Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Tendon Türevi Kök Hücrelerin Tenojenik Farklılaşmasını İndüklemek Için Üç Boyutlu Tek Eksenel Mekanik Stimülasyon Biyoreaktör Sistemi Uygulama

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61278
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia
* These authors contributed equally

Summary

Üç boyutlu tek boyutlu tek eksenli mekanik stimülasyon biyoreaktör sistemi tendon kaynaklı kök hücrelerin tenojenik spesifik farklılaşması ve neo-tendon oluşumu için ideal bir biyoreaktördür.

Abstract

Tendinopati bir ortopedik alanda inflamasyon ve dejenerasyon ile ilgili yaygın bir kronik tendon hastalığıdır. Yüksek morbidite, sınırlı kendi kendini onarma kapasitesi ve en önemlisi kesin tedaviler iyatsi olmaması yla, tendinopati hala hastaların yaşam kalitesini olumsuz etkilemez. Tendon kaynaklı kök hücreler (TDSCs), tendon hücrelerinin birincil öncü hücreleri olarak, tendinopati nin gelişiminde ve tendinopati sonrası fonksiyonel ve yapısal restorasyonda önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, in vitro tendon hücrelerine TDSCs in vivo farklılaşma taklit edebilirsiniz bir yöntem yararlı olacaktır. Burada, bu protokol tendon benzeri dokulara farklılaşmak için TDSCs uyarmak için üç boyutlu (3D) tek eksenli germe sistemi dayalı bir yöntem açıklar. Bu protokolün yedi aşaması vardır: farelerin TDSC'lerinin izolasyonu, fare TDSC'lerinin kültürü ve genişlemesi, hücre tabakasının oluşumu için stimülasyon kültür ortamının hazırlanması, stimülasyon ortamında kültür oluşturma yoluyla hücre sayfası oluşumu, 3D tendon kök hücre yapısının hazırlanması, tek eksenli germe mekanik stimülasyon kompleksinin montajı ve mekanik uyarılmış in vitro tendon benzeri dokunun değerlendirilmesi. Etkinliğini histoloji ile gösterilmiştir. Tüm işlem 3 haftadan az sürer. Ekstrasellüler matriks birikimini teşvik etmek için stimülasyon kültürü ortamda 4.4 mg/mL askorbik asit kullanıldı. Lineer motorlu ayrılmış bir hazne doğru mekanik yükleme sağlar ve biyoreaktör için uygulanan taşınabilir ve kolayca ayarlanabilir. Mevcut protokoldeki yükleme rejimi %6 gerinim, 0.25 Hz, 8 saat, ardından 6 gün boyunca 16 saat istirahat edildi. Bu protokol tendondaki hücre farklılaşmasını taklit edebilir, bu da tendinopatinin patolojik sürecinin araştırılmasında yararlıdır. Ayrıca, tendon benzeri doku potansiyel olarak tasarlanmış bir otolog greft olarak tendon yaralanması tendon iyileşmesi teşvik etmek için kullanılır. Özetle, mevcut protokol basit, ekonomik, tekrarlanabilir ve geçerlidir.

Introduction

Tendinopati yaygın spor yaralanmalarından biridir. Esas olarak ağrı ile kendini gösterir, lokal şişlik, etkilenen bölgede azalmış kas gerginliği, ve disfonksiyon. Tendinopati insidansı yüksektir. Aşil tendinopati varlığı orta ve uzun mesafe koşucuları için en sık görülür (kadar 29%), patellar tendinopati varlığı da voleybol sporcular yüksek iken (%45),% 45), basketbol (%32), atletizm (%23), hentbol (%15), ve futbol (%13)1,2,3,4,5. Ancak, tendonun sınırlı kendi kendine iyileşme yeteneği nedeniyle, ve etkili tedavilerin eksikliği, tendinopati hala olumsuz hastaların hayatını etkiler6,7. Ayrıca, tendinopati patogenezi belirsizliğini korumaktadır. "İltihap teorisi", "dejenerasyon teorisi", "aşırı kullanım teorisi" ve benzeri8dahil olmak üzere patogenezi hakkında birçok araştırma yapılmıştır. Şu anda, birçok araştırmacı tendinopati tendon deneyimleri aşırı mekanik yükleme neden mikro yaralanmalar başarısız kendi kendine onarım nedeniyle olduğuna inanıyordu9,10.

Tendon türetilmiş kök hücreler (TDSCs), tendon hücrelerinin birincil öncü hücreleri olarak, tendinopati ve fonksiyonel ve yapısal restorasyon tendinopati11sonra hem gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır11 ,12,13. Bu mekanik stres stimülasyonu proliferasyon ve osteositler, osteoblastlar, düz kas hücreleri, fibroblastlar, mezenkimal kök hücreler ve diğer kuvvete duyarlı hücreler14,,15,16,17,18farklılaşmasına neden olabileceği bildirilmiştir . Bu nedenle, TDSCs, mekanosensitive ve multipotent hücrelerden biri olarak, benzer mekanik yükleme19,20ile ayırt etmek için uyarılabilir.

Ancak, farklı mekanik yükleme parametreleri (yükleme mukavemeti, yükleme frekansı, yükleme türü ve yükleme süresi) farklı hücrelere21ayırt etmek için TDSCs neden olabilir. Bu nedenle tenogenez için etkili ve geçerli bir mekanik yükleme rejimi çok önemlidir. Ayrıca, şu anda TDSCs mekanik yükleme sağlamak için kullanılan stimülasyon sistemleri olarak biyoreaktörler farklı türleri vardır. Her tür biyoreaktörün prensipleri farklıdır, bu nedenle farklı biyoreaktörlere karşılık gelen mekanik yükleme parametreleri de farklıdır. Bu nedenle, biyoreaktör türü, ilgili stimülasyon ortamı ve mekanik yükleme rejimi de dahil olmak üzere basit, ekonomik ve tekrarlanabilir stimülasyon protokolü talep görmektedir.

Bu makalede, TDSC'leri tendon benzeri dokuya ayırmak için uyarmak için üç boyutlu (3D) tek eksenli germe sistemine dayalı bir yöntem açıklanmaktadır. Protokolün yedi aşaması vardır: farelerin TDSC'lerinin izolasyonu, fare TDSC'lerinin kültürü ve genişlemesi, hücre tabakasının oluşumu için stimülasyon kültür ortamının hazırlanması, stimülasyon ortamında kültür oluşturma yoluyla hücre sayfası oluşumu, 3D tendon kök hücre yapısının hazırlanması, tek eksenli germe mekanik stimülasyon kompleksinin montajı ve mekanik uyarılmış in vitro tendon benzeri dokunun değerlendirilmesi. Tüm prosedür çok bazı mevcutyöntemler22,23daha az 3D hücre yapısı, elde etmek için 3 haftadan az sürer. Mevcut protokol tendon dokusu na farklılaştırmak için TDSCs ikna edebilmek için kanıtlanmıştır, ve daha mevcut kullanılan iki boyutlu daha güvenilir (2D) germe sistemi21. Etkinliğini histoloji ile gösterilmiştir. Kısacası, mevcut protokol basit, ekonomik, tekrarlanabilir ve geçerlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Açıklanan yöntemler, Batı Avustralya Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi'nin yönergeleri ve yönetmeliklerine uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir.

1. Fare TDSC'lerinin İzolasyon

  1. 6-8 haftalık C57BL/6 farelerini servikal çıkığı ile ötenazi.
  2. Hasat patellar tendonu24 ve Aşil tendonu25.
  3. Tip I kollajenaz (3 mg/mL) 6 mL olan birinden sindirin tendon 3 saat.
    NOT: Faredeki tendon boyutu küçük olduğundan, bu adımda bir fareden alınan tüm tendon kullanılmalıdır.
  4. 7 gün boyunca fetal sığır serumunun (FBS) %10'u ve streptomisin ve penisilin karışımının %1'ini içeren hücreleri ve kültürü tam minimal esansiyel ortamda (Alpha-MEM) toplayın.
  5. Akış sitometrisine göre floresan aktive hücre sıralaması nı kullanarak TDSC'leri tanımlayın (CD44, CD90 ve Sca-1 dahil hücre yüzey ibelirteçlerinin ifadesi; CD34 ve CD45 ifadesinin olmaması).
  6. Geçiş ve dondurucu hücreler (geçiş 4 hücreleri daha sonraki adımlar için kullanılacaktır).

2. Kültür ve fareler TDSCs genişlemesi

NOT: Steril bir biyogüvenlik başlığı tüm adımları gerçekleştirin.

  1. Isınmış hücreleri (fareler TDSC' leri, 1 milyon hücre, 4.
  2. Yavaş yavaş tam Minimal Esansiyel Orta (Alpha-MEM) ekstra 4-5 mL ekleyin.
  3. Karışımı pipetli 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  4. Bir pipet ile orta ila 8 mL toplam ile topup.
    1. 37 °C'lik fırın kuluçka makinesinde önceden ısınmış ortam.
  5. Tüpü santrifüj ve dengeye yerleştirin.
  6. Santrifüj ve pelet hücreleri 347 x g 5 dk.
  7. Santrifüj den sonra dışarı atın ve alt pelet kontrol edin.
  8. Donma ortamını decant ve hücreleri 1-2 mL'lik tam ortamda hafifçe uzaklaştırın (çok fazla kabarcık yapmaktan kaçının).
  9. Yeniden askıya alınan hücreleri bir pipetle T-75 şişesine aktarın.
  10. 13.000 hücre/cm2son konsantrasyonu ile 10 mL toplam hacmine ulaşmak için şişeye tam Alpha-MEM Orta eklemek için bir pipet kullanın.
  11. Şişeyi %5 CO2ile 37 °C'de kuvöze ve kültüre yerleştirin.
  12. Ortamı her 3 günde bir değiştirin.
  13. Hücreler %100 kesişme (yaklaşık 40.000 hücre/cm2)kültüre girene kadar ortamı değiştirirken hücreleri mikroskop altında gözlemleyin ve izleyin.

3. Hücre sayfası oluşumu için stimülasyon kültür ortamının hazırlanması

NOT: Steril bir biyogüvenlik başlığı tüm adımları gerçekleştirin.

  1. 15 mL steril boruiçine 15 mL tam Alfa-MEM ortamı dökün.
  2. 4.4 g/mL'lik son konsantrasyon için 15 mL orta ortama 6 μL askorbik asit (11 mg/mL) ekleyin.
    NOT: Ayrıca stimülasyon kültürü ortamına 25 ng/mL bağ dokusu büyüme faktörü eklemek tüm büyüme ve farklılaşma sürecini hızlandırabilir.
  3. Yukarı ve aşağı ters çevirerek yavaşça karıştırın.

4. Stimülasyon ortasında kültüredilerek hücre levhası oluşumu

NOT: Steril bir biyogüvenlik başlığı tüm adımları gerçekleştirin.

  1. Normal tam alfa-MEM ortamını dikkatlice atın ve şişenin altına bağlı hücrelere dokunmaktan kaçının.
  2. Yavaş yavaş stimülasyon orta 10 mL ekleyin ve tam olarak konfluent hücrelerde herhangi bir rahatsızlık neden önlemek.
  3. Kültür 9 gün boyunca stimülasyon orta hücreleri (her 3 günde bir orta değiştirmek) yeterli% 5 CO2ile 37 °C'de hücre levha oluşturmak için .
    NOT: Hücre dışı matriks kalın olacak ve askorbik asit tarafından uyarılmış sonra şişenin altından gözlendiğinde bulutlu olmak mevcut, hangi hücre sayfası yeterince oluşturulur anlamına gelir.

5. 3D tendon kök hücre yapısının hazırlanması

NOT: Steril bir biyogüvenlik başlığı tüm adımları gerçekleştirin.

  1. Şişeyi kuvözden çıkar.
  2. Stimülasyon ortamını tamamen atın.
  3. Tek katmanlı hücre sayfasını şişeyi döndürerek fosfat tamponu (PBS) ile yıkayın.
  4. PBS'yi tamamen atın.
  5. Şişenin köşesine 1 mL %0,25 tripsin eklemek için pipet kullanın.
  6. Hücre sayfasının köşesi şişenin alt kısmından inene kadar tek katmanlı hücre sayfasını bağlamak için şişenin köşesine dokunun.
  7. Trippsinizasyonu durdurmak için hemen 9 mL tam Alfa-MEM ortamı ekleyin.
  8. Tamamen monolayer hücre levha soymak için şişe girdap devam edin.
  9. Toplam de-bağlı hücre levhasını orta ile bir Petri kabına dökün.
  10. Hücre sayfasının bir köşesini almak ve 15 kez saat yönünde döndürmek için steril bir cızırtıcı kullanın.
  11. Hücre sayfasının başka bir ucunu al ve tendon benzeri bir in vitro yapı oluşturmak için 10 kez saat yönünün tersine döndürün(Şekil 1A).

6. Benzersiz tasarlanmış biyoreaktörde tek yönlü germe mekanik stimülasyon kompleksinin montajı

NOT: Steril bir biyogüvenlik başlığı tüm adımları gerçekleştirin.

  1. Kancaları konektörle bağlayın ve iki kanca arasında istenilen mesafeye (2 cm) ayarlayın.
  2. 3D TDSC'leri her kancada 3 kez monte edilmiş kancaüzerinde hafifçe rüzgarlayın(Şekil 1B).
  3. İki uçtaki vidaları sıkarak kancaları biyoreaktör odasına hücre yapısıile sabitle.
    NOT: Vidalar ve kancalar da dahil olmak üzere tüm hazne sterildir (134 °C'de 1,5 saat otoklav ve kullanmadan önce 24 saat boyunca ultraviyole ışınları (UV) açığa çıkar). Odaların metal tutucusu için UV ışığı kullanılmadan önce 48 saat boyunca açığa çıkar.
  4. Odayı tam alfa-MEM ortamı ile doldurun.
  5. Aktüatörü kabloile kültür odasına bağlayın.
  6. Kanca konektörünü steril makaslarla kesin.
  7. Mekanik stimülasyon başlatmak için güç ve ilgili kanal denetleyicisini açın.
  8. Kapağı odanın kapağını kapatın.
  9. Gösterge ışıklarını kontrol edin ve biyoreaktörün düzgün çalışabildiğinden emin olun.
  10. Biyoreaktörü kuvöze koyun ve 3D hücre yapısını 6 gün boyunca mekanik germeye tabi tutarak (6% germe, 0,25 Hz, 8 saat, ardından 16 saat dinlenme).

7. Mekanik uyarılmış in vitro tendon benzeri dokunun değerlendirilmesi

  1. Vidaları bir tornavida ile gevşetin ve montajı dikkatlice çıkarın.
  2. 15 dakika fiksasyon için% 4 paraformaldehit içine tendon benzeri doku koyun.
  3. Sabit tendon benzeri dokuyu biyopsi köpük pedli bir biyopsi kasetine yerleştirin.
  4. İşlem örnek dehydrate ve nihayet H & E histolojik boyama ile değerlendirmek.
  5. Tüm protokolü tekrarlayın ve tenojenik belirteçlerin kantitatif PCR (qPCR) ile ekspresyonunu değerlendirmek için tendon benzeri dokudan RNA ayıklayın. Seçilen genler için astarlar Tablo 1'delistelenmiştir.
    NOT: Histoloji protokolü ve qPCR protokolü standart ve bir önceki çalışma21aşağıdaki .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mekanik stimülasyondan önce TDSC'ler tam ortamda %100 biraraya gelir ve düzensiz bir ultrayapısal morfoloji gösterilmiştir(Şekil 2A). 6 günlük tek eksenli germe mekanik yüklemeden sonra, hücre dışı matriks (ECM) ve hücre hizalamaları iyi yönlendirilmiştir(Şekil 2B). Hücreler iyi doldurulur ve mekanik yükleme den sonra ECM'de iyi zarflanmış. Hücre morfolojisi uzatılmış olarak sunuldu ve esneme denkemeyen hücreye göre normal tendon hücresine daha çok benziyordu(Şekil 2C). Yükleme ile hücre yapısındaki hücre yoğunluğu, yükleme olmadan olana göre daha yüksekti. QPCR sonuçları, mevcut yöntemin statik kültür tarafından tedavi edilenlere göre Skleraxis, Mohawk, Tenomodulin ve COL1A1(Şekil 3)gibi tenojenik belirteçlerin ekspresyonunu artırdığını göstermiştir.

Figure 1
Şekil 1: Biyoreaktörün kancaları üzerinde üç boyutlu (3D) hücre yapısının montajı. (A) Kancalar üzerinde 3B hücre yapısının genel görünümü. (B) 3B hücre yapısını kancaların üzerine monte etme diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Mekanik stimülasyon öncesi ve sonrası hücre morfolojisi. (A) Tendon kaynaklı kök hücreler tam ortamda %100 biraraya gelir ve mekanik stimülasyondan önce düzensiz bir ultrayapısal morfoloji gösterilmiştir. (B) Histolojik görüntüler, mekanik stimülasyon dan sonra hücre yapısının H&E boyandığını gösterdi. (C) Histolojik görüntüler, biyoreaktörde 6 gün boyunca mekanik uyarılma olmaksızın kültürlenmiş bir kontrol hücresi yapısının H&E boyandığını gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Tenogenez belirteçlerinin ekspresyon düzeyi. Bireysel gen ekspresyonu düzeyleri önce iç kontrol, 36B4'e karşı normalleştirildi, daha sonra statik kültürlerden gelen gen ekspresyonu düzeylerine göre normalleştirildi. 3 denemenin sonuçları gösterilir. QPCR analizinde kullanılan astar dizileri Tablo 1'deverilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Üç boyutlu tek boyutlu tek eksenli mekanik stimülasyon biyoreaktör sistemi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gen Astar dizisi
İleri 5'->3' Ters 5'->3'
COL1A1 TGACTGGAAGAGCGGAGAGT GTTCGGGCTGATGTACCAGT
Skleraxis CCCAAACAGATCTGCACCTT GGCTCTCCGTGACTCTTCAG
Mohawk GTCCGGCAGCCAGATTTAAG TCGCTGAGCTTTCCCCTTTA
Tenomodülin CCGCAGAAAAGCCTATTGAA GACCACCACCCATTGCTCATTCT
36B4 CTTCCCACTTGCTGAAAAGG CGAAGAGACCGAATCCCATA

Tablo 1: QPCR analizinde kullanılan astar dizileri

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tendon mekanosiz fibröz bağ dokusudur. Önceki araştırmalara göre, aşırı mekanik yükleme tendon kök hücrelerinin osteojenik farklılaşmasına yol açabilir, yetersiz yükleme tendon farklılaşması sırasında düzensiz kollajen lif yapısına yol açacak ise21.

Ortak bir görüş, ideal bir biyoreaktör için anahtar in vitro hücresel mikroenvironment hücreler in vivo geçmesi simüle yeteneği olmasıdır. Bu nedenle, in vivo normal stres ortamını in vitro taklit tendon hücrelerine TDSCs tek soy farklılaşması uyarıcı anahtarıdır. Bu protokolde TDSC yapısının genişliği 2 cm, kancanın hareket aralığı 0,12 cm idi, bu da türün 0.12/2 (%) olduğu anlamına geliyor. Sonuç olarak, TDSC'ler mevcut protokolde 6 gün (%6, 0.25 Hz, 8 saat, ardından 16 saat istirahat) bir biyoreaktörde mekanik olarak uyarılmıştır. Değerlendirmeden sonra, bu protokolde kullanılan mekanik yükleme parametrelerinin TDSC'leri tendon benzeri doku üretmeye ikna ettikleri kanıtlanmıştır. Biyoreaktör parametrelerinin özellikle ilgili germe sistemi tipine uygun olması gerektiği unutulmamalıdır. Örneğin, monokatmanlı hücre germe için uygun parametreler mevcut 3D hücre sayfası26,27uzanan farklıdır. Olası bir nedeni farklı kuvvet modları21. 2B monolayer germe sisteminde hücreler alttaki odak yapışıklıkları ile kültür alt tabakasına bağlanır ve hücre-hücre bağlantıları aracılığıyla birbirlerine bağlanır. Ancak, bir 3D hücre sayfasında, 3D niş sonucu oluşan çok daha fazla hücre-ECM bağlantıları da vardır, hangi hücrelerin germe ek olarak baskı altında olduğu anlamına gelir.

Bu protokolün etkinliği morfoloji si ve tenojenik belirteçlerin ifade düzeyi ile gösterilmiştir. Morfoloji açısından, histoloji dışında, kollajen I tespit etmek için konfokal immünoffloresan mikroskobu kullanarak kollajen organizasyon karakterize etmek ve daha sonra ECM hizalama değerlendirmek için ortak bir yoldur. Önceki çalışmada 6 gün boyunca% 6 tek eksenli mekanik stimülasyon ile TDSC yapısında iyi hizalanmış kollajen tip I demet oluşumu doğruladı ama21yükleme olmadan bir . Tenojenik belirteçler Skleraxis (SCX), Mohawk (MKX), Tenomodulin (TNMD) ve COL1A1 dahil olmak üzere tendon hücrelerini tanımlamak için kullanıldı. Sadece TNMD transkripsiyon olmayan bir faktördü ve geri kalanı transkripsiyon faktörleri28. Hepsi iyi tanınıyordu. SCX embriyonik evrede tendon gelişimini düzenleyebilir29, MKX postnatal evre teten farklılaşma ve olgunlaşma düzenleyen iken30. Ayrıca, tendon benzeri dokunun mekanik özellikleri (max yük ve sertlik) önceki çalışmada da değerlendirilmiştir, ve yükleme ile TDSC yapımekanik özellikleri gösterdi21yükleme olmadan bir daha iyi idi .

Ortam hücre büyümesini ve farklılaşmasını etkileyebilir. Bu protokolde, hücre sayfasını uygun bir şekilde oluşturmak için, TDSC'ler standart kaplanmamış plastik şişelerde tam ortamda %100 biraraya getirilmiş ve daha sonra TDSC'ler 6 d için 4.4 mg/mL askorbik asit ekleyerek ECM birikimini teşvik etmek için uyarılmıştır. İnsülin benzeri büyüme faktörü I, vasküler endotelsel büyüme faktörü, trombosit kaynaklı büyüme faktörü, bazik fibroblast büyüme faktörü, büyüme faktörü dönüştürme ve büyüme farklılaşma faktörü 5 dahil olmak üzere çeşitli büyüme faktörleri, tendon oluşumu ve iyileşme önemli bir rol oynadı31,32,33,34. Ayrıca Ni ve ark. olarak bildirilen stimülasyon kültür orta 25 ng / mL bağ dokusu büyüme faktörü ekleyerek tüm büyüme ve farklılaşma sürecini hızlandırabilir35.

Şu anda, 2B hücre sayfası, aynı zamanda tek katmanlı hücre olarak bilinen, mekanik araştırmalar için kullanılan en yaygın sistemdir. Biaksiyel streç çok yönlü gerginlik sağlar, hem uzunlamasına hem de yanal, tek eksenli streç sadece uzunlamasına gerginlik sağlar36. Böylece, biaksiyel streç ile monokatmanlı hücre kültürü, kardiyomiyositler ve epidermal hücreler gibi hücrelerin bazı türlerinin büyüme ortamını taklit edebilir. Ancak, 3D hücre yapısı bir tendon gerçek şekline daha benzer, ve uniaxial streç daha tendon hücrelerinin stres özelliklerine benzer, 2D hücre sayfası ve biaksiyel streç ile karşılaştırıldığında. Böylece, 3D hücre yapısı ve tek eksenli germe kombinasyonu tendon ve mekanik mikro-çevre daha iyi anlaşılması için daha yetkin. Bu, TDSC'lerin farklılaşmasını uyarmak için 3D tek eksenli germe sistemi kullanmak için teorik bir temel sağlar. Böylece, 2B hücre sayfası nihayet bir 3D hücre yapısı içine yuvarlandı ve mevcut protokolde tek eksenli bir streç yapıldı.

Bu protokolde kullanılan biyoreaktör aktüatör ve kültür odasından oluşuyordu (Şekil 4). Mevcut biyoreaktör ayrıntıları bir önceki çalışmada mevcuttur37. Şu anda, tendon için kullanılan en yaygın aktüatörler pnömatik aktüatörler dahil, lineer motorlar, ve adım motorlu vidalar38,39,40. Odalar entegre ve ayrılmış odalarıdahil 41,42. Bunlar arasında, doğrusal motor ile ayrılmış bir oda doğru mekanik yükleme sağlanan ve taşınabilir ve kolay ayarlanabilir43.

TDSC'ler dışında, diğer kök hücre türleri mevcut yöntemde kullanılmak üzere potansiyel bir hücre kaynağı olabilir. Önceki araştırmalar, diğer kök hücre türlerinin potansiyel tedavi yeteneğine sahip olabileceğini ve tendon rejenerasyonunu iyileştirebileceğini göstermiştir. Konvansiyonel nonsellüler tabanlı yönetim ile tedavi edilen yaralı at tendonları ile karşılaştırıldığında, BMSCs tarafından tedavi edilen tendonun yeniden yaralanma oranı daha düşüktü44,45. Ayrıca, bir tendinopati modeli içine BMSCs intratendinous enjeksiyon etkili tendon rejenerasyon neden olabilir46. Adipose türetilmiş kök hücreler etkili tam iyileşme ve atlar normal aktiviteye dönmek için yol açan at tendinopaties tedavi edebilir47. Birlikte, TDSCs dışında kök hücrelerin tendon dejenerasyonu tedavi olabileceğini düşündürecek yeterli kanıt vardı. Ancak, bir uyarı notu olarak, yaralı tendonları içine BMSC transplantasyonu bir tavşan modelinde ektopik osteojenik farklılaşma neden gösterilmiştir, belirli bir dokukök hücrelerinin menşe doku istenmeyen hücrelere ayırt etmek için bir eğilim olabileceğini düşündüren48. Önceki araştırmalarda, TDSCs yükleme yoksun tedavi osteogenezis i de neden olabilir21, mevcut yöntem diğer kök hücrelerin tenogenezini indüklemek ve spesifik yükleme rejimi ile osteogenezis önlemek için potansiyele sahip olduğu önerisiyol açtı. Daha fazla araştırma kök hücrelerin diğer türleri için bu özel yükleme rejimleri keşfetmek için gereklidir. Bu senaryo tutarsa, tendinopati tedavisi için daha fazla hücre kaynağı mevcut olacaktır.

Hala kabul edilmesi gereken bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, bir aşındırıcı ve otoklavable malzeme, paslanmaz çelik, biyoreaktör sistemi inşa etmek için kullanılan rağmen, kültür koşulları ve kültür ortamı hala vida ve kanca da dahil olmak üzere oda korozyon. Bu nedenle, oda rutin muayene ve zamanında pas kaldırma gereklidir. İkinci olarak, mevcut biyoreaktör ekonomik ve taşınabilir yapmak için, bir çevresel kontrol ve orta sirkülasyon sistemi yoktur. Bu nedenle, operatör biyoreaktör taşımak ve orta değişim için her 3 günde bir oda açmak gerekir, hangi kontaminasyon riskini artırır. Operatör her zaman TDSCs ortamı steril tutmak için dikkat etmelidir.

Tendinopati nin tedavisi için patolojik sürecin cerrahi olmayan bir perspektiften açıklığa kavuşturulması hayati önem taşımaktadır. Cerrahi tedavi açısından, etkili bir yöntem tasarlanmış otolog greftler kullanmaktır. TDSC'leri in vivo farklılaşmayı taklit etmek için uyarma süreci, tendinopatinin patolojik sürecinin araştırılmasında yararlıdır. Tasarlanmış iskele içermeyen tendon dokusu bir sıçan patellar tendon pencere yaralanma modelinde tendon iyileşmesini teşvik yeteneğine sahiptir. Ayrıca, önceki çalışmalar mekanik yükleme kültürlü tendon mekanik özelliklerini artırabilir kanıtladı. Böylece, bu protokol, tdc'lerin tendon benzeri dokuya yönlendirilmiş farklılaşması için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar, böylece potansiyel mühendislik tendon kültürü için basit ve uygulanabilir olarak kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Araştırma, yazar "Batı Avustralya Üniversitesi Uluslararası Ücret Bursu ve Batı Avustralya Üniversitesi'nde Üniversite Yüksek Lisans Ödülü" alırken gerçekleştirildi. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81802214) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
  2. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
  3. Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper's knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
  4. Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper's knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
  5. van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
  6. Lopez, R. G. L., Jung, H. -G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
  7. Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), Bristol, Avon. 245-251 (2001).
  8. Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), Oxford, England. 508-521 (2006).
  9. Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
  10. Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), Oxford, England. 131-142 (2004).
  11. Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
  12. Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
  13. Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
  14. Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
  15. Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
  16. Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
  17. Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), Bristol, England. 014109 (2016).
  18. Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
  19. Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
  20. Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
  21. Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
  22. Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
  23. Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
  24. Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
  25. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
  26. Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
  27. Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
  28. Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
  29. Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), Cambridge, England. 2697-2708 (2007).
  30. Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
  31. Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
  32. Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
  33. Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
  34. Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
  35. Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
  36. Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
  37. Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
  38. Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
  39. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
  40. Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
  41. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
  42. Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
  43. Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
  44. Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
  45. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
  46. Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 33-38 (2008).
  47. Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 51-55 (2008).
  48. Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).

Tags

Tıp Sayı 162 Mekanik yükleme tendon kaynaklı kök hücre tendinopati biyoreaktör farklılaşma tendon kök hücre
Tendon Türevi Kök Hücrelerin Tenojenik Farklılaşmasını İndüklemek Için Üç Boyutlu Tek Eksenel Mekanik Stimülasyon Biyoreaktör Sistemi Uygulama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen,… More

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter