Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Anvendelse af en tre-dimensionel Uniaxial Mekanisk Stimulation Bioreactor System til at fremkalde tenogen differentiering af senen-afledte stamceller

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61278
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia
* These authors contributed equally

Summary

Et tredimensionelt uniaxial mekanisk stimulationsbioreaktorsystem er et ideelt bioreaktor til tenogen-specifik differentiering af seneafledte stamceller og neosendannelse.

Abstract

Tendinopati er en almindelig kronisk senesygdom i forbindelse med inflammation og degeneration i et ortopædisk område. Med høj sygelighed, begrænset selvreparerende kapacitet og, vigtigst af alt, ingen endelige behandlinger, tendinopati stadig påvirker patienternes livskvalitet negativt. Sene-afledte stamceller (TDSCs), som primære prækursor celler af senenceller, spiller en afgørende rolle i både udviklingen af tendinopati, og funktionelle og strukturelle restaurering efter tendinopati. Således, en metode, der kan in vitro efterligne in vivo differentiering af TDSCs i senen celler ville være nyttig. Her beskriver denne protokol en metode baseret på et tredimensionelt (3D) uniaxial stretching system til at stimulere TDSCs at differentiere i sene-lignende væv. Der er syv faser af denne protokol: isolering af mus TDSCs, kultur og udvidelse af mus TDSCs, forberedelse af stimulation kultur medium for celleark dannelse, celle ark dannelse ved liggende i stimulation medium, forberedelse af 3D senen stamceller konstruere, samling af uniaxial-stretching mekanisk stimulation kompleks, og evaluering af den mekaniske stimuleret in vitro senen-lignende væv. Virkningen blev påvist ved histologi. Hele proceduren tager mindre end 3 uger. For at fremme ekstracellulær matrix aflejring, 4.4 mg/ml ascorbinsyre blev brugt i stimulation kultur medium. Et adskilt kammer med en lineær motor giver nøjagtig mekanisk belastning og er bærbar og let justeres, som anvendes til bioreaktoren. Lastningsordningen i denne protokol var 6% stamme, 0,25 Hz, 8 timer, efterfulgt af 16 h hvile i 6 dage. Denne protokol kunne efterligne celle differentiering i senen, hvilket er nyttigt for undersøgelsen af den patologiske proces med tendinopati. Desuden er senen-lignende væv potentielt bruges til at fremme senen healing i senen skade som en manipuleret autolog graft. Sammenfattende er denne protokol enkel, økonomisk, reproducerbar og gyldig.

Introduction

Tendinopati er en af de almindelige sportsskader. Det er hovedsageligt manifesteret ved smerte, lokale hævelse, nedsat muskelspændinger i det berørte område, og dysfunktion. Forekomsten af tendinopati er høj. Tilstedeværelsen af Achilles tendinopati er mest almindelig for mellem- og langdistanceløbere (op til 29%), mens tilstedeværelsen af patellar tendinopati er også høj i atleter af volleyball (45%), basketball (32%), atletik (23%), håndbold (15%), og fodbold (13%)1,2,,3,4,5. Men på grund af den begrænsede selvhelbredende evne af senen, og manglen på effektive behandlinger, tendinopati stadig påvirker patienternes liv negativt6,7. Desuden er patogenesen af tendinopati fortsat uklart. Der har været mange undersøgelser om dens patogenese, primært herunder "inflammation teori", "degeneration teori", "overforbrug teori", og så videre8. På nuværende tidspunkt, mange forskere mente, at tendinopati skyldtes den mislykkede selvreparation til mikro-skader forårsaget af overdreven mekanisk lastning senen oplevelser9,10.

Senebaserede stamceller (TDSC'er) spiller som primære prækursorceller i senceller en afgørende rolle i både udviklingen af tendinopati og funktionel og strukturel genopretning eftertendinopati 11,12,13. Det blev rapporteret, at mekanisk stressstimulation kunne forårsage spredning og differentiering af osteocytter, osteoblaster, glatte muskelceller, fibroblaster, mesenkymale stamceller og andre kraftfølsommeceller 14,15,16,17,18. TDSC'er, som en af de mechanosensitive og multipotente celler, kan derfor ligeledes stimuleres til at differentiere ved mekanisk belastning19,20.

Forskellige mekaniske belastningsparametre (belastningsstyrke, belastningsfrekvens, lastetype og indlæsningsperiode) kan imidlertid få FDSC'erne til at differentiere sig i forskelligeceller 21. En effektiv og gyldig mekanisk belastningsordning er således meget vigtig for tenogenese. Desuden findes der forskellige typer bioreaktorer som stimuleringssystemer, der i øjeblikket anvendes til at levere mekanisk belastning til TDSC'er. Principperne for hver type bioreaktor er forskellige, så de mekaniske belastningsparametre, der svarer til forskellige bioreaktorer, er også forskellige. Derfor er der en enkel, økonomisk og reproducerbar stimuleringsprotokol i efterspørgslen, herunder typen af bioreaktor, det tilsvarende stimuleringsmedium og den mekaniske belastningsregime.

Denne artikel beskriver en metode baseret på en tre-dimensionel (3D) uniaxial stretching system til at stimulere TDSCs at differentiere i senen-lignende væv. Der er syv faser af protokollen: isolering af mus TDSCs, kultur og udvidelse af mus TDSCs, forberedelse af stimulation kultur medium for celle ark dannelse, celle ark dannelse ved liggende i stimulation medium, forberedelse af 3D senen stamcellekonstruktion, samling af uniaxial-stretching mekanisk stimulation kompleks, og evaluering af den mekaniske stimuleret in vitro senen-lignende væv. Hele proceduren tager mindre end 3 uger at opnå 3D-celle konstruktion, som er langt mindre end nogle eksisterende metoder22,23. Denne protokol har vist sig at være i stand til at få TDSCs til at differentiere sig til senevæv, og den er mere pålidelig end det nuværende almindeligt anvendte todimensionale (2D) stretchingsystem21. Virkningen blev påvist ved histologi. Kort sagt er denne protokol enkel, økonomisk, reproducerbar og gyldig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De beskrevne metoder blev godkendt og udført i overensstemmelse med retningslinjerne og forskrifterne fra University of Western Australia Animal Ethics Committee.

1. Isolering af mus TDSCs

  1. Aflive de 6-8-uger gamle C57BL/6 mus ved livmoderhalskræft dislokation.
  2. Høst patellar sener24 og Achilles sener25.
  3. Fordøje sener fra en med 6 ml type I kollagen (3 mg/ml) for 3 timer.
    BEMÆRK: Da senens størrelse i musen er lille, bør alle sener, der er høstet fra én mus, anvendes i dette trin.
  4. Cellerne og kulturen opsamles i komplet Minimal Essential Medium (Alpha-MEM), der indeholder 10 % af føtalt kvægserum (FBS) og 1 % af blandingen af streptomycin og penicillin i 7 dage.
  5. Identificer TDSC'er ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering efter flowcytometri (udtryk for celleoverflademarkører, herunder CD44, CD90 og Sca-1; manglende ekspression af CD34 og CD45).
  6. Passage og fryse celler (passage 4 celler vil blive brugt til yderligere trin).

2. Kultur og udvidelse af mus TDSCs

BEMÆRK: Udret alle trin i en steril biosikkerhedshætte.

  1. Tag de opvarmede celler (mus TDSCs, 1 million celler, passage 4, til 37 °C).
  2. Tilsæt langsomt ekstra 4-5 ml komplet Minimal Essential Medium (Alpha-MEM).
  3. Blandingen overføres til et 15 ml centrifugerør med en pipette.
  4. Top op med medium til 8 ml i alt med en pipette.
    1. Forvarm medium i en 37 °C ovn inkubator.
  5. Røret anbringes i centrifuge og balance.
  6. Centrifuge- og pelletceller ved 347 x g i 5 min.
  7. Tag ud efter centrifuge og kontrollere pellet i bunden.
  8. Dekantere frysemediet og resuspenderede celler forsigtigt i 1-2 ml komplet medium (undgå at lave for mange bobler).
  9. Resuspenderede celler overføres til en T-75 kolbe med en pipette.
  10. Der anvendes en pipette til at tilsætte komplet Alpha-MEM Medium til kolben for at nå et samlet volumen på 10 ml med en slutkoncentration på 13.000 celler/cm2.
  11. Kolben anbringes i inkubatoren og kulturen ved 37 °C med 5% CO2.
  12. Skift mediet hver 3.
  13. Overvåg og overvåg cellerne under et mikroskop, når mediet ændres, indtil cellerne dyrkes til 100 % sammenløb (ca. 40.000 celler/cm2).

3. Forberedelse af stimuleringskulturmedium til cellepladedannelse

BEMÆRK: Udret alle trin i en steril biosikkerhedshætte.

  1. 15 ml komplet Alpha-MEM medium hældes i et 15 ml sterilt rør.
  2. Der tilsættes 6 μL ascorbinsyre (11 mg/ml) til 15 ml medium til en endelig koncentration på 4,4 μg/ml.
    BEMÆRK: Derudover tilføje 25 ng / ml bindevæv vækstfaktor i stimulation kultur medium kan fremskynde hele vækst og differentiering proces.
  3. Bland forsigtigt ved at vende op og ned.

4. Celleark dannelse ved givende i stimulation medium

BEMÆRK: Udret alle trin i en steril biosikkerhedshætte.

  1. Det normale komplette alfa-MEM-medium kasseres forsigtigt, og undgå at berøre de celler, der er fastgjort til bunden af kolben.
  2. Der tilsættes 10 ml stimuleringsmedium langsomt, og undgå at forårsage forstyrrelser i de fuldt sammenflydende celler.
  3. Æd cellerne i stimuleringsmedium i 9 dage (skift mediet hver 3. dag) for at generere cellearket tilstrækkeligt ved 37 °C med 5% CO2.
    BEMÆRK: Ekstracellulær matrix bliver tyk og til stede for at være uklar, når den observeres fra bunden af kolben efter stimuleret af ascorbinsyre, hvilket betyder, at cellearket er tilstrækkeligt genereret.

5. Forberedelse af 3D senen stamcelle konstruktion

BEMÆRK: Udret alle trin i en steril biosikkerhedshætte.

  1. Kolben skal ud af inkubatoren.
  2. Smid stimuleringsmediet helt ud.
  3. Monolayercellearket vaskes med fosfatbuffersalline (PBS) ved at hvirvle kolben rundt.
  4. PBS-pbs'en kasseres helt.
  5. Brug en pipette til at tilsætte 1 ml 0,25% trypsin til hjørnet af kolben.
  6. Kolbens hjørne anbringes for at afhæfte cellearket af, indtil hjørnet af cellearket er væk fra bunden af kolben.
  7. Tilsæt straks 9 ml komplet Alpha-MEM medium for at stoppe trypsinization.
  8. Fortsætte med at hvirvle kolben for at skrælle monolagscellearket helt af.
  9. Hæld det samlede afmonterede celleark i en petriskål med medium.
  10. Brug en steril pincet til at hente det ene hjørne af cellearket og rotere i urets retning 15 gange.
  11. Samk en anden ende af cellearket og roter i mod urets retning i 10 gange for at generere en senelignende in vitro-konstruktion (Figur 1A).

6. Samling af uniaxial-stretching mekanisk stimulation kompleks i unik designet bioreaktor

BEMÆRK: Udret alle trin i en steril biosikkerhedshætte.

  1. Tilslut krogene med forbinderen og juster til den ønskede afstand (2 cm) mellem to kroge.
  2. Vind forsigtigt 3D TDSCs konstruktion på den samlede krog i 3 gange på hver krog (Figur 1B).
  3. Fastgør krogene med cellekonstruktion på bioreaktorkammeret ved at stramme skruerne i to ender.
    BEMÆRK: Hele kammeret, herunder skruer og kroge, er sterilt (autoklave i 1,5 timer ved 134 °C og ultraviolette stråler (UV) eksponere i 24 timer før brug). For metalholderen af kamre, UV-lys udsætte i 48 timer før brug.
  4. Fyld kammeret op med komplet Alpha-MEM medium.
  5. Tilslut aktuatoren til kulturkammeret via kabel.
  6. Skær krogene forbinder med sterile saks.
  7. Tænd for strømmen og den tilhørende kanalcontroller for at starte mekanisk stimulering.
  8. Sæt låget på kammeret.
  9. Kontroller indikatorlysene, og sørg for, at bioreaktoren kan fungere korrekt.
  10. Sæt bioreaktoren i kuvøsen og udsætte 3D-celle konstruktion til mekanisk stretching i 6 dage (6% stretching, 0,25 Hz, 8 h, efterfulgt af 16 h hvile).

7. Evaluering af det mekanisk stimulerede in vitro senelignende væv

  1. Løs skruerne af en skruetrækker og tag samlingen forsigtigt af.
  2. Sæt senen-lignende væv i 4% paraformaldehyd til fiksering i 15 min.
  3. Placer den faste sene-lignende væv i en biopsi kassette med biopsi skum puder.
  4. Processen til at dehydrere prøven og endelig evaluere ved H&E histologisk farvning.
  5. Hele protokollen gentages, og RNA udtrækkes fra det senelignende væv for at vurdere ekspressionen af tenogene markører ved kvantitativ PCR (qPCR). Primere for de udvalgte gener er anført i tabel 1.
    BEMÆRK: Histologiprotokol og qPCR-protokol er standard og efter en tidligere undersøgelse21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før mekanisk stimulation blev TDSC'erne dyrket til 100% sammenløb i komplet medium og viste en uorganiseret ultrastruken morfologi (Figur 2A). Efter 6 dages uniaxial stretching mekanisk belastning, ekstracellulære matrix (ECM) og celle justeringer var godt orienteret (Figur 2B). Cellerne var godt befolket og godt indhyllet i ECM efter mekanisk belastning. Cellemorfologi blev præsenteret for at være aflange og var mere ligner normal senecelle sammenlignet med den uden at strække (Figur 2C). Celletæthed i cellekonstruktion med indlæsning var højere end i den uden at indlæse. QPCR-resultaterne viste, at den nuværende metode øgede ekspressionen af de tenogene markører, herunder Scleraxis, Mohawk, Tenomodulin og COL1A1 (figur 3) sammenlignet med dem, der blev behandlet med statisk kultur.

Figure 1
Figur 1: Samling af tredimensionel (3D) cellekonstruktion over bioreaktorens kroge. (A) Generel visning af 3D-celle konstruere over krogene. (B) Diagrammet til at samle 3D-celle konstruere over krogene. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Cellemorfologi før og efter mekanisk stimulation. (A) Senen-afledte stamceller blev dyrket til 100% sammenløb i komplet medium og viste en uorganiseret ultrastrukne morfologi før mekanisk stimulation. (B) Histologiske billeder viste H & E farvning af celle konstruere efter mekanisk stimulation. (C) Histologiske billeder viste H & E farvning af en kontrol celle konstruere dyrket i bioreaktor i 6 dage uden mekanisk stimulation. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Udtryksniveau for tenogenesismarkører. Individuelle genekspressionsniveauer blev først normaliseret mod den interne kontrol, 36B4, og derefter normaliseret mod genekspressionsniveauer fra statiske kulturer. Resultater fra 3 forsøg vises. De primersekvenser , der anvendes til qPCR-analyse , findes i tabel 1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Det tredimensionale uniaxiale mekaniske stimulationsbioreaktorsystem. Klik her for at se en større version af dette tal.

Gen Primer-sekvens
Fremad 5'->3' Omvendt 5'->3'
COL1A1 delte et TGACTGGAAGAGGGGAGAGT DELTE ET GTTCGGGCTGATGTACCAGT
Scleraxis CCCAAACAGATCTGCACCTT GGCTCTCCGTGACTTCAG
Mohawk GTCCGGCAGCCAGATTTTAAG TCGCTGAGCTTTCCCCTTTT
Tenomodulin (Tenomodulin) CCGCAGAAAAGCCTTGAA GACCACCCATTGCTCATTCT
kr. CTTCCCACTTGCTGAAAAGG CGAAGAGACCGAATCCCATA

Tabel 1: Primersekvenser, der bruges til qPCR-analyse

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Senen er en mechanosensitive fibrøst bindevæv. Ifølge tidligere forskning, overskydende mekanisk belastning kan føre til osteogene differentiering af senen stamceller, mens utilstrækkelig belastning ville føre til uordnede kollagen fiber struktur under senen differentiering21.

En fælles opfattelse er, at nøglen til en ideel bioreaktor er evnen til at simulere in vitro cellulære mikromiljø, at cellerne in vivo gennemgå. Derfor efterligner in vivo normale stress miljø in vitro er nøglen til at stimulere single-lineage differentiering af TDSCs i senen celler. I denne protokol var bredden af TDSC-konstruktionen 2 cm, og krogens bevægelsesområde var 0,12 cm, hvilket betyder, at stammen var 0,12/2 (%). Det kan konkluderes, at TDSC'erne blev mekanisk stimuleret i et bioreaktor i 6 dage (6 %, 0,25 Hz, 8 timer efterfulgt af 16 timer hvile) i denne protokol. Efter evaluering har de mekaniske belastningsparametre, der anvendes i denne protokol, vist sig at få TDSC'er til at generere senelignende væv. Det skal bemærkes, at bioreaktorparametrene specifikt bør svare til den tilsvarende type stretching system. De korrekte parametre for monolagede cellestrækninger er26,f.eks. En mulig årsag er de forskellige kraftmodes21. I 2D monolayer stretching system, celler tillægger kultur substratet ved fokale sammenvoksninger i bunden og oprette forbindelse til hinanden via celle-celle kryds. Men i et 3D-celleark er der også mange flere celle-ECM-forbindelser dannet som følge af 3D-nichen, hvilket betyder, at cellerne er under pres ud over at strække.

Virkningen af denne protokol blev påvist ved morfologi og udtryksniveauet for tenogene markører. Med hensyn til morfologi, bortset fra histologi, ved hjælp af konfokal immunfluorescens mikroskopi til at opdage kollagen jeg er en almindelig måde at karakterisere kollagen organisation og derefter evaluere ECM tilpasning. Tidligere undersøgelse bekræftede godt justeret kollagen type I bundt dannelse i TDSC konstruere med 6% uniaxial mekanisk stimulation i 6 dage, men ikke i den ene uden at indlæse21. Tenogene markører blev anvendt til at identificere seneceller, herunder Scleraxis (SCX), Mohawk (MKX), Tenomodulin (TNMD) og COL1A1. Kun TNMD var en ikke-transskription faktor, og resten af dem er transskriptionfaktorer 28. De var alle meget anerkendte. SCX kunne regulere seneudviklingen ifosterfasen 29, mens MKX kunne regulere senedifferentiering og modning i postnatalfase 30. Desuden er de mekaniske egenskaber (max belastning og stivhed) af senen-lignende væv er blevet evalueret i tidligere undersøgelse samt, og det viste de mekaniske egenskaber af TDSC konstruere med lastning var bedre end i den ene udenbelastning 21.

Mediet kan påvirke cellevækst og differentiering. I denne protokol blev TDSC'erne for at danne cellearket på en ordentlig måde dyrket til 100 % sammenløb i ikke-udstråede plastkolber i det komplette medium, og derefter blev TDSC'erne stimuleret til at fremme ECM-aflejring ved tilsætning af 4,4 mg/ml ascorbinsyre til 6 d. Flere vækstfaktorer, herunder insulin-lignende vækstfaktor I, vaskulære endotel vækstfaktor, trombocyt-afledte vækstfaktor, grundlæggende fibroblast vækstfaktor, omdanne vækstfaktor, og vækstdifferentiering faktor 5, spillede en vigtig rolle i senen dannelse og healing31,32,33,34. Derudover kan tilføjelse af 25 ng/ml bindevævsvækstfaktor i stimuleringskulturmediet, da Ni et al. rapporterede kunne fremskynde hele vækst- og differentieringsprocessen35.

På nuværende tidspunkt er 2D-cellearket, også kendt som den monolagede celle, det mest almindelige system, der anvendes til mekaniske undersøgelser. Biaksial stretch giver multidirectional spænding, både langsgående og sidelæns, som den uniaxial strækning kun giver langsgående spænding36. Således monolayered cellekultur med biaxial stretch kunne efterligne vækstmiljøet af nogle typer af celler, såsom kardiomyocytter og epidermale celler. Men 3D-celle konstruktion er mere ligner den virkelige form af en sene, og uniaxial stretch er mere ligner stress egenskaber af senen celler, sammenlignet med 2D-celleark og biaxial stretch. Således er kombinationen af 3D-cellekonstruktionen og den uniaxial stretching mere kompetent til bedre forståelse af senen og dens mekaniske mikromiljø. Dette giver et teoretisk grundlag for at bruge et 3D uniaxial stretching system til at stimulere differentieringen af TDSCs. Således blev 2D-cellearket endelig rullet ind i en 3D-cellekonstruktion og gennemgik en uniaxial strækning i denne protokol.

Den bioreaktor, der anvendes i denne protokol, bestod af aktuator- og kulturkammer (figur 4). Detaljerne i denne bioreaktor findes i en tidligere undersøgelse37. I øjeblikket, de mest almindelige aktuatorer, der anvendes til senen omfattede pneumatiske aktuatorer, lineære motorer, og trin motorball skruer38,39,40. Kamrene omfattede integrerede ogadskilte kamre 41,42. Blandt dem, et adskilt kammer med en lineær motor forudsat nøjagtig mekanisk belastning og var bærbare og let at justere43.

Bortset fra TDSC'er kan andre typer stamceller være en potentiel cellekilde, der kan anvendes i denne metode. Tidligere forskning har vist, at andre typer af stamceller kan have potentielle terapeutiske evner og kan forbedre senen regenerering. Sammenlignet med skadede hestesenener , der blev behandlet med konventionel ikke-cellulær baseret forvaltning , var skadesfrekvensen for de sener , der blev behandlet med BMSC' er ,lavere 44,45. Desuden kan intratendinøs injektion af BMSC'er i en tendinopatimodel effektivt fremkalde seneregenerering46. Afledte stamceller fra fedt kan effektivt behandle heste tendinopatier, der fører til fuldstændig helbredelse og vende tilbage til normal aktivitet hosheste 47. Sammen var der nok beviser for, at stamceller, undtagen TDSCs, kunne behandle senendegeneration. Som en advarsel har transplantation af BMSC'er til skadede sener imidlertid vist sig at fremkalde ektopisk osteogendifferentiering i en kaninmodel, hvilket tyder på, at stamceller fra et bestemt væv kan have en tendens til at differentiere sig til uønskede celler i deres oprindelsesvæv48. I tidligere forskning kan lastningsberøvet behandling af TDSC'er resultere i osteogenese samt21, hvilket førte til forslaget om, at den nuværende metode har potentiale til at fremkalde tenogenese af andre stamceller og undgå osteogenese med specifik belastningsordning. Der er behov for yderligere forskning for at undersøge disse specifikke belastningsordninger for andre typer stamceller. Hvis dette scenario holder, vil der være flere cellere, der skal behandles tendinopati.

Der er stadig nogle begrænsninger, der skal anerkendes. For det første, selv om et ikke-korrosivt og autoklavt materiale, rustfrit stål, blev brugt til at bygge bioreaktorsystemet, korroderer de ætsningsbetingelser og kulturmediet stadig kammeret, herunder skruen og krogen. Således rutinemæssig inspektion af kammeret og rettidig rust fjernelse er nødvendige. For det andet er der for at gøre den nuværende bioreaktor økonomisk og bærbar, men der er ikke noget system til miljøkontrol og medium cirkulation i den. Således operatøren har brug for at transportere bioreaktoren og åbne kammeret for medium udveksling hver 3 dage, hvilket øger risikoen for forurening. Operatøren skal altid være opmærksom på at holde TDSCs-miljøet sterilt.

Til behandling af tendinopati, er det vigtigt at afklare den patologiske proces fra et ikke-kirurgisk perspektiv. Med hensyn til kirurgisk behandling, en effektiv metode er at bruge manipuleret autologe grafts. Processen med at stimulere TDSCs at efterligne differentiering in vivo er nyttigt for undersøgelsen af patologisk proces med tendinopati. Den manipuleret stillads-fri senen væv har evnen til at fremme senen healing i en rotte patellar senen vindue skade model. Desuden tidligere arbejde bevist den mekaniske belastning kunne forbedre de mekaniske egenskaber af dyrkede senen. Således, denne protokol giver en reproducerbar metode til rettet differentiering af TDSCs i senen-lignende væv, således at det kan bruges enkelt og muligt for potentielle manipuleret senen kultur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forskningen blev udført, mens forfatteren var i modtagelsen af "en University of Western Australia International Fee Scholarship og en University Postgraduate Award på The University of Western Australia". Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81802214).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
  2. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
  3. Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper's knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
  4. Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper's knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
  5. van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
  6. Lopez, R. G. L., Jung, H. -G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
  7. Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), Bristol, Avon. 245-251 (2001).
  8. Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), Oxford, England. 508-521 (2006).
  9. Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
  10. Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), Oxford, England. 131-142 (2004).
  11. Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
  12. Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
  13. Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
  14. Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
  15. Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
  16. Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
  17. Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), Bristol, England. 014109 (2016).
  18. Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
  19. Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
  20. Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
  21. Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
  22. Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
  23. Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
  24. Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
  25. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
  26. Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
  27. Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
  28. Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
  29. Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), Cambridge, England. 2697-2708 (2007).
  30. Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
  31. Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
  32. Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
  33. Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
  34. Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
  35. Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
  36. Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
  37. Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
  38. Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
  39. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
  40. Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
  41. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
  42. Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
  43. Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
  44. Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
  45. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
  46. Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 33-38 (2008).
  47. Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 51-55 (2008).
  48. Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).

Tags

Medicin Mekanisk belastning sene-afledt stamceller tendinopati bioreaktor differentiering senen stamceller
Anvendelse af en tre-dimensionel Uniaxial Mekanisk Stimulation Bioreactor System til at fremkalde tenogen differentiering af senen-afledte stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen,… More

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter