%.
NOTA: Outros produtos disponíveis comercialmente para dissociação celular também podem ser usados. - Células de placa a uma densidade de 10.000 células/mm2 em placas de cultura de células revestidas de matriz em MEF-CM com hbFGF e cultura por dois a três dias.
- Quando a cultura se tornar totalmente confluente, cubra as células com matriz (diluição de 1:60 com MEF-CM) por um dia.
- Substitua o MEF-CM pelo meio RPMI 1640 + B27. Adicione 100 ng/mL de Activin A e 100 ng/mL de Wnt3A ao meio por um dia.
NOTA: Este é o dia 0 de diferenciação. Para aumentar a sinalização canônica Wnt, os inibidores GSK3β também podem ser usados em vez de Wnt3A. - No primeiro dia de diferenciação, mude o médio para o novo RPMI 1640 + B27 com 10 ng/mL de BMP4 e 10 ng/mL de hbFGF. Células de cultura para dois (protocolo MC) ou quatro (protocolo CM+CE) dias sem alteração média5.
NOTA: O protocolo CM+CE é otimizado para induzir simultaneamente cardiomiócitos (CMs) e células endoteliais vasculares (CES). O protocolo MC é otimizado para induzir preferencialmente células mural vascular (MCs). - Protocolo CM+CE para indução de CMs e CEs (Figura 1A).
- Substitua o meio no dia 5 de diferenciação com RPMI 1640 + B27 complementado por 50 ng/mL de VEGF165.
- Mude o meio de cultura a cada 48 h até o dia 13\u201215 de diferenciação.
- Protocolo MC para a indução de células mural vascular (Figura 1B)
- Substitua o meio por RPMI1640 + 10% de soro bovino fetal (FBS) no dia 3 de diferenciação.
- Mude o meio de cultura a cada 48 h até o dia 13\u201215 de diferenciação.
2. Análise de colheita celular e linhagem no dia da diferenciação 13\u201215
- Lave as células com salina tamponada de fosfato livre Ca2+ e Mg2+ (PBS).
- Adicione a solução de dissociação celular (contendo proteases, colagens e DNAses) no prato de cultura celular para cobrir a placa. Incubar a placa por 5 min a 37 °C.
- Coletar e dissociar as células com meio de cultura usando uma pipeta após a incubação.
- Aloque 1 x 106 células para análise de linhagem com citometria de fluxo. Para eliminar células mortas, colorir as células com corante de viabilidade fixável.
- Manche as células com marcadores de superfície de membrana em PBS com 5% de FBS. Use as seguintes diluições de anticorpos na fluorescência ativado tampão de coloração celular (FACS): anti-PDGFRβ (1:100), cadherina anti-VE (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
- Para proteínas intracelulares, resuspenque e fixe as células com 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS.
- Colorir as células com isoforme anti-cardíaca de Troponina T (cTnT) em PBS com 5% de FBS e 0,75% saponina, em seguida, rotular o anticorpo cTnT com 488 mouse IgG1 (diluição 1:50).
- Resuspend as células manchadas em PBS com 5% de FBS e coloque-as em tubos FACS com coador celular.
- Analise a composição celular das células manchadas de cada protocolo de diferenciação com citometria de fluxo para facilitar a geração de suspensões celulares com distribuições de linhagem definidas.
NOTA: Durante a realização deste procedimento, a suspensão restante da célula para ECTs é preservada em um refrigerador de 4 °C.
3. Fabricação de molde de tecido PDMS
- Lance uma camada de 0,5 mm de espessura e mais de 30 mm x 30 mm de polidimtilsiloxano (PDMS) misturando a solução prepolímero e transfronteiriça a uma proporção de 10:1 e depois curar a 80 °C por 3 h.
- Corte a folha PDMS e uni-la com adesivo de silicone para fabricar uma bandeja retangular de 21 mm x 20,5 mm com 7 mm de comprimento, 0,5 mm de largura e 2,5 mm de altura em uma posição retangular escalonada. O espaçamento horizontal do poste entre duas linhas de postes é de 2,5 mm (Figura 2B).
- Autoclave a bandeja a 120 °C por 20 min.
- Cubra a bandeja com 1% de poloxamer 407 na PBS por 1h. Enxágüe o poloxamer 407 e enxágue o molde com PBS suficientemente antes de usar.
4. Construção da ECT
- Após a análise da linhagem celular, combine as células dos protocolos CM+CE e MC para que a concentração final de MCs seja de 10 a 20% em um número celular total de seis milhões de células por construção5.
- Suspender seis milhões de células em meio de cultura ECT (meio essencial mínimo alfa suplementado com 10% FBS, 50 μM 2-mercaptoetanol e 100 U/mL Penicilina-Streptomycina).
- Preparação da solução matricial
- Misture 133 μL de solução de colágeno de cauda de rato solúvel ácido (2 mg/mL, pH 3) com 17 μL de 10x mínimo essencial médio (MEM). Em seguida, misture a solução com 17 μL de tampão alcalino (0,2 M NaHCO3, 0,2 M HEPES e 0,1 M NaOH).
NOTA: O colágeno deve ser mantido no gelo (4 °C). Verifique a cor do tampão e se o meio não ficar rosado quando todas as soluções estiverem misturadas, adicione tampão de álcali adicional ao meio. Os passos de mistura devem ser misturar colágeno I + 10x MEM e, em seguida, adicionar tampão alcalino. NÃO mude esta ordem. NÃO gere bolhas na mistura. - Adicione 67 μL de matriz de membrana de porão à solução neutralizada de colágeno.
NOTA: A solução mista deve ser mantida no gelo (4 °C).
- Misture 133 μL de solução de colágeno de cauda de rato solúvel ácido (2 mg/mL, pH 3) com 17 μL de 10x mínimo essencial médio (MEM). Em seguida, misture a solução com 17 μL de tampão alcalino (0,2 M NaHCO3, 0,2 M HEPES e 0,1 M NaOH).
- Centrifugar a suspensão celular preparada contendo seis milhões de células a 1.100 rpm (240 x g) por 5 min e resuspengar as células com 167 μL de DMEM de alta glicose + 20% FBS + 1% penicilina-estreptomicina (100x).
- Misture a suspensão celular e a solução matricial. O volume total da mistura celular/matriz para uma construção é de 400 μL.
NOTA: A mistura celular/matriz deve ser não viscosa e uma cor rosada nesta etapa. Mantenha-o no gelo, pois o gel se solidificará à temperatura ambiente. A concentração final do colágeno tipo I é de 0,67 mg/mL. - Despeje a mistura celular/matriz uniformemente sobre o poloxamer 407 revestido molde de tecido PDMS, que é colocado em uma placa de cultura de seis poços12.
NOTA: Despeje a mistura cuidadosamente para evitar a geração de bolhas, a fim de evitar defeitos de enchimento no gel derramado. - Incubar a mistura célula/matriz em uma incubadora padrão de CO2 (37C, 5 % DE CO2) por 60 min.
- Depois que o tecido for formado, mergulhe o molde de tecido com 4 mL de meio de cultura ECT.
NOTA: Embora a célula/matriz esteja interligada em 60 minutos, a construção ainda é muito frágil. Adicione o meio suavemente para evitar danificá-lo. - Cultura do tecido por 14 dias com mudança média todos os dias.
- Antes da implantação da ECT, remova o ECT dos postes de carregamento suavemente usando fórceps finos esterilizados.
NOTA: As dimensões finais da ECT após a remoção do molde são inferiores ao molde original. Um molde de 2,1 cm x 2,05 cm gera um ECT liberado de aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm. Um molde maior de 3,9 cm x 4,05 cm gera um ECT de aproximadamente 3 cm x 3 cm. ECT descarregado mostra espancamento espontâneo intrínseco em meio de cultura quente. Embora inicialmente mantenha uma estrutura de malha, uma ECT descarregada encolhe e condensa ao longo do tempo. É possível segurar o tecido suavemente com fórceps finos e, em seguida, usar sutura de seda 7-0 para anexar o ECT ao epicárdio.
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Representative Results
A Figura 1A,B mostra os esquemas do protocolo CM+CE e MC. Depois de induzir CMs e ECs do protocolo CM+EC e MCs do protocolo MC, as células são misturadas ajustando as concentrações finais de MC para representar de 10 a 20% do total de células. O molde de tecido de 2 cm de largura é fabricado de acordo com o desenho de 0,5 mm de espessura da folha PDMS de espessura(Figura 2A,B). Seis milhões de células CM+EC+MC são combinadas com colágeno I, matriz e derramadas no molde de tecido pré-revestido com poloxamer 407(Figura 2C). Durante experimentos preliminares, fabricamos moldes de tecido com vários padrões caracterizados por vários comprimentos postais e espaçamento e confirmamos geometrias finais dos ECTs(Figura 3). Selecionamos o molde com postes de 7 mm de comprimento com intervalos de 2,5 mm de largura para este estudo.
Poloxamer 407 previne a adesão celular ao molde e possibilitou a formação de estrutura de malha característica após compactação rápida de gel em 14 dias(Figura 4). Esta estrutura é mantida mesmo após a liberação da ECT do seu molde. Todo o tecido tem aproximadamente 1,5 cm de largura e 0,5 mm de espessura, e a largura de cada feixe na malha é de aproximadamente 0,5 mm em média.
É possível gerar um ECT de malha de largura final de 3 cm contendo vinte e quatro milhões de células a partir de um molde quatro vezes maior com o mesmo design de post escalonado(Figura 5A,B). Esta malha maior ECT pode ser removida do molde facilmente e gera força ativa local equivalente à malha menor ECT (Figura 5C).
Figura 1: Protocolos para diferenciar células cardiovasculares das células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem. Diagramas esquemáticos de protocolos utilizados para induzir cardiomiócitos e células endoteliais vasculares (protocolo A, CM+CE) e induzir células mural vascular (protocolo B, MC). CM = cardiomiócito; CE = célula endotelial; MC = célula mural vascular; iPSC = célula-tronco pluripotente induzida; MG = matriz de membrana do porão; ActA = Activin A; Wnt3a, BMP4, Proteína morfogenética óssea 4; bFGF = fator de crescimento do fibroblasto básico; VEGF = fator de crescimento celular endotelial vascular; FBS = soro bovino fetal. Esta figura é adaptada da referência Masumoto et al.5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fabricação de molde de tecido PDMS e construção de ECT. (A) Imagem representativa de um molde ECT fabricado a partir de folhas PDMS de 0,5 mm de espessura. (B) Projeto do molde de tecido PDMS com postagens internas de 7 mm de comprimento dispostas em posição escalonada; vista frontal (painel superior) e visão lateral (painel inferior). (C) O protocolo esquemático da construção da ECT a partir de células cardiovasculares derivadas do hiPSC e gel de matriz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Impacto dos desenhos de moldes de tecido nas geometrias finais da ECT. (A) Definições de comprimento pós-tempo (PL) e espaçamento horizontal do poste (HPS). (B) Um molde de tecido sem postes retangulares (PL0) e formou uma folha ECT. (C\u2012E) Moldes teciduais com diferentes ECTs PL/HPS e malha. (F) Um molde de tecido com longas postagens paralelas e formou um ECT linear múltiplo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Formação de ECT de malha após compactação de gel. Série representativa de imagens de uma malha de maturação ect do dia 0 ao 14 são mostradas. Célula/matriz é derramado no molde de tecido PDMS (Dia 0_0 h), em seguida, o meio de cultura é adicionado uma hora depois (Dia 0_1 h). No primeiro dia, os poros elípticos são observados em torno de postes de carregamento. A construção mostrou compactação rápida de gel e amadureceu em um tecido de malha depois disso. No dia 14, o tecido é liberado do molde. A ECT descarregada mantém a geometria da malha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagens representativas de uma ECT de malha maior destinada a grandes ensaios pré-clínicos e ensaios clínicos em animais. (A) Design do molde de tecido PDMS de 4 cm x 4 cm com postes de 7 mm de comprimento e (B) uma imagem do molde. (C) Imagem representativa de uma malha ect de 3 cm x 3 cm maior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Avaliação patológica e eletrofisiológica dos ECTs de malha. (A) Imagem representativa de um feixe em uma malha ECT manchada com Hoechst 33342 (azul) para células vivas e Ethidium Homodimer III (vermelho) para células mortas. Barra de escala: 250 μm. (B) Imagem representativa de uma imagem confocal tridimensional de um feixe em uma malha ECT manchada com troponina cardíaca T (verde). As orientações locais de cardiomiócito dentro do feixe são visualizadas como linhas pequenas, onde a cor da linha indica magnitude nas direções circunferenciais (verdes), radiais (vermelhas) e axial (azul). (C) O histograma esférico apresenta orientações locais de cardiomiócito. O volume de cada raio representa a contagem relativa para cada direção e a linha vermelha grossa mostra a orientação média do CM. (B) e (C) são adaptados da referência13 com revisão. (D) Imagem representativa da medição da força contratil. Um segmento foi cortado na linha pontilhada vermelha em um ECT de malha de 1,5 cm x 1,5 cm e anexado ao sistema de testes musculares usando sutura de nylon 10-0. A ponta da seta branca indica transdutor de força e a ponta da seta amarela indica controlador de comprimento de alta velocidade. (E) Formas de onda representativas de estresse ativo em diferentes frequências de ritmo de 1,5 Hz a 4 Hz. Clique aqui para baixar este número.
Vídeo suplementar 1: Espancamento intrínseco de uma junção em uma malha ECT no dia 14. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo suplementar 2: Espancamento intrínseco de um pacote em uma malha ECT no dia 14. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo suplementar 3: Batida intrínseca de uma ECT de malha no dia 14 após liberação do molde de tecido. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Após a conclusão de nossa investigação de um formato linear, o ECT5derivado do hiPSC, adaptamos o protocolo para misturar CMs, CEs e MCs derivados de hiPSC para facilitar a expansão in vitro de células vasculares dentro dos ECTs e posterior acoplamento vascular in vivo entre ECTs e miocárdio receptor.
Para facilitar a geração de geometrias ECT de malha maiores e implantáveis, utilizamos folhas PDMS finas para projetar os moldes 3D com postes de carregamento dispostos em posições escalonadas. Durante experimentos preliminares, notamos que os ECTs aderiram aos posts do PDMS durante a compactação do gel e, por isso, modificamos nosso método para revestir cada molde com o poloxamer surfactante para evitar a adesão celular que é um passo crítico do presente protocolo9. Os ECTs permanecem separados dos postes internos de carregamento e do fundo do molde durante a maturação in vitro, o que facilita a compactação do gel e a remoção de ECT do molde. Outro passo crítico do protocolo é despejar uniformemente a mistura de matriz de gel celular no molde PDMS antes que a matriz se solidifique. É fundamental realizar o procedimento em pouco tempo. Bolhas na mistura matriz de gel celular também devem ser evitadas porque podem causar vacuolação estrutural e interrupção funcional dos ECTs.
De acordo com os ensaios de viabilidade, aproximadamente 97% das células estavam vivas no dia 14(Figura Suplementar 1A). Figura Suplementar 1B mostra toda a imagem confocal de montagem manchada com cTnT representando o alinhamento miofibra paralelo ao eixo longo do feixe local(Figura Suplementar 1C)13. Todas as construções começam a bater intrínsecamente espontâneos in vitro dentro de 72h e continuaram batendo durante toda a duração da cultura (Vídeos Suplementares 1\u20123). Foram analisadas propriedades eletromecânicas de 1,5 cm x 1,5 cm ECTs utilizando um sistema de teste muscular isolado personalizado(Figura Suplementar 1D). Os ECTs apresentaram taxas máximas de captura de ritmo de 4 Hz e geraram um estresse ativo médio de 0,55 mN/mm2 a 2 Hz, protocolo de ritmo de 5 V (n = 11, erro padrão de média = 0,063; Figura Suplementar 1E).
Embora tenhamos selecionado postes de carregamento interno de 7 mm com intervalos de 5 mm, é possível variar a geometria final da ECT organizando o comprimento dos postes de carregamento e o intervalo entre os postes adjacentes(Figura 3). Além disso, é possível expandir a escala de ECTs de 1,5 cm x 1,5 cm para formatos maiores, como ect de malha grande de 3 cm x 3 cm. De acordo com a medição da força, os ECTs de 3 cm x 3 cm apresentaram propriedades eletromecânicas semelhantes a 1,5 cm x 1,5 cm ECTs12. A flexibilidade das formas teciduais e a escalabilidade com função tecidual preservada são as significâncias do protocolo atual em relação aos métodos já existentes.
Uma limitação do presente protocolo é que os moldes PDMS são montados à mão a partir de folhas PDMS. Embora a construção de moldes de unidades milimétricas seja viável por montagem manual, moldes da fotolitografia ou fundição de moldes mestres seriam mais adequados para a expansão e a geração estável de ECT.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos financeiros ou científicos para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Programa de Pesquisa Cardíaca Pediátrica de Instituições de Caridade Kosair da Universidade de Louisville e pelo Projeto Organoide no RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. Os HiPSCs usados em nossos protocolos publicados foram fornecidos pelo Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
References
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