Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

החלת גירוי מכני תלת מימדי ביוריאקטור מערכת לגרום לבידול Tenogenic של תאי גזע הנגזר גיד

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61278
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia
* These authors contributed equally

Summary

תלת-מימדי גירוי מכני מכאני מערכת ביוריאקטור הוא ביווריקטור אידיאלי עבור הבחנה מסוימת של הבידול בתאי גזע הנגזר גיד והיווצרות גיד ניאו.

Abstract

טדינופתיה היא מחלת גיד כרונית נפוצה הנוגעת לדלקת וניוון באזור אורתופדיות. עם תחלואה גבוהה, יכולת לתיקון עצמי מוגבל, והכי חשוב, אין טיפולים מוחלט, הטדינפתיה עדיין משפיע על איכות החיים של המטופלים שלילית. גיד-בתאי גזע נגזר (TDSCs), כמו התאים הראשוניים העיקרי של תאים גיד, לשחק תפקיד חיוני הן בפיתוח של הטדינפתיה, ושחזור פונקציונלי ומבניים לאחר הטנופתיה. כך, שיטה שיכולה בתוך מבחנה לחקות את הבידול vivo של TDSCs לתוך תאים גיד יהיה שימושי. כאן, הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה המבוססת על תלת מימדי (3D) מערכת מתיחה uniaxial כדי לעורר את TDSCs להבדיל לרקמות כמו גיד. ישנם שבעה שלבים של הפרוטוקול הנוכחי: בידוד של עכברים TDSCs, תרבות והתרחבות של עכברים TDSCs, הכנת התרבות גירוי בינונית עבור היווצרות הגיליון התא, גיליון התא היווצרות על-ידי culturing במדיום גירוי, הכנת תא גזע 3D בניית תאים, הרכבה של מתיחה uniaxial מותח מורכב גירוי מכני, הערכה של האפקטיביות הוכח על ידי היסטולוגיה. ההליך כולו לוקח פחות מ 3 שבועות. כדי לקדם את התצהיר של מטריקס מטריתאי, 4.4 mg/mL חומצה אסקורבית שימש במדיום תרבות גירוי. חדר מופרד עם מנוע לינארי מספק טעינה מכנית מדויקת והוא נייד ומותאם בקלות, אשר מוחל על הביוריאקטור. משטר ההעמסה בפרוטוקול הנוכחי היה 6% זן, 0.25 Hz, 8 h, ואחריו 16 h מנוחה עבור 6 ימים. פרוטוקול זה יכול לחקות בידול התא בגיד, אשר מועיל לחקירה של התהליך הפתולוגי של הטדינופתיה. יתר על כן, הרקמה כמו גיד משמש פוטנציאל לקדם ריפוי גיד בפגיעת גיד כשתל אוטוולוגי הנדסה. כדי לסכם, הפרוטוקול הנוכחי הוא פשוט, כלכלי, מתוכולל ותקף.

Introduction

טדינפתיה היא אחת מפציעות הספורט השכיחות. הוא מתבטא בעיקר על ידי כאב, נפיחות מקומית, הופחת מתח שרירים באזור המושפע, ותפקוד לקוי. השכיחות של הטדינופתיה הוא גבוה. הנוכחות של אכילס טאננופתיה היא הנפוצה ביותר עבור רצים באמצע ובמרחק ארוך (עד 29%), בעוד הנוכחות של הפצ'יני טאננופתיה הוא גם גבוה בספורטאים של כדורעף (45%), כדורסל (32%), מסלול ושדה4,5(23%), כדוריד(15%),וכדורגל(13%),2,,3, עם זאת, בשל יכולת הריפוי העצמי המוגבלת של הגיד, והיעדר טיפולים יעילים, הטדינפתיה עדיין משפיע על החיים של המטופלים באופן שלילי6,7. יתר על כן, הפתוגנזה של טדינופתיה נשאר ברור. היו חקירות רבות על הפתוגנזה שלה, בעיקר כולל "תורת הדלקות", "תורת הניוון", "תאוריית שימוש יתר", וכן הלאה8. כיום, חוקרים רבים האמינו כי tendinopathy היתה בשל התיקון העצמי כישלון לפציעות מיקרו מוגברת שנגרמו על ידי מכני מוגזם טוען את חווה9,10.

בתאי גזע נגזר של גיד (TDSCs), כמו התאים הראשוניים העיקרי של תאים גיד, לשחק תפקיד חיוני הן בפיתוח של tendinopathy ושחזור פונקציונלי ומבניים לאחר הטאננופתיה11,12,13. זה דווח כי גירוי מכני הלחץ יכול לגרום התפשטות והבידול של אוסטאופציטים, אוסטאופתית, תאי שריר החלקה, השרירים, בתאי גזע mesenchymal ותאים אחרים רגישים כוח14,15,16,17,18. לפיכך, TDSCs, כאחד התאים המכניים והחזקים ביותר, ניתן בדומה לגירוי להבדיל19באמצעות טעינהמכנית 19,20.

עם זאת, פרמטרים שונים של טעינה מכנית (כוח טעינת, תדירות טעינת, סוג טעינה ותקופת טעינה) יכול לגרום TDSCs להבדיל לתאים שונים21. לכן, משטר העמסה אפקטיבי ותקף מכני הוא משמעותי מאוד עבור tenogenesis. יתר על כן, ישנם סוגים שונים של ריאקטורים כמו מערכות גירוי המשמשים כיום לאספקת העמסה מכני TDSCs. העקרונות של כל סוג של ביוריאקטור חקן הם שונים, כך הפרמטרים ההעמסה מכני המתאימים ביוריאקטורים שונים הם גם שונים. לכן, פרוטוקול גירוי פשוט, כלכלי ומתכלה הוא ביקוש, כולל סוג הביוריאקטור, מדיום הגירוי המקביל ומשטר ההעמסה המכני.

המאמר הנוכחי מתאר שיטה המבוססת על תלת מימדי (3D) מערכת מתיחה uniaxial כדי לעורר את TDSCs להבדיל רקמות כמו גיד. ישנם שבעה שלבים של הפרוטוקול: בידוד של עכברים TDSCs, תרבות והתרחבות של עכברים TDSCs, הכנת התרבות גירוי בינונית עבור היווצרות הגיליון התא, גיליון התא היווצרות על-ידי culturing במדיום גירוי, הכנת תא גזע 3D בניית התא, הרכבה של מתיחה מכני מערכת גירוי מכאני, והערכה של גירוי מכני ההליך כולו לוקח פחות מ 3 שבועות כדי להשיג את המבנה תא תלת-ממד, אשר הרבה פחות מאשר כמה שיטות קיימות22,23. הפרוטוקול הנוכחי הוכח להיות מסוגל לגרום TDSCs להבדיל רקמת גיד, וזה יותר אמין מאשר דו מימדי הנוכחי בשימוש דו-ממדי (2D) מערכת מתיחה21. האפקטיביות הוכח על ידי היסטולוגיה. בקיצור, הפרוטוקול הנוכחי הוא פשוט, כלכלי, מתוכולל ותקף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השיטות שתוארו אושרו והוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות של ועדת האתיקה לבעלי חיים באוניברסיטת מערב אוסטרליה.

1. בידוד של עכברים TDSCs

  1. המתת חסד 6-8 בן שבוע-C57BL/6 עכברים על ידי פריקה צוואר הרחם.
  2. .וגידים של אכילס25
  3. לעכל את הגידים מאחד עם 6 מ ל מסוג אני הקולגנאז (3 מ"ג/mL) עבור 3 h.
    הערה: כמו בגודל של גיד בעכבר קטן, כל הגידים שנקטפו מעכבר אחד יש להשתמש בשלב זה.
  4. לאסוף את התאים והתרבות בינונית מינימלית Essential מינימלי (Alpha-מזכור) המכיל 10% סרום העוברי (FBS) ו 1% של תערובת סטרפטומיצין ו פניצילין עבור 7 ימים.
  5. זיהוי TDSCs באמצעות מיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית על-ידי cy, CD90 ו-סקה -1; חוסר הביטוי של CD34 וCD45).
  6. מעבר והקפאת תאים (מעבר 4 תאים ישמשו לשלבים נוספים).

2. תרבות והתרחבות של עכברים TDSCs

הערה: בצע את כל השלבים במכסה הביובטיחות סטרילי.

  1. קח את התאים התחממו (עכברים TDSCs, 1,000,000 תאים, מעבר 4, עד 37 ° c).
  2. הוסף באיטיות 4-5 מ ל של מדיום מינימלי חיוני לחלוטין (Alpha-זיכרון).
  3. העבירו את התערובת לצינור. צנטריפוגה של 15 מ ל עם פיפטה
  4. למעלה עם בינוני עד 8 מ"ל סה כ עם פיפטה.
    1. מדיום לחימום בחממה 37 ° c.
  5. הציבו את הצינור בצנטריפוגה ובאיזון.
  6. צנטריפוגה ותאים גלולה ב 347 x g עבור 5 דקות.
  7. צאו אחרי הצנטריפוגה. ובידקו את הגלולה בתחתית
  8. Decant בינונית הקפאה, ולהשעות מחדש את התאים בעדינות ב 1-2 mL של בינוני מוחלט (להימנע מלעשות בועות רבות מדי).
  9. העבר תאים שהושעו מחדש לבקבוקון T-75 באמצעות פיפטה.
  10. השתמש בפיפטה כדי להוסיף לבקבוק אלפא-מדיום מלא לבקבוקון כדי להגיע לנפח כולל של 10 מ ל עם ריכוז סופי של 13,000 תאים/cm2.
  11. מניחים את הבקבוקון לתוך החממה והתרבות ב 37 ° c עם 5% CO2.
  12. . להחליף את המדיום כל 3 ימים
  13. להתבונן ולנטר את התאים תחת מיקרוסקופ בעת שינוי המדיום עד התאים הם מתורבתים כדי 100% המפגש (כ 40,000 תאים/cm2).

3. הכנת מדיום לעיבוד תאים

הערה: בצע את כל השלבים במכסה הביובטיחות סטרילי.

  1. שופכים 15 מ ל של בינונית אלפא-מלאה להשלים לתוך צינור סטרילי 15 מ"ל.
  2. הוסף 6 μL של חומצה אסקורבית (11 מ"ג/mL) לתוך 15 mL של בינונית עבור ריכוז סופי של 4.4 μg/mL.
    הערה: בנוסף, הוספת 25 ng/mL מקדם גידול רקמת חיבור במדיום תרבות גירוי יכול להאיץ את כל תהליך הצמיחה והבידול.
  3. מערבבים בעדינות על ידי היפוך למעלה ולמטה.

4. היווצרות יריעות תאים על ידי מעגלי גירוי במדיום

הערה: בצע את כל השלבים במכסה הביובטיחות סטרילי.

  1. למחוק את המדיום המלא הרגיל אלפא-זיכרון בזהירות, ולהימנע מלגעת התאים המחוברים לתחתית הבקבוקון.
  2. הוסף 10 מ ל של גירוי בינוני לאט להימנע גורם כל הפרעה לתאים באופן מלא.
  3. תרבות התאים במדיום גירוי 9 ימים (לשנות את המדיום כל 3 ימים) כדי ליצור מספיק את הגיליון התא ב 37 ° c עם 5% CO2.
    הערה: מטריצת מערות יהיה עבה והווה להיות מעונן כאשר הוא נצפה מהחלק התחתון של הבקבוקון לאחר גירוי על ידי חומצה אסקורבית, כלומר גיליון התא הוא נוצר מספיק.

5. הכנת מבנה תא גזע של גיד 3D

הערה: בצע את כל השלבים במכסה הביובטיחות סטרילי.

  1. . תוציא את הבקבוקון מאינקובטור
  2. התעלם מאמצעי הגירוי לחלוטין.
  3. שטוף את גיליון התאים המונאולייר עם תמיסת מלח (PBS) על ידי התערבל הבקבוקון.
  4. . השמט את הערוץ לגמרי
  5. השתמש בפיפטה כדי להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין לפינה של הבקבוקון.
  6. הקש על פינת הבקבוקון כדי לבטל את החיבור של גיליון התא המונאולייר עד שהפינה של גיליון התא תרד מהחלק התחתון של הבקבוקון.
  7. הוסף מיד 9 מ"ל של מדיום אלפא-מלאה להשלים כדי להפסיק את הטריסינזציה.
  8. המשך לסדר את הבקבוקון כדי לקלף את הסדין התאי המונאולייר לחלוטין.
  9. יוצקים את הגיליון הכולל של התא המצורף לצלחת פטרי עם בינוני.
  10. השתמש פינצטה סטרילי להרים פינה אחת של גיליון התא ולסובב בכיוון השעון עבור 15 פעמים.
  11. תרימי קצה אחר של גיליון התא ולסובב בכיוון נגד כיוון השעון עבור 10 פעמים כדי ליצור בחוזקה גיד-כמו בניית מבחנה (איור 1A).

6. הרכבת היחידה-מתיחה מורכבת גירוי מכני ביוריאקטור ייחודי מעוצב

הערה: בצע את כל השלבים במכסה הביובטיחות סטרילי.

  1. לחבר את ווים על ידי החיבור ולהתאים את המרחק הרצוי (2 ס מ) בין שני קרסים.
  2. בעדינות רוח 3D TDSCs לבנות על קרס מורכב 3 פעמים על כל וו (איור 1B).
  3. אבטח את הקרסים עם התא לבנות על החדר של ביוריאקטור חקן על ידי הידוק הברגים על שני הקצוות.
    הערה: החדר כולו, כולל ברגים וקרסים, הוא סטרילי (החיטוי עבור 1.5 h ב 134 ° צ' וקרני אולטרה סגול (UV) לחשוף 24 שעות לפני השימוש). עבור מחזיק המתכת של התאים, אור UV לחשוף עבור 48 שעות לפני השימוש.
  4. תמלא את החדר עם. מדיום אלפא-מושלם
  5. חבר את המפעיל לחדר התרבות באמצעות כבל.
  6. חותכים את הקרסים מחובר על ידי מספריים סטרילי.
  7. הפעל את העוצמה ואת בקר הערוץ המקביל להתחיל גירוי מכני.
  8. . שים את המכסה על החדר
  9. בדוק את נוריות החיווי וודא שהbioreשחקן יכול לתפקד כראוי.
  10. לשים את ביוריאקטור חקן בחממה ואת נושא תא תלת-ממד מתיחה מכני עבור 6 ימים (6% מתיחה, 0.25 Hz, 8 h, ואחריו 16 h מנוחה).

7. הערכת גירוי מכני ברקמות כמו גיד מבחנה

  1. שחרר את הברגים על-ידי מברג והכנס את ההרכבה בזהירות.
  2. שים את הרקמה כמו גיד לתוך 4% פאראפורמלדהיד עבור קיבוע עבור 15 דקות.
  3. מניחים את הרקמה כמו גיד קבוע לתוך קלטת ביופסיה עם מגיני קצף ביופסיה.
  4. תהליך כדי להסודה את המדגם ולבסוף להעריך על ידי כתמים היסטולוגית H & E.
  5. חזור על הפרוטוקול כולו ולחלץ RNA מן הרקמה כמו גיד להערכת הביטוי של סמנים tenogenic על ידי ה-PCR כמותי (qPCR). התחל עבור הגנים שנבחרו מפורטים בטבלה 1.
    הערה: פרוטוקול היסטולוגיה ופרוטוקול qPCR הם סטנדרטיים ובעקבות מחקר קודם21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לפני גירוי מכני, TDSCs גדלו ל-100% המפגש במדיום המלא והציג מורפולוגיה בעלת מבנה לא מאורגנת (איור 2A). לאחר 6 ימים של מתיחה uniaxial העמסה טעינה מכנית, מטריצה החילוץ (ECM) ו התאים להתאים היו היטב (איור 2B). תאים היו מאוכלסים היטב העטוף ECM לאחר טעינת מכני. מורפולוגיה התא הוצגה להיות מוארך היה דומה יותר לתא גיד נורמלי לעומת אחד ללא מתיחה (איור 2C). צפיפות התא בבניית תאים עם טעינה היתה גבוהה יותר מאשר באחד ללא טעינה. תוצאות ה-QPCR הראו כי השיטה הנוכחית הגבירה את ביטוי הסמנים הטגנטיים, כולל ציר לובן, מוהוק, טאואוקלין, ו COL1A1 (איור 3) בהשוואה לאלה שטופלו בתרבות סטטית.

Figure 1
איור 1: הרכבה של תא תלת מימדי (3D) מבנה מעל ווים של הביוריאקטור. (א) השקפה כללית של התא 3d לבנות על הקרסים. (ב) הדיאגרמה להרכיב את המבנה התא 3d על הקרסים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מורפולוגיה של התא לפני ואחרי גירוי מכני. (א) גיד-תאי גזע נגזר גדלו ל 100% המפגש בינוני מלא והציג מורפולוגיה בדיקת אולטרה מאורגנת לפני גירוי מכני. (ב) תמונות היסטולוגית הראו H כתמים & E של בניית התא לאחר גירוי מכני. (ג) תמונות היסטולוגית הראו H כתמים & E של תא בקרה לבנות מתורבת בביוריאקטור עבור 6 ימים ללא גירוי מכני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: רמת הביטוי של סמנים tenogenesis. רמות ביטוי הגן הבודדות מנורמלות תחילה כנגד הפקד הפנימי, 36B4 ולאחר מכן מנורמלות כנגד רמות ביטוי גן מתרבויות סטטיות. תוצאות מתוך 3 ניסויים מוצגים. הרצפים הפריימר המשמשים ניתוח qPCR מסופקים בטבלה 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מערכת הגירוי המכני התלת-ממדית בשיטת ביוריאקטור חקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ג'ין תחל
קדימה 5 '-> 3 ' הפוך 5 '-> 3 '
COL1A1 מוטי שגיא מוטי ברקת
ציר לובן-לובן מיכל הכהן מוזיאון האחים ברונטה
מוהוק מוזיאון הג TCGCTGAGCTTTCCCCTTTA
טאואודולין CCGCAGAAAAGCCTATTGAA בדיקת מלאי
מיכל שלמה מיכאל שלמה מיכאל שלמה

שולחן 1: רצף פריימר המשמש ניתוח qPCR

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

. הגיד הוא רקמת חיבור סיבי מכונאי על פי המחקר הקודם, הטעינה מכני עודף עלול להוביל הבידול אוסטגניים של תאי גזע גיד, בעוד טעינה מספקת יוביל מבנה סיבים מחוסר סדר קולגן במהלך בידול הגיד21.

השקפה משותפת היא כי המפתח ביוריאקטור אידיאלי הוא היכולת לדמות את הסביבה מיקרו מבחנה תאית תאים בvivo עוברים. לכן, לחקות את הסביבה vivo הלחץ הרגיל בתוך מבחנה הוא המפתח של עירור הבדל יחיד השושלת של TDSCs לתוך תאים גיד. בפרוטוקול הנוכחי, רוחב המבנה TDSC היה 2 ס"מ, ואת טווח התנועה של וו היה 0.12 ס"מ, כלומר המתח היה 0.12/2 (%). לסיכום, TDSCs היו מגורה מכנית במשך 6 ימים (6%, 0.25 Hz, 8 h, ואחריו 16 h מנוחה) בפרוטוקול הנוכחי. לאחר ההערכה, הפרמטרים טעינת מכני בשימוש בפרוטוקול זה הוכחו לגרום TDSCs לייצר רקמה כמו גיד. יצוין כי הפרמטרים ביוריאקטור חקן צריך במיוחד להתאים את הסוג המתאים של מערכת מתיחה. לדוגמה, הפרמטרים המתאימים עבור מתיחה תא monolayered שונים מגיליון הנוכחי תלת-ממד תא מתיחה26,27. סיבה אפשרית היא מצבי כוח שונים21. במערכת מתיחה מונאולייר 2D, תאים לצרף את המצע התרבות על ידי הידקויות מיקוד בתחתית ולהתחבר זה לזה באמצעות תא-צמתים התאים. עם זאת, בגיליון התא 3D, יש גם הרבה יותר תאים-ECM התקשרויות נוצר כתוצאה של נישה 3D, כלומר התאים נמצאים תחת לחץ בנוסף על מתיחה.

האפקטיביות של הפרוטוקול הנוכחי הוכח על ידי מורפולוגיה ואת רמת הביטוי של סמנים tenogenic. במונחים של מורפולוגיה, מלבד היסטולוגיה, באמצעות מיקרוסקופ הקונלואוסקופיה לזיהוי קולגן אני היא דרך נפוצה לאפיין את ארגון הקולגן ולאחר מכן להעריך את היישור ECM. המחקר הקודם אישר את סוג הקולגן מיושר אני מערך החבילה במבנה TDSC עם 6% גירוי מכני uniaxial עבור 6 ימים, אבל לא באחד ללא טעינת21. סמנים טגנטיים שימשו כדי לזהות תאי גיד, כולל ציר לובן (SCX), מוהוק (MKX), Tenמודולדולין (TNMD) ו COL1A1. רק TNMD היה גורם לא שעתוק, והשאר הם שעתוק גורמים28. . כולם היו מוכרים היטב SCX יכול לווסת את התפתחות גיד בשלב העובריים29, בעוד mkx יכול לווסת בידול גיד והתבגרות בשלב פוסט לידה30. יתר על כן, תכונות מכניות (עומס מקסימום ונוקשות) של רקמה כמו גיד כבר הוערכו במחקר הקודם וכן, והוא הראה את התכונות המכאניות של מבנה TDSC עם טעינה היו טובים יותר מאשר באחד ללא טעינת21.

המדיום יכול להשפיע על צמיחת תאים ובידול. בפרוטוקול הנוכחי, כדי ליצור את גיליון התא בצורה נאותה, TDSCs גדלו 100% המפגש בבקבוקי פלסטיק רגיל נייר לא צופה בינוני מלא, ולאחר מכן TDSCs היו מגורה כדי לקדם את התצהיר ecm על ידי הוספת 4.4 mg/mL חומצה אסקורבית עבור 6 ד. מספר גורמי גדילה, כולל אינסולין כמו גידול גורם אני, גורם הצמיחה של כלי דם אנדותל, טסיות דם נגזר גורם הצמיחה, בסיסי פיברופיצוץ גורם צמיחה, שינוי גורם הצמיחה, ובידול הצמיחה גורם 5, שיחק תפקיד חשוב בהיווצרות גיד וריפוי31,32,33,34. בנוסף הוספת 25 ng/mL רקמת חיבור גורם גידול במדיום תרבות גירוי כמו Ni et al דיווח יכול להאיץ את הצמיחה כולה תהליך הבידול35.

כיום, גיליון התאים הדו, הידוע גם כתא המונולאיל, הוא המערכת הנפוצה ביותר המשמשת לחקירות מכניות. המתיחה הביולית מספקת מתח רב כיווני, הן longitudinally והן משני הצדדים, כיוון שמתיחת האורך היחידה מספקת רק מתיחות36. לפיכך, תרבות התאים המונאולטת עם המתיחה הביולית יכולה לחקות את סביבת הצמיחה של סוגים מסוימים של תאים, כגון הקרדיוציטים ותאים אפידרמריים. עם זאת, המבנה תא תלת-ממד דומה יותר לצורה האמיתית של גיד, ומתיחה uniaxial דומה יותר למאפייני הלחץ של תאים גיד, לעומת גיליון התא 2D ומתיחה biaxial. כך, את השילוב של המבנה תא תלת-ממד ואת מתיחה uniaxial הוא מוכשר יותר להבנה טובה יותר של גיד ומיקרו הסביבה המכנית שלה. זה מספק בסיס תיאורטי לשימוש מערכת מתיחה uniaxial 3D כדי לעורר את הבידול של TDSCs. לפיכך, גיליון התא הדו התגלגל לבסוף למבנה תא תלת-ממדי ועבר מתיחה חד-צירית בפרוטוקול הנוכחי.

הביוריאקטור המשמש בפרוטוקול הנוכחי הורכב ממפעיל ומחדר תרבות (איור 4). פרטי הביואורקטור הנוכחי זמינים במחקר37קודם. כיום, הפעילים הנפוצים ביותר המשמשים גיד כללה מפעילים פנאומטיים, מוטורס ליניארי, ו מוטורי צעד ברגים38,39,40. הלשכה כללה תאים משולבים ומופרדים41,42. ביניהם, חדר מופרד עם מנוע ליניארי סיפק העמסה מכנית מדויקת היה נייד וקל להיות מותאם43.

למעט TDSCs, סוגים אחרים של תאי גזע עשויים להיות מקור תאים פוטנציאלי שישמש בשיטה הנוכחית. מחקרים קודמים הראו שסוגים אחרים של תאי גזע עשויים להיות בעלי יכולת טיפולית פוטנציאלית ועשויים לשפר את התחדשות הגיד. לעומת גידים הסוסים הפצועים מטופלים עם ניהול מבוסס אסלולרי קונבנציונאלי, שיעור הפציעה ‐ re של הגידים שטופלו על ידי BMSCs היה נמוך44,45. יתר על כן, הזרקה intratendinous של BMSCs לתוך מודל tendinopathy יכול ביעילות לגרום התחדשות גיד46. בתאי הגזע הנובעים מאדיפוז, ניתן ביעילות לטפל בtendinopathies סוסים המובילים להחלמה מלאה ולחזור לפעילות נורמלית בסוסים47. ביחד, היו מספיק ראיות כדי להציע כי תאי גזע, למעט TDSCs, יכול לטפל ניוון גיד. עם זאת, כהערה הזהרה, השתלת BMSCs לתוך גידים פצועים הוכח לגרום לבידול אוסטגניים רחמי במודל ארנב, הרומז כי תאי גזע מרקמות ספציפיות עשויה להיות נטייה להבדיל לתאים בלתי רצויים של רקמת המקור שלהם48. במחקר הקודם, טיפול העמסה משולל TDSCs יכול לגרום אוסטגנזה כמו גם21, אשר הוביל את ההצעה כי השיטה הנוכחית יש את הפוטנציאל לגרום tenogenesis של תאי גזע אחרים ולהימנע אוסטגנזה עם משטר טעינה ספציפי. מחקר נוסף הכרחי כדי לחקור את משטרי ההעמסה הספציפיים לסוגים אחרים של תאי גזע. אם תרחיש זה מכיל, מקור תאים נוסף לטיפול בטדינופתיה יהיה זמין.

. יש עדיין מספר מוגבל של מגבלות ראשית, למרות החומר שאינו מאכל ומתאים אוטומטית, פלדת אל-חלד, שימש לבניית מערכת ביוריאקטור חקן, התנאים culturing ובינוני התרבות עדיין התאים בחדר כולל את הבורג ואת הקרס. כך, בדיקה שגרתית של החדר והסרת חלודה בזמן הכרחי. שנית, על מנת להפוך את ביוריאקטור הנוכחי כלכלי ונייד, אין בקרה סביבתית מערכת מחזור בינוני בו. כך, המפעיל צריך להעביר את ביוריאקטור חקן ולפתוח את התא עבור החליפין בינונית כל 3 ימים, אשר מגביר את הסיכון לזיהום. המפעיל חייב תמיד לשים לב כדי לשמור על הסביבה TDSCs סטרילית.

לטיפול בטננופתיה, חיוני להבהיר את התהליך הפתולוגי מנקודת מבט שאינה כירורגית. במונחים של טיפול כירורגי, שיטה אפקטיבית היא להשתמש בשתלים אוטוולוגיים מהונדסים. תהליך העירור של TDSCs לחיקוי הבידול בvivo מועיל לחקירת תהליכים פתולוגיים של טדינופתיה. רקמת מהונדסים לפיגום נטול לחות יש את היכולת לקדם ריפוי גיד במודל פציעה החולדה החלון גיד. חוץ מזה, העבודה הקודמת הוכיחה את הטעינה המכנית יכול לשפר את תכונות מכניות של גיד תרבותי. כך, פרוטוקול זה מספק שיטה הניתנת לקריאה לבידול בבימויו של TDSCs לתוך רקמה כמו גיד, כך שהוא יכול לשמש פשוט וידה עבור תרבות גיד פוטנציאלי הנדסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחקר בוצע בזמן המחבר היה לקבלה של "אוניברסיטת מערב אוסטרליה מלגת הבינלאומי מלגות ופרס לתואר שני באוניברסיטה באוניברסיטת אוסטרליה המערבית". עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81802214).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
  2. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
  3. Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper's knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
  4. Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper's knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
  5. van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
  6. Lopez, R. G. L., Jung, H. -G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
  7. Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), Bristol, Avon. 245-251 (2001).
  8. Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), Oxford, England. 508-521 (2006).
  9. Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
  10. Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), Oxford, England. 131-142 (2004).
  11. Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
  12. Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
  13. Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
  14. Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
  15. Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
  16. Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
  17. Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), Bristol, England. 014109 (2016).
  18. Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
  19. Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
  20. Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
  21. Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
  22. Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
  23. Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
  24. Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
  25. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
  26. Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
  27. Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
  28. Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
  29. Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), Cambridge, England. 2697-2708 (2007).
  30. Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
  31. Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
  32. Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
  33. Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
  34. Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
  35. Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
  36. Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
  37. Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
  38. Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
  39. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
  40. Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
  41. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
  42. Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
  43. Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
  44. Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
  45. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
  46. Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 33-38 (2008).
  47. Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 51-55 (2008).
  48. Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).

Tags

רפואה סוגיה 162 העמסה מכנית תא גזע נגזר גיד tendinopathy bioreactor חקן בידול גיד תא גזע
החלת גירוי מכני תלת מימדי ביוריאקטור מערכת לגרום לבידול Tenogenic של תאי גזע הנגזר גיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen,… More

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter