Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Application d’un système biréacticien uniaxial de stimulation mécanique tridimensionnelle pour induire la différenciation tenogène des cellules souches dérivées du tendon

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61278
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia
* These authors contributed equally

Summary

Un système biréacteur de stimulation mécanique uniaxial en trois dimensions est un bioréacteur idéal pour la différenciation ténogénique spécifique des cellules souches dérivées du tendon et de la formation de néo-tendons.

Abstract

La tendinopathie est une maladie chronique commune de tendon relative à l’inflammation et à la dégénérescence dans une zone orthopédique. Avec une morbidité élevée, une capacité d’auto-réparation limitée et, surtout, aucun traitement définitif, la tendinopathie influence encore négativement la qualité de vie des patients. Les cellules souches dérivées du tendon (TDSC), en tant que cellules précurseurs primaires des cellules du tendon, jouent un rôle essentiel dans le développement de la tendinopathie, et la restauration fonctionnelle et structurelle après tendinopathie. Ainsi, une méthode qui peut in vitro imiter la différenciation in vivo des TDSCs en cellules de tendon serait utile. Ici, le présent protocole décrit une méthode basée sur un système d’étirement uniaxial tridimensionnel (3D) pour stimuler les TDSC à se différencier en tissus semblables à des tendons. Il y a sept étapes du protocole actuel : isolement des souris TDSCs, culture et expansion des souris TDSCs, préparation du milieu de culture de stimulation pour la formation de feuille de cellules, formation de feuille cellulaire par culture dans le milieu de stimulation, préparation de la construction de cellules souches de tendon 3D, assemblage du complexe de stimulation mécanique uniaxial-étirement, et évaluation du tissu mécanique stimulé in vitro de tendon-comme. L’efficacité a été démontrée par l’histologie. L’ensemble de la procédure prend moins de 3 semaines. Pour favoriser le dépôt extracellulaire de matrice, l’acide ascorbique de 4.4 mg/mL a été employé dans le milieu de culture de stimulation. Une chambre séparée avec un moteur linéaire fournit une charge mécanique précise et est portable et facilement ajusté, qui est appliqué pour le bioréacteur. Le régime de chargement dans le protocole actuel était de 6% souche, 0,25 Hz, 8 h, suivie de 16 h de repos pendant 6 jours. Ce protocole pourrait imiter la différenciation cellulaire dans le tendon, ce qui est utile pour l’étude du processus pathologique de tendinopathie. En outre, le tissu tendon-like est potentiellement utilisé pour favoriser la guérison du tendon dans les blessures du tendon comme une greffe autologue ingénieur. En résumé, le protocole actuel est simple, économique, reproductible et valide.

Introduction

La tendinopathie est l’une des blessures sportives courantes. Il se manifeste principalement par la douleur, l’enflure locale, la tension musculaire diminuée dans la zone affectée, et le dysfonctionnement. L’incidence de la tendinopathie est élevée. La présence de tendinopathie d’Achille est plus fréquente chez les coureurs de moyenne et longue distance (jusqu’à 29 %), tandis que la présence de tendinopathie patellaire est également élevée chez les athlètes de volley-ball (45 %), de basket-ball (32 %), d’athlétisme (23 %), de handball (15 %) et de soccer(13%) 1,2,3,,4,,5. Cependant, en raison de la capacité d’auto-guérison limitée du tendon, et l’absence de traitements efficaces, tendinopathie influence encore la vie des patients négativement6,7. En outre, la pathogénie de la tendinopathie reste peu claire. Il ya eu de nombreuses enquêtes sur sa pathogénie, principalement y compris la « théorie de l’inflammation », « théorie de la dégénérescence », « théorie de la surutilisation », et ainsi de suite8. À l’heure actuelle, de nombreux chercheurs croyaient que la tendinopathie était due à l’auto-réparation ratée aux micro-blessures causées par une charge mécanique excessive le tendon éprouve9,10.

Les cellules souches dérivées du tendon (TDSC), en tant que cellules précurseurs primaires des cellules du tendon, jouent un rôle essentiel dans le développement de la tendinopathie et dans la restauration fonctionnelle et structurelle après tendinopathie11,12,13. Il a été rapporté que la stimulation mécanique de contrainte pourrait causer la prolifération et la différenciation des ostéocytes, des ostéoblastes, des cellules musculaires lisses, des fibroblastes, des cellules souches mésenchymales et d’autres cellules sensibles à la force14,15,16,17,18. Par conséquent, les TDSC, en tant que l’une des cellules mécanosensibles et multipotentes, peuvent également être stimulées à différencier par chargement mécanique19,20.

Toutefois, différents paramètres de chargement mécanique (résistance au chargement, fréquence de chargement, type de chargement et période de chargement) peuvent inciter les TDSC à se différencier en différentes cellules21. Ainsi, un régime de chargement mécanique efficace et valide est très important pour la tenogenèse. En outre, il existe différents types de bioréacteurs que les systèmes de stimulation actuellement utilisés pour fournir le chargement mécanique aux TDSC. Les principes de chaque type de bioréacteur sont différents, de sorte que les paramètres de chargement mécanique correspondant à différents bioréacteurs sont également différents. Par conséquent, un protocole de stimulation simple, économique et reproductible est en demande, y compris le type de bioréacteur, le milieu de stimulation correspondant et le régime de chargement mécanique.

Le présent article décrit une méthode basée sur un système d’étirement uniaxial tridimensionnel (3D) pour stimuler les TDSC à se différencier en tissu tendinaire. Il y a sept étapes du protocole : isolement des souris TDSCs, culture et expansion des souris TDSCs, préparation du milieu de culture de stimulation pour la formation de feuille de cellules, formation de feuille de cellules par culture dans le milieu de stimulation, préparation de la construction de cellules souches de tendon 3D, assemblage du complexe de stimulation mécanique uniaxial-étirement, et évaluation du tissu mécanique stimulé in vitro de tendon-comme. L’ensemble de la procédure prend moins de 3 semaines pour obtenir la construction de cellules 3D, ce qui est beaucoup moins que certaines méthodes existantes22,23. Le protocole actuel s’est avéré être capable d’inciter les TDSC à se différencier en tissu de tendon, et il est plus fiable que le système d’étirement bidimensionnel (2D) couramment utilisé (2D)courant 21. L’efficacité a été démontrée par l’histologie. En bref, le protocole actuel est simple, économique, reproductible et valide.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Les méthodes décrites ont été approuvées et exécutées conformément aux lignes directrices et règlements du Comité d’éthique animale de l’Université d’Australie-Occidentale.

1. Isolement des souris TDSCs

  1. Euthanasier les souris C57BL/6 de 6-8 semaines par dislocation cervicale.
  2. Moisson tendons rotuleux24 et tendons d’Achille25.
  3. Digest tendons de l’un avec 6 mL de collagènease de type I (3 mg/mL) pour 3 h.
    NOTE: Comme la taille du tendon de la souris est petite, tous les tendons récoltés à partir d’une souris doivent être utilisés dans cette étape.
  4. Recueillir les cellules et la culture dans le milieu essentiel complet (Alpha-MEM) contenant 10% du sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de la streptomycine et le mélange de pénicilline pendant 7 jours.
  5. Identifier les TDSC à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence par cytométrie de flux (expression des marqueurs de surface cellulaire, y compris CD44, CD90 et Sca-1; absence d’expression de CD34 et CD45).
  6. Cellules de passage et de congélation (les cellules de passage 4 seront utilisées pour d’autres étapes).

2. Culture et expansion des souris TDSC

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un capot de biosécurité stérile.

  1. Prenez les cellules réchauffées (souris TDSC, 1 million de cellules, passage 4, à 37 °C).
  2. Ajoutez lentement 4 à 5 mL supplémentaires de support minimal essentiel complet (Alpha-MEM).
  3. Transférer le mélange dans un tube de centrifugeuse de 15 mL à l’aide d’une pipette.
  4. Garnir d’un total moyen à 8 mL avec une pipette.
    1. Préwarm moyen dans un incubateur de four à 37 °C.
  5. Placez le tube dans la centrifugeuse et l’équilibre.
  6. Cellules de centrifugeuse et de granulé à 347 x g pendant 5 min.
  7. Sortir après la centrifugeuse et vérifier la pastille au fond.
  8. Décanter le milieu de congélation et resuspend les cellules doucement en 1-2 mL de milieu complet (éviter de faire trop de bulles).
  9. Transférer les cellules réesspendées dans une fiole T-75 par une pipette.
  10. Utilisez une pipette pour ajouter un alpha-MEM moyen complet à la fiole pour atteindre un volume total de 10 ml avec une concentration finale de 13 000 cellules/cm2.
  11. Placez la fiole dans l’incubateur et la culture à 37 °C avec 5% de CO2.
  12. Changer le milieu tous les 3 jours.
  13. Observez et surveillez les cellules au microscope lors du changement du milieu jusqu’à ce que les cellules soient cultivées à 100% confluent (environ 40 000 cellules/cm2).

3. Préparation du milieu de culture de stimulation pour la formation de feuilles cellulaires

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un capot de biosécurité stérile.

  1. Verser 15 ml de milieu Alpha-MEM complet dans un tube stérile de 15 ml.
  2. Ajouter 6 μL d’acide ascorbique (11 mg/mL) dans 15 mL de milieu pour une concentration finale de 4,4 μg/mL.
    REMARQUE : En plus d’ajouter 25 ng/mL facteur de croissance du tissu conjonctif dans le milieu de culture de stimulation peut accélérer l’ensemble du processus de croissance et de différenciation.
  3. Mélanger délicatement en inversant de haut en bas.

4. Formation de feuille de cellule par la culture dans le milieu de stimulation

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un capot de biosécurité stérile.

  1. Jetez soigneusement le milieu alpha-MEM complet normal et évitez de toucher les cellules fixées au fond de la fiole.
  2. Ajouter 10 mL de milieu de stimulation lentement et éviter de causer des perturbations aux cellules entièrement confluentes.
  3. Culture des cellules en milieu de stimulation pendant 9 jours (changer le milieu tous les 3 jours) pour générer suffisamment la feuille cellulaire à 37 °C avec 5% de CO2.
    REMARQUE : La matrice extracellulaire deviendra épaisse et présente pour être trouble lorsqu’elle est observée du fond de la fiole après avoir été stimulée par de l’acide ascorbique, ce qui signifie que la feuille cellulaire est suffisamment générée.

5. Préparation de la construction de cellules souches du tendon 3D

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un capot de biosécurité stérile.

  1. Sortez la fiole de l’incubateur.
  2. Jeter complètement le milieu de stimulation.
  3. Laver la feuille de cellule monocouche à l’une de la solution saline tampon de phosphate (PBS) en faisant tourbillonner la fiole.
  4. Jetez complètement le PBS.
  5. Utilisez une pipette pour ajouter 1 ml de trypsin de 0,25 % au coin de la fiole.
  6. Appuyez sur le coin de la fiole pour dé-attacher la feuille de cellule monocouche jusqu’à ce que le coin de la feuille de cellule soit hors du fond de la fiole.
  7. Ajoutez immédiatement 9 mL de support Alpha-MEM complet pour arrêter la trypsinisation.
  8. Continuer à tourbillonner la fiole pour décoller complètement la feuille de cellules monocouches.
  9. Verser la feuille de cellule totale dé-attachée dans une boîte de Pétri avec un milieu.
  10. Utilisez une pince à épiler stérile pour ramasser un coin de la feuille de cellule et tourner dans le sens des aiguilles d’une montre pendant 15 fois.
  11. Prenez une autre extrémité de la feuille cellulaire et tournez dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pendant 10 fois pour générer fermement une construction in vitro semblable à un tendon (Figure 1A).

6. Assemblage du complexe de stimulation mécanique uniaxial-stretching dans un bioréacteur unique conçu

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un capot de biosécurité stérile.

  1. Connectez les crochets par le raccordeur et réglez-vous à la distance souhaitée (2 cm) entre deux crochets.
  2. Enroulez doucement la construction 3D TDSC sur le crochet assemblé 3 fois sur chaque crochet (Figure 1B).
  3. Fixer les crochets avec la construction de cellules sur la chambre du bioréacteur en serrant les vis sur deux extrémités.
    REMARQUE : Toute la chambre, y compris les vis et les crochets, est stérile (autoclave pendant 1,5 h à 134 °C et les rayons ultraviolets (UV) exposent pendant 24 heures avant l’utilisation). Pour le support métallique des chambres, la lumière UV s’expose pendant 48 heures avant l’utilisation.
  4. Remplissez la chambre avec un support Alpha-MEM complet.
  5. Connectez l’actionneur à la chambre de culture par câble.
  6. Couper le raccordeur de crochets par des ciseaux stériles.
  7. Allumez la puissance et le contrôleur de canal correspondant pour commencer la stimulation mécanique.
  8. Mettez le couvercle sur la chambre.
  9. Vérifiez les feux indicateurs et assurez-vous que le bioréacteur peut fonctionner correctement.
  10. Placez le bioréacteur dans l’incubateur et soumettez la construction de cellules 3D à des étirements mécaniques pendant 6 jours (6% d’étirement, 0,25 Hz, 8 h, suivi de 16 h de repos).

7. Évaluation du tissu mécanique stimulé in vitro semblable à un tendon

  1. Desserrez les vis par un tournevis et retirez soigneusement l’assemblage.
  2. Placez le tissu tendinaire dans 4% de paraformaldéhyde pour la fixation pendant 15 min.
  3. Placez le tissu fixé en forme de tendon dans une cassette de biopsie avec des coussinets en mousse de biopsie.
  4. Procédé pour déshydrater l’échantillon et finalement évaluer par H&E coloration histologique.
  5. Répétez l’ensemble du protocole et extrayez l’ARN du tissu tendinaire pour évaluer l’expression des marqueurs tenogènes par PCR quantitatif (qPCR). Les amorces pour les gènes sélectionnés sont répertoriées dans le tableau 1.
    REMARQUE : Le protocole histologie et le protocole qPCR sont standard et après une étude précédente21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Avant la stimulation mécanique, les TDSC étaient cultivés à 100% confluent dans un milieu complet et affichaient une morphologie ultrastructurale désorganisée (figure 2A). Après 6 jours de chargement mécanique uniaxial d’étirement, la matrice extracellulaire (ECM) et les alignements cellulaires étaient bien orientés (figure 2B). Les cellules étaient bien peuplées et bien enveloppées dans ecm après chargement mécanique. La morphologie cellulaire a été présentée pour être allongée et était plus semblable à la cellule normale de tendon comparée à celle sans étirement (figure 2C). La densité cellulaire dans la construction cellulaire avec le chargement était plus élevée que dans celui sans chargement. Les résultats du QPCR ont montré que la méthode actuelle augmentait l’expression des marqueurs ténogéniques, y compris le scleraxis, le mohawk, la tenomoduline et le COL1A1 (figure 3)par rapport à ceux traités par la culture statique.

Figure 1
Figure 1 : Assemblage d’une cellule tridimensionnelle (3D) construite au-dessus des crochets du bioréacteur. (A) Vue générale de la construction de cellule 3D au-dessus des crochets. (B) Le diagramme pour assembler la cellule 3D construire sur les crochets. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Morphologie cellulaire avant et après stimulation mécanique. (A) Les cellules souches dérivées du tendon ont été cultivées à 100% confluence dans un milieu complet et ont montré une morphologie ultrastructurale désorganisée avant stimulation mécanique. (B) Images histologiques ont montré la coloration de H&E de la construction cellulaire après stimulation mécanique. (C) Images histologiques ont montré la coloration H&E d’une construction de cellule de contrôle cultivée dans le bioréacteur pendant 6 jours sans stimulation mécanique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Niveau d’expression des marqueurs de tenogenèse. Les niveaux individuels d’expression génique ont d’abord été normalisés contre le contrôle interne, 36B4, puis normalisés contre les niveaux d’expression génique des cultures statiques. Les résultats de 3 expériences sont présentés. Les séquences d’amorce utilisées pour l’analyse qPCR sont fournies dans le tableau 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Système de bioréacteur de stimulation mécanique uniaxiale tridimensionnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Gène Séquence d’amorce
Avant 5'->3' Reverse 5'->3'
COL1A1 TGACTGGAGAGCGGAGAGT GTTCGGGCTGATGTACCAGT
Scleraxis CCCAAACAGATGCGCCCTT GGCTCTCTCCGTGACTCTTCTAG
Mohawk GTCCGGCAGCCAGATTTAAG TCGCCTGAGCTTTCCCCTTTA
Tenomoduline CCGCAGAAAAGCCTATTGAA GACCACCCATTGCCTATTCTCTCTCT
36B4 CTTCCCACTTGCTGAAAAGG CGAAGAGACCGAATCCCATA

Tableau 1 : Séquences d’amorces utilisées pour l’analyse qPCR

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le tendon est un tissu conjonctif fibreux mécanosensible. Selon des recherches antérieures, l’excès de charge mécanique pourrait conduire à la différenciation ostéogénique des cellules souches du tendon, alors qu’une charge insuffisante conduirait à une structure désordonnée de fibres de collagène au cours de la différenciation destendons 21.

Un point de vue commun est que la clé d’un bioréacteur idéal est la capacité de simuler le microenvironnement cellulaire in vitro que les cellules in vivo subissent. Par conséquent, imiter l’environnement de stress normal in vivo in vitro est la clé de stimuler la différenciation à une seule lignée des TDSCs en cellules de tendon. Dans le protocole actuel, la largeur de la construction tdsc était de 2 cm, et la plage de mouvement du crochet était de 0,12 cm, ce qui signifie que la souche était de 0,12/2 (%). En conclusion, les TDSC ont été stimulés mécaniquement dans un bioréacteur pendant 6 jours (6%, 0,25 Hz, 8 h, suivis de 16 h de repos) dans le présent protocole. Après évaluation, les paramètres mécaniques de chargement utilisés dans ce protocole ont été prouvés pour induire les TDSC à générer des tissus semblables à des tendons. Il convient de noter que les paramètres du bioréacteur doivent correspondre spécifiquement au type correspondant de système d’étirement. Par exemple, les paramètres appropriés pour l’étirement des cellules monocouches sont différents de la feuille de cellule 3D actuelle s’étendant26,27. Une raison possible est les différents modes de force21. Dans le système d’étirement des monocouches 2D, les cellules se fixent au substrat de culture par adhérences focales au fond et se connectent les unes aux autres par des jonctions cellule-cellule. Cependant, dans une feuille de cellule 3D, il ya aussi beaucoup plus de connexions cellulaires-ECM formé à la suite de la niche 3D, ce qui signifie que les cellules sont sous pression en plus de l’étirement.

L’efficacité du protocole actuel a été démontrée par la morphologie et le niveau d’expression des marqueurs tenogènes. En termes de morphologie, en dehors de l’histologie, l’utilisation de la microscopie d’immunofluorescence confocale pour détecter le collagène I est un moyen commun de caractériser l’organisation du collagène et ensuite évaluer l’alignement ECM. Une étude précédente a confirmé la formation de faisceau de collagène bien alignée I dans la construction TDSC avec 6% de stimulation mécanique uniaxiale pendant 6 jours mais pas dans celui sans chargement21. Des marqueurs tenogènes ont été utilisés pour identifier les cellules du tendon, y compris Scleraxis (SCX), Mohawk (MKX), Tenomoduline (TNMD) et COL1A1. Seul le TNMD était un facteur de non-transcription, et le reste d’entre eux sont des facteurs de transcription28. Ils étaient tous bien reconnus. SCX pourrait réguler le développement du tendon au stadeembryonnaire 29, tandis que MKX pourrait réguler la différenciation des tendons et la maturation au stade postnatal30. En outre, les propriétés mécaniques (charge maximale et rigidité) du tissu tendinaire ont été évaluées dans une étude précédente ainsi, et il a montré les propriétés mécaniques de la construction TDSC avec le chargement étaient meilleures que dans celui sans chargement21.

Le milieu peut affecter la croissance et la différenciation des cellules. Dans le présent protocole, afin de former la feuille cellulaire de manière appropriée, les TDSC ont été cultivés à 100% confluence dans des flacons en plastique standard non couchés dans un milieu complet, puis les TDSC ont été stimulés pour promouvoir le dépôt ecm en ajoutant 4,4 mg/mL acide ascorbique pour 6 d. Plusieurs facteurs de croissance, y compris le facteur de croissance insulino-like I, facteur de croissance endothéliale vasculaire, facteur de croissance dérivé de plaquettes, facteur de croissance fibroblaste de base, facteur de croissance de transformation, et facteur de différenciation de croissance 5, ont joué un rôle important dans la formation des tendons et la guérison31,32,33,34. En outre, l’ajout de 25 ng/mL facteur de croissance du tissu conjonctif dans le milieu de la culture de stimulation que Ni et al. signalé pourrait accélérer l’ensemble du processus de croissance et de différenciation35.

À l’heure actuelle, la feuille de cellule 2D, également connue sous le nom de cellule monocouche, est le système le plus utilisé pour les investigations mécaniques. L’étirement biaxial fournit une tension multidirectionnelle, à la fois longitudinalement et ultérieurement, car l’étirement uniaxial ne fournit que la tension longitudinale36. Ainsi, la culture cellulaire monocouche avec l’étirement biaxial pourrait imiter l’environnement de croissance de certains types de cellules, tels que les cardiomyocytes et les cellules épidermiques. Cependant, la construction de cellules 3D est plus semblable à la forme réelle d’un tendon, et l’étirement uniaxial est plus semblable aux caractéristiques de stress des cellules de tendon, comparé à la feuille de cellule 2D et à l’étirement biaxial. Ainsi, la combinaison de la construction de cellules 3D et de l’étirement uniaxial est plus compétente pour une meilleure compréhension du tendon et de son micro-environnement mécanique. Ceci fournit une base théorique pour l’utilisation d’un système d’étirement uniaxial 3D pour stimuler la différenciation des TDSC. Ainsi, la feuille de cellule 2D a finalement été roulée dans une construction de cellule 3D et a subi un étirement uniaxial dans le protocole actuel.

Le bioréacteur utilisé dans le présent protocole se composait d’actionneur et de chambre de culture (figure 4). Les détails du bioréacteur actuel sont disponibles dans une étude précédente37. Actuellement, les actionneurs les plus communs utilisés pour le tendon inclus actionneurs pneumatiques, moteurs linéaires, et les vis de boule de moteur d’étape38,39,40. Chambres incluses chambres intégrées et séparées41,42. Parmi eux, une chambre séparée avec un moteur linéaire fourni une charge mécanique précise et était portable et facile à ajuster43.

À l’exception des TDSC, d’autres types de cellules souches pourraient être une source potentielle de cellules à utiliser dans la méthode actuelle. Des recherches antérieures ont montré que d’autres types de cellules souches pourraient avoir une capacité thérapeutique potentielle et améliorer la régénération des tendons. Comparativement aux tendons équins blessés traités par une prise en charge non cellulaire conventionnelle, le taux de ré-blessure des tendons traités par les BMSC était inférieurde 44,45. En outre, l’injection intratendineuse de BMSCs dans un modèle de tendinopathie pourrait effectivement induire la régénération de tendon46. Les cellules souches dérivées de l’adipeux pourraient traiter efficacement les tendinopathies équines menant à la récupération complète et au retour à l’activité normale chez les chevaux47. Ensemble, il y avait suffisamment de preuves pour suggérer que les cellules souches, à l’exception des TDSC, pourraient traiter la dégénérescence des tendons. Cependant, comme une note de mise en garde, la transplantation de BMSCs dans les tendons blessés a été montré pour induire la différenciation ostéogénique ectopique dans un modèle de lapin, suggérant que les cellules souches d’un tissu spécifique pourrait avoir tendance à se différencier en cellules indésirables de leur tissu d’origine48. Dans des recherches antérieures, le traitement privé de chargement aux TDSC pourrait entraîner l’ostéogenèse ainsi21, ce qui a conduit à la proposition que la méthode actuelle a le potentiel d’induire la tenogenèse d’autres cellules souches et d’éviter l’ostéogenèse avec un régime de chargement spécifique. D’autres recherches sont nécessaires pour explorer ces régimes de chargement spécifiques pour d’autres types de cellules souches. Si ce scénario se maintient, plus de source cellulaire pour traiter la tendinopathie sera disponible.

Il y a encore quelques limites à reconnaître. Tout d’abord, bien qu’un matériau non corrosif et autoclavable, l’acier inoxydable, ait été utilisé pour construire le système de bioréacteur, les conditions de culture et le milieu de culture corrodent encore la chambre, y compris la vis et le crochet. Ainsi, l’inspection de routine de la chambre et l’élimination de la rouille en temps opportun sont nécessaires. Deuxièmement, pour rendre le bioréacteur actuel économique et portable, il n’y a pas de système de contrôle de l’environnement et de circulation moyenne. Ainsi, l’opérateur doit transporter le bioréacteur et ouvrir la chambre pour un échange moyen tous les 3 jours, ce qui augmente le risque de contamination. L’opérateur doit toujours faire attention à garder l’environnement TDSCs stérile.

Pour le traitement de la tendinopathie, il est essentiel de clarifier le processus pathologique d’un point de vue non chirurgical. En termes de traitement chirurgical, une méthode efficace est d’utiliser des greffes autologues conçues. Le processus de stimulation des TDSC pour imiter la différenciation in vivo est utile pour l’étude du processus pathologique de tendinopathie. Le tissu de tendon conçu sans échafaudage a la capacité de favoriser la guérison de tendon dans un modèle de blessure de fenêtre de tendon rotulien de rat. En outre, les travaux précédents ont prouvé que la charge mécanique pouvait améliorer les propriétés mécaniques du tendon cultivé. Ainsi, ce protocole fournit une méthode reproductible pour la différenciation dirigée des TDSCs dans le tissu de tendon-comme de sorte qu’il puisse être employé simplement et de façon simple pour la culture potentielle de tendon d’ingénierie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

La recherche a été réalisée alors que l’auteur recevait « une bourse d’études internationales de l’Université d’Australie-Occidentale et un prix universitaire de troisième cycle à l’Université d’Australie-Occidentale ». Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81802214).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
  2. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
  3. Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper's knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
  4. Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper's knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
  5. van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
  6. Lopez, R. G. L., Jung, H. -G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
  7. Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), Bristol, Avon. 245-251 (2001).
  8. Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), Oxford, England. 508-521 (2006).
  9. Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
  10. Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), Oxford, England. 131-142 (2004).
  11. Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
  12. Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
  13. Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
  14. Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
  15. Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
  16. Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
  17. Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), Bristol, England. 014109 (2016).
  18. Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
  19. Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
  20. Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
  21. Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
  22. Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
  23. Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
  24. Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
  25. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
  26. Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
  27. Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
  28. Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
  29. Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), Cambridge, England. 2697-2708 (2007).
  30. Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
  31. Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
  32. Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
  33. Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
  34. Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
  35. Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
  36. Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
  37. Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
  38. Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
  39. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
  40. Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
  41. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
  42. Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
  43. Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
  44. Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
  45. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
  46. Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 33-38 (2008).
  47. Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 51-55 (2008).
  48. Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).

Tags

Médecine Numéro 162 Chargement mécanique cellules souches dérivées du tendon tendinopathie bioréacteur différenciation tendon cellules souches
Application d’un système biréacticien uniaxial de stimulation mécanique tridimensionnelle pour induire la différenciation tenogène des cellules souches dérivées du tendon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen,… More

Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter