Summary
ओइकोपलौरा डायोइका जीव विज्ञान के विभिन्न क्षेत्रों में एक ट्यूनिकेट मॉडल जीव है। हम जानवरों और शैवाल फ़ीड के लिए नमूना विधियों, प्रजातियों की पहचान, खेती सेटअप और खेती प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम उन प्रमुख कारकों को उजागर करते हैं जिन्होंने संस्कृति प्रणाली को मजबूत करने और संभावित समस्याओं और संकल्पों पर चर्चा करने में मदद की ।
Abstract
ओइकोपलुरा डायोिका असाधारण फ़िल्टर-फीडिंग क्षमता, तेजी से उत्पादन समय, संरक्षित प्रारंभिक विकास और एक कॉम्पैक्ट जीनोम के साथ एक प्लैंक्टोनिक तार है। इन कारणों से, इसे समुद्री पारिस्थितिक अध्ययन, विकासवादी विकासात्मक जीवविज्ञान और जीनोमिक्स के लिए एक उपयोगी मॉडल जीव माना जाता है। चूंकि अनुसंधान के लिए अक्सर पशु संसाधनों की स्थिर आपूर्ति की आवश्यकता होती है, इसलिए एक विश्वसनीय, कम रखरखाव संस्कृति प्रणाली स्थापित करना उपयोगी है। यहां हम एक ओ डायोनिका संस्कृति की स्थापना के लिए एक कदम-दर-कदम विधि का वर्णन करते हैं । हम संभावित नमूना साइटों, संग्रह विधियों, लक्षित पशु पहचान और संस्कृति प्रणाली के सेट-अप का चयन करने का वर्णन करते हैं। हम अपने अनुभवों के आधार पर समस्या निवारण सलाह प्रदान करते हैं । हम महत्वपूर्ण कारकों को भी उजागर करते हैं जो एक मजबूत संस्कृति प्रणाली को बनाए रखने में मदद करते हैं । हालांकि यहां प्रदान की गई संस्कृति प्रोटोकॉल ओ डायोनिकाके लिए अनुकूलित है, हमें उम्मीद है कि हमारी नमूना तकनीक और संस्कृति सेटअप अन्य नाजुक पेलाजिक अकशेरुकी को बनाए रखने के लिए नए विचारों को प्रेरित करेगा।
Introduction
विकास, आनुवंशिकी और शरीर विज्ञान से संबंधित कई जैविक प्रश्नों को संबोधित करने में मॉडल जीवों की महत्वपूर्ण भूमिका रही है । इसके अलावा , अतिरिक्त मॉडल जीव नई खोजों को सुविधाजनक बनाते हैं और इसलिए प्रकृति की अधिक समझ प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं1,2. समुद्री ज़ूप्लैंकटन जीवों के विविध समूह हैं जो महासागर पारिस्थितिकी प्रणालियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं3,4,5,6. उनकी बहुतायत और पारिस्थितिक महत्व के बावजूद, प्लैंक्टोनिक ट्यूनिशेट्स जैसे जिलेटिन जीवों को अक्सर प्लैंकटन जैव विविधता अध्ययनों में कम प्रतिनिधित्व दिया जाता है क्योंकि उनकी पारदर्शिता और कमजोरी क्षेत्र संग्रह और पहचान को चुनौतीपूर्ण बनाती है7,,8। अनुकूलित नमूना तकनीक और प्रयोगशाला संस्कृति विट्रो में जानवरों के करीब अवलोकन की अनुमति देती है, जिसने प्लैंक्टोनिक ट्यूनिकेट्स11,9,10, 11,,12के जीव विज्ञान में ज्ञान को आगे बढ़ाया है।,
लारवेकियन (परिशिष्ट) मुक्त तैराकी समुद्री ट्यूनिशेट का एक वर्ग है जिसमें दुनिया भर में लगभग 70 वर्णित प्रजातियां शामिल हैं8,,13। चूंकि वे ज़ूप्लैंकटन समुदायों के भीतर सबसे प्रचुर समूहों में से एक हैं14,15,16,,17, लार्वा बड़े प्लैंक्टोनिक जीवों जैसे मछली के लार्वा 18,19के लिए एक प्राथमिक खाद्य स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं ।19 ascidians के विपरीत-sessile ट्यूनिकेट्स-लार्वा एक टैडपोल की तरह आकृति विज्ञान बनाए रखने और उनके जीवन भर प्लैंक्टोनिक रहते हैं20। प्रत्येक जानवर एक स्वयं निर्मित, जटिल फिल्टर खिला संरचना के अंदर रहता है जिसे घर के रूप में जाना जाता है। वे अपनी पूंछ की लहरदार गति के माध्यम से जल धाराओं का निर्माण करके अपने घरों में कण जमाकरतेहैं । भरे हुए घरों को पूरे दिन छोड़ दिया जाता है, जिनमें से कुछ कार्बन समुच्चय बनाते हैं और अंततः समुद्रतल22में डूब जाते हैं; इस प्रकार, लार्वा ग्लोबल कार्बन फ्लक्स23में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं . अधिकांश प्रजातियों को पानी के कॉलम13के ऊपरी 100 मीटर के भीतर पेलाजिक क्षेत्र में रहने की सूचना दी जाती है ; हालांकि, विशाल लार्वान बाथोकॉर्डियस 300 मीटर24की गहराई में निवास करने के लिए जाना जाता है। मॉन्टेरी बे, कैलिफोर्निया में बाथोकॉर्डियस पर एक अध्ययन से पता चला है कि जानवर माइक्रोप्लास्टिक के जैविक वेक्टर के रूप में भी काम करते हैं, जो महासागरों में ऊर्ध्वाधर परिवहन और माइक्रोप्लास्टिक के वितरण में परिशिष्ट की भूमिका को समझने में संभावित महत्व का सुझाव देते हैं25।
ओइकोपलुरा डायोइका,लार्वा की एक प्रजाति, ने हाल के वर्षों में कई उल्लेखनीय विशेषताओं के कारण एक मॉडल जीव के रूप में ध्यान आकर्षित किया है। यह आमतौर पर दुनिया के महासागरों में सूचित किया जाता है । यह तटीय जल26में विशेष रूप से प्रचुर मात्रा में है, जो किनारे से आसान नमूना लेने की अनुमति देता है। 27, 28, 29प्राकृतिक और कृत्रिम समुद्री जल दोनों के साथ29दीर्घकालिक,,स्थिर खेती संभव है।, तापमान पर निर्भर पीढ़ी के समय प्रयोगशाला की स्थिति में 4-9 दिनों के रूप में कम कर रहे हैं । इसमें प्रत्येक मादा के साथ उच्च मलचुने की मात्रा है जो पूरे वर्ष में और 300 अंडे का उत्पादन करने में सक्षम है। एक ट्यूनिकेट के रूप में, यह तार विकास30, 31,31को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण फिलोजेनेटिक स्थिति में है। 70 एमबी में, ओ डायोनिका में सभी तारों के बीच सबसे छोटा पहचाना गया जीनोमहै 32। लार्वा के बीच, ओ डायोइका एकमात्र वर्णित गैर-हर्मेफ्रोडिटिक प्रजातियां हैं जो अब तक33हैं।
प्रयोगशाला उगाए गए माइक्रोल्गा के साथ पहली सफल ओ डायोनिका संस्कृति की सूचना पफेनहोफर34द्वारा दी गई थी । सिंक्रोनस मोटर्स और पैडल का उपयोग करके मूल संस्कृति प्रोटोकॉल फेनॉक्स और गोर्स्की35 द्वारा विकसित किया गया था और बाद में कई प्रयोगशालाओं द्वारा अपनाया गया था। हाल ही में, फुजी एट अल36 ने कृत्रिम समुद्री जल में ओ डायोनिका कल्चर की सूचना दी, एक मजबूत संस्कृति प्रणाली और क्षेत्र संग्रह को गुलदस्ता एट अल द्वारा वर्णित किया गया था।27 और एक सरलीकृत, सस्ती प्रणाली के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल मार्टी-सोलंस एट अलद्वारासूचित किया गया था। पारंपरिक Oikopleura संस्कृति प्रणाली के अलावा, एक डबल ट्यूब पालन टैंक के साथ एक नए डिजाइन की रिपोर्ट भी संस्कृति Oikopleura सपा की क्षमता है । 37.
हम सार्स इंटरनेशनल सेंटर फॉर मरीन मॉलिक्यूलर बायोलॉजी27,यूनिवर्सिटी ऑफ बार्सिलोना29,ओसाका विश्वविद्यालय28,और हमारी अपनी टिप्पणियों में प्रमुख ओइकोपलुरा अनुसंधान समूहों द्वारा विकसित प्रोटोकॉल के संयोजन के आधार पर ओ डायोनिका मोनोकल्चर शुरू करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। पहले प्रकाशित संस्कृति प्रोटोकॉल में, शैवाल मीडिया, किनारे नमूना तकनीकों, और ओइकोपलुरा पहचान की संरचना के बारे में विस्तृत जानकारी केवल मोटे तौर पर वर्णित की गई थी, जिससे बहुत सारी अस्पष्टता छोड़ दी गई थी। यहां, वीडियो प्रोटोकॉल में दृश्य जानकारी की सहायता से, हमने एक सरल, कदम-दर-कदम तरीके से जमीन से ओ डायोनिका संस्कृति स्थापित करने के लिए आवश्यक सभी महत्वपूर्ण जानकारी को इकट्ठा किया है। हम वर्णन करते हैं कि ओ डायोिका को एक और आमतौर पर रिपोर्ट की गई प्रजातियों, ओ लोंगिकाडासे कैसे अलग किया जाए, जो सबसे चुनौतीपूर्ण चरणों में से एक है। हालांकि मौजूदा संस्कृति प्रणाली दुनिया भर में ओ डायोनिका की खेती के लिए लागू हैं, हम स्थानीय पर्यावरण की स्थिति के आधार पर प्रोटोकॉल समायोजन के महत्व पर प्रकाश डाला । प्रस्तुत जानकारी व्यापक रूप से प्रकाशित डेटा के साथ ही अनुभव के माध्यम से प्राप्त ज्ञान को जोड़ती है । वर्तमान प्रोटोकॉल आदर्श रूप से खरोंच से एक संस्कृति स्थापित करने में रुचि शोधकर्ताओं के लिए अनुकूल है ।
Protocol
1. ओ डायोनिका संस्कृति सुविधा
- वाटर फिल्टर सिस्टम(चित्र 1)
- 2-3 मीटर गहराई पर एक बंदरगाह से प्राकृतिक समुद्री जल ले लीजिए। एक रेत फिल्टर (ताकना आकार 1.4 मिमी) के माध्यम से समुद्री जल पास और प्रयोगशाला में एक साझा जलाशय टैंक के लिए परिवहन। साझा जलाशय टैंक में पानी की गुणवत्ता बनाए रखने के लिए पानी को प्रसारित करने के लिए कनस्तर फिल्टर का उपयोग करें।
- एक संस्कृति कक्ष में, एक बहु-चरण फ़िल्टर सिस्टम स्थापित करें जिसमें एक चुंबकीय ड्राइव पंप, 5 माइक्रोन और 1 माइक्रोन पॉलीप्रोपाइलीन घाव कारतूस फिल्टर, और एक यूवी स्टरलाइजर (100 वी)(चित्रा 1)के साथ 100 एल जलाशय टैंक शामिल है।
- साझा जलाशय टैंक से समुद्री जल को संस्कृति कक्ष जलाशय टैंक में स्थानांतरित करें। संस्कृति कक्ष जलाशय टैंक में प्रवेश करने से पहले एक 25 माइक्रोन फिल्टर इकाई(चित्रा 1ए, बी)के माध्यम से समुद्री जल पास करें । जानवरों के विकास में संभावित रूप से बाधा डालने वाले कणों को अच्छी तरह से हटाने के लिए रात भर 5 और 1 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समुद्री जल को प्रसारित करें।
नोट: बड़े जाल आकार (25-50 माइक्रोन) के साथ एक अतिरिक्त फिल्टर छोटे जाल आकार के साथ कारतूस फिल्टर को बंद करने से बड़े कणों को रोकने के लिए उपयोगी है। फ़िल्टर किया गया समुद्री जल (एफएसडब्ल्यू) अगले सुबह उपयोग के लिए तैयार है।
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ओइकोपलुरा संस्कृति इकाई(चित्रा 2)
- 5 या 10 एल दौर, पारदर्शी प्लास्टिक बीकर्स में जानवरों को बनाए रखें।
- एक स्थिर, दो स्तर स्टेनलेस स्टील ठंडे बस्ते में डालने इकाई (एल एक्स डब्ल्यू एक्स एच = 150 सेमी x 45 सेमी x 90 सेमी) पर संस्कृति बीकर्स एक 5 मिमी मोटी, पारदर्शी एक्रेलिक सतह बोर्ड के साथ रखें।
- बीकर्स के नीचे से जानवरों को रोशन करने के लिए एक्रेलिक सतह के नीचे सफेद फ्लोरोसेंट रोशनी की स्थिति।
- बीकर्स के पीछे एक काला प्लास्टिक शीट रखें। काली चादर इसके विपरीत बनाता है और पारदर्शी जानवरों के दृश्य को बढ़ाता है।
- सिंक्रोनस इलेक्ट्रिक मोटर्स को एक्रेलिक पैडल (एल एक्स एच = 8 सेमी x 27 सेमी)(पूरक फ़ाइल 2) सेकनेक्ट करें। ठंडे बस्ते में डालने इकाई(चित्रा 2A)की लंबाई के साथ चल रहे समानांतर पटरियों से संस्कृति बीकर्स में पैडल निलंबित करें ।
- 15 आरपीएम पर बीकर्स में एक सौम्य परिपत्र गति उत्पन्न करने के लिए मोटर्स पर स्विच करें।
नोट: उनके सेल्यूलोज घरों में पशु तटस्थ रूप से प्रसन्नचित्त हैं; हालांकि, जल परिसंचरण अंडे, लार्वा और शैवाल भोजन को निलंबित करने और संस्कृति बीकर्स में समान रूप से वितरित करने में मदद करता है।
- स्वचालित डोजिंग पंप (वैकल्पिक)
नोट: एक स्वचालित फीडिंग यूनिट स्टाफिंग आवश्यकताओं को कम करती है, विशेष रूप से सप्ताहांत के दौरान।- निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्वचालित डोजिंग पंप से तरल वितरण की मात्रा को कैलिब्रेट करें।
- शैवाल जलाशयों के रूप में 50 एमएल ट्यूब का उपयोग करें।
- एयरलाइन ट्यूबिंग के माध्यम से पारित करने के लिए 50 एमएल ट्यूब की टोपियां पर दो 5 मिमी छेद ड्रिल करें। हवा के बुलबुले पेश करने के लिए एक ट्यूब को एक मानक मछलीघर हवा पंप से कनेक्ट करें, और दूसरी ट्यूब को डोजिंग पंप(चित्रा 2B)के इनलेट पोर्ट से जोड़ा जाए।
नोट: हवा के बुलबुले की एक पतली धारा का परिचय ट्यूबों के नीचे बसने से शैवाल को रोकने में मदद करता है । - किसी दिए गए दिन पर तिरस्कृत किए जाने वाले शैवाल फ़ीड का समय और मात्रा कार्यक्रम करें।
- शैवाल स्टेशन
- शैवाल कार्य संस्कृतियों वाले चार 1 एल राउंड बॉटम बॉटम फ्लास्क (चरण 2.1 देखें) रखने के लिए एक ठंडे बस्ते में डालने वाली इकाई (एल एक्स डब्ल्यू एक्स एच = 90 सेमी x 46 सेमी x 115 सेमी) का उपयोग करें।
- फ्लास्क के पीछे फ्लोरोसेंट लाइट्स रखकर कामकाजी संस्कृतियों को बैक-वेल करें।
- दो छेद रबर डाट के साथ सील फ्लैक्स।
- रबर डाट के माध्यम से एक 1 एमएल डिस्पोजेबल पिपेट पास करें। पिपेट को एक मछलीघर एयर पंप से जोड़ने के लिए एयरलाइन ट्यूबिंग का उपयोग करें। फ्लास्क में हवा के बुलबुले की एक धारा का परिचय दें।
2. माइक्रोगल फूड
- शैवाल संस्कृतियों की शुरुआत
नोट: तीन माइक्रोएलगल प्रजातियों के लिए संस्कृतियों (स्टॉक, उप-और कामकाजी संस्कृतियों) के तीन सेट बनाए रखें, चैटोसेरोस कैल्शियमट्रांस, आइसोक्रिसिस एसपी, राइनोमोनास रेटिकुलाटा,और साइनोबैक्टीरिया की एक प्रजाति, सिनेकोकोकस एसपी.. स्टॉक और उप-संस्कृतियों का उपयोग बैक-अप के रूप में किया जाता है। कार्यसंस्कृतता का उपयोग दैनिक भोजन के लिए किया जाता है।- माइक्रोल्गा और साइनोबैक्टीरिया(टेबल 1)की खेती के लिए आवश्यक अभिकर् ता तैयार करें।
- स्टॉक कल्चर शुरू करने के लिए, ऑटोक्लेव (121 डिग्री सेल्सियस, 25 मिनट) 60 - 80 एमएल एफएसडब्ल्यू में 100 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में। संशोधित कॉनवे माध्यम 27 और माइक्रोअल्गा(तालिका2) की निर्दिष्ट राशि को उपयुक्त रूप से टीका लगाते हैं। उदाहरण के लिए, सी कैल्सिट्रांस की स्टॉक संस्कृति को टीका लगाने के लिए, समुद्री जल के 60 एमएल को ऑटोक्लेव करें, विटामिन और समाधान ए में से प्रत्येक को 30 माइक्रोन टीका, सोडियम सिलिकेट के 15 माइक्रोन, स्ट्रेप्टोमाइसिन के 60 माइक्रोन और पिछले स्टॉक संस्कृति से सी कैल्साइट्रान के 30 माइक्रोन।
नोट: आर रेटिकुलाटा लाल-गुलाबी से ओरेंजिश-ब्राउन में बदल जाता है जब बहुत अधिक प्रकाश के संपर्क में आता है। उन्हें प्रकाश से दूर ले जाएं एक बार वे स्पष्ट से हल्के गुलाबी करने के लिए बारी शुरू कर दिया है । - सतत प्रकाश व्यवस्था के साथ 17 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक इनक्यूबेटर में स्टॉक कल्चर बनाए रखें। लगभग 10 दिनों के बाद, संस्कृति शैवाल विकास(चित्रा 3)को इंगित करने के लिए रंग बदलती है। एक बार रंग दिखाई देने के बाद, उन्हें 1 महीने तक दीर्घकालिक भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ले जाएं।
- एक साफ बेंच पर, उपयुक्त रूप से स्टॉक संस्कृति(तालिका 2)से एक उप-संस्कृति टीका लगाते हैं। निरंतर प्रकाश व्यवस्था के साथ 17 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। शैवाल रंग दिखाई देने के बाद, उन्हें 2 सप्ताह तक इनक्यूबेटर में स्टोर करना जारी रखें।
- उप-संस्कृति (तालिका 2) से कार्य संस्कृति का टीका1000 0000 ों000 फ्लास्क को रबर कैप से सील करें और 1 एमएल डिस्पोजेबल पिपेट डालें। फ्लास्क को शैवाल स्टेशन पर ले जाएं और 8 घंटे के फोटोपीरियोड के साथ कमरे के तापमान पर बनाए रखें। लगातार वातारण के साथ आपूर्ति। हर 4 दिन में वर्किंग कल्चर को रिन्यू करें।
- स्टॉक और उप संस्कृतियों को दिन में दो बार घूमता हुआ हिलाएं।
नोट: ठोस मीडिया और क्रायोप्रिजर्वेशन पर शैवाल संस्कृति का दीर्घकालिक भंडारण क्रमशः3महीने और 1 वर्ष तक संभव है ।
- शैवाल विकास घटता बनाना (वैकल्पिक)
नोट: ओ डायोनिकाकी स्थिर संस्कृति को बनाए रखने के लिए भोजन की मात्रा का सटीक आकलन महत्वपूर्ण है । हमने दो प्राथमिक शैवाल खाद्य प्रजातियों, चैटोसेरोस कैल्सिट्रांस और आइसोक्रिसिस एसपी के लिए विकास घटता बनाया।- सी कैल्सिट्रांस और आइसोक्रिसिस एसपी वर्किंग कल्चर्स(टेबल 2)तैयार करें ।
- कार्य संस्कृति की प्रत्येक प्रजाति के लिए, तीन अलग-अलग बार नमूना और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 660 एनएम पर अवशोषित को मापें। प्रत्येक कार्य संस्कृति से ट्रिपलआईटी के औसत माप लें।
- एक स्वचालित सेल काउंटर के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, गिनती के लिए शैवाल नमूने तैयार करें। प्रत्येक नमूने को तीन बार गिनें। प्रत्येक नमूने में मौजूद कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए तीन मामलों का औसत लें।
- लगभग 50 औसत माप दर्ज होने तक दैनिक गणना जारी रखें।
- शैवाल प्रजातियों(चित्रा 4)दोनों के लिए विकास घटता बनाएं।
3. जंगली ओइकोपलुरा स्पीप का फील्ड संग्रह।
- संशोधित प्लैंकटन नेट(चित्रा 5)
नोट: Oikopleura spp के सफल नमूने की कुंजी है । एक भारित, गैर फ़िल्टरिंग कॉड-एंड के साथ एक प्लवक नेट की धीमी रस्सा है । चित्रा 5 एक संशोधित प्लैंकटन नेट का एक योजनाबद्ध आरेख दिखाता है।- एक हाथ से आयोजित प्लैंकटन नेट के कॉड-एंड को संशोधित 500 एमएल स्क्रू-टॉप वॉश बोतल के साथ बदलें।
- पानी और जानवरों को कॉड-एंड में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए वॉश बोतल के 4 सेमी व्यास स्क्रू-टॉप में 3 सेमी व्यास के छेद को ड्रिल करें।
- प्लैंकटन नेट के अंत में बोतल टोपी फिट करें। इसे इलेक्ट्रिक टेप से कसकर लपेटें। एक स्टेनलेस स्टील नली क्लैंप के साथ आगे टोपी सुरक्षित।
- ज़िप संबंधों के साथ संशोधित कॉड-एंड के बाहर 70 ग्राम वजन संलग्न करें।
- सीओडी-एंड को और सुरक्षित करने के लिए सुरक्षा पट्टा संलग्न करें।
- संग्रह स्थलों का चयन(चित्र 6)
नोट: सभी नमूना संग्रह OIST फील्डवर्क सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । ओइकोपलुरा स्प्प की उपस्थिति में मौसमी भिन्नता हो सकती है। स्थान(चित्र 6)के आधार पर। गंभीर आंधी जैसे चरम मौसम की घटनाओं के तुरंत बाद नमूना लेने से बचें।- संभावित नमूना साइटों की पहचान करने के लिए मानचित्र वेबसाइट पर उपग्रह दृश्य का उपयोग करें। हम बंदरगाहों और मछली पकड़ने के पियर्स पर ध्यान केंद्रित है कि कार से आसानी से सुलभ है और खण्ड के अंदर स्थित है या महासागर ड्रॉप नापसंद के पास जहां प्लवक जमा करते हैं: परिजन खाड़ी, ओकिनावा, जापान में इशिकावा बंदरगाह (जीपीएस: 26 ° 25'39.3"N 127 ° 49'56.6"E) ।
- प्रत्येक साइट की किनारे पहुंच और सुरक्षा का आकलन करने के लिए संभावित नमूना स्थानों पर जाएं। जरूरत के अनुसार स्थानीय प्राधिकरणों से संग्रह परमिट प्राप्त करें।
- नमूना प्रक्रिया
- प्लैंकटन नेट को समुद्र में डालें और कॉड-एंड को पानी की सतह से 1-2 मीटर नीचे डूबने दें।
- 50-100 सेमी एस-1पर हाथ से क्षैतिज रूप से नेट टो करें। 2-5 मिनट तक आगे-पीछे चलकर रस्सा जारी रखें। बंदरगाह में फाइटोप्लैंकटन की बहुतायत के अनुसार रस्सा समय समायोजित करें, कम टो के साथ जब अधिक फाइटोप्लैंकटन होते हैं।
नोट: लार्वा नाजुक जानवर हैं। नेट की तेजी से रस्सा या बार-बार कास्टिंग कॉड-एंड में फंसे जानवरों को नुकसान पहुंचा सकती है । - धीरे-धीरे नेट उठाएं। धीरे-धीरे कॉड-एंड की सामग्री को 500 एमएल गोल ग्लास बोतल में स्थानांतरित करें। पूरी तरह से हवा बुलबुले से बचने के लिए समुद्री जल के साथ नमूना बोतल भरें।
नोट: ओइकोपलुरा स्पीप की उपस्थिति की पुष्टि काले रंग की पृष्ठभूमि के खिलाफ नमूना बोतलों को देखकर की जा सकती है। ज्यादातर जानवर एकत्र होते समय अपने घरों को छोड़ देते हैं। इसलिए, प्रजातियों के स्तर की पहचान के लिए सूक्ष्म अवलोकन की आवश्यकता है। - तीन 500 एमएल बोतलें एकत्र होने तक नमूना दोहराएं।
- शारीरिक मापदंडों की सीमा को रिकॉर्ड करने के लिए सीटीडी प्रोफाइलर का उपयोग करके लवणता, तापमान और क्लोरोफिल को मापें जहां जानवर स्वाभाविक रूप से मौजूद हैं।
- प्रयोगशाला सेटिंग में जानवरों को अनुकूलित करने के लिए एक बाल्टी में सतह समुद्री जल के 10-15 एल ले लीजिए।
4. पशु अलगाव और पहचान(चित्रा 7, चित्रा 8)
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ओइकोपलुरा स्पीप।
नोट: अन्य प्लैंक्टोनिक जीव जो ओइकोपलुरा स्पीप के समान हो सकते हैं। पहली नज़र में चैटोगनाथ, फ्रिटिलारिया स्प,, नेमाटोड, जर्दी-सैक्स के साथ मछली लार्वा, और सिओना स्प लार्वा शामिल हैं।- प्रयोगशाला की स्थिति के लिए जानवरों को अनुकूलित करने के लिए, प्रत्येक 500 एमएल नमूने को 10 एल बीकर में स्थानांतरित करें जिसमें नमूना स्थान से सतह समुद्री जल का 1:1 अनुपात होता है और प्रयोगशाला में बनाए गए समुद्री जल (एफएसडब्ल्यू) को फ़िल्टर किया जाता है(चित्रा 7ए, बी)। प्लैंकटन नमूने की एकाग्रता के आधार पर बीकर की मात्रा को 5-10 एल तक समायोजित करें।
नोट: यदि प्लवक नमूने में अवांछित मलबे होते हैं, तो 10 एल बीकर को स्थानांतरित करने से पहले एक मोटे फिल्टर (जाल आकार ~ 600 माइक्रोन) के माध्यम से चलाएं। - एक सिंक्रोनस इलेक्ट्रिक मोटर (15 आरपीएम) से जुड़े पैडल का उपयोग करें और प्लैंकटन को रात भर निलंबन में रखें (चरण 1.2.5)।
- ओइकोपलुरा एसपीपी की पहचान करें। 1-2 मिमी लंबे, टैडपोल के आकार के जानवरों को गोलाकार, पारदर्शी घर के अंदर अपनी पूंछ को लहरदार बनाकर। कुछ जानवरों को घरों के बिना अस्थायी रूप से मुक्त तैराकी हो सकती है। धीरे-धीरे एक कुंद अंत पिपेट का उपयोग करके एक खाली पेट्री डिश में ~ 5 जानवरों को स्थानांतरित करें।
- जीनस पहचान के लिए, जानवरों को उनके घरों से धीरे-धीरे स्थानांतरण पिपेट के साथ घर को पोक करके बेदखल करें।
- 20-40x डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोप के तहत हाउसलेस जानवरों का निरीक्षण करें और ओइकोपलुरा स्प्प(चित्रा 8)की पुष्टि करें।
- प्रयोगशाला की स्थिति के लिए जानवरों को अनुकूलित करने के लिए, प्रत्येक 500 एमएल नमूने को 10 एल बीकर में स्थानांतरित करें जिसमें नमूना स्थान से सतह समुद्री जल का 1:1 अनुपात होता है और प्रयोगशाला में बनाए गए समुद्री जल (एफएसडब्ल्यू) को फ़िल्टर किया जाता है(चित्रा 7ए, बी)। प्लैंकटन नमूने की एकाग्रता के आधार पर बीकर की मात्रा को 5-10 एल तक समायोजित करें।
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ओ डायोनिका पहचान
नोट: ओ डायोनिका को पूरी तरह से परिपक्व पुरुषों और महिलाओं या उनकी पूंछ के डिस्टल हाफ पर स्थित दो बड़े उपकॉर्डियल कोशिकाओं की उपस्थिति से नेत्रहीन रूप से पहचाना जा सकताहै। दो उपकोणीय कोशिकाओं के बीच की दूरी व्यक्तियों के बीच भिन्न हो सकती है।- इसके बाद, जांच करें कि क्या अंडे(चित्रा 8A)या शुक्राणु (चित्रा8B)से भरे गोनाड के साथ एक पूरी तरह से परिपक्व ओइकोपलुरा है। यदि जानवर केवल अंडे या शुक्राणु के पास है, तो 4.2.3 कदम पर छोड़ दें क्योंकि यह ओ डायोनिकाहै, जो एकमात्र वर्णित गैर-हर्मेफ्रोडिटिक प्रजाति है।
- यदि जानवर अपरिपक्व(चित्रा 8 सी)है, तो अपनी पूंछ(चित्रा 8 डी)के अंत में दो उप-ordal कोशिकाओं की तलाश करें।
- एक बार प्रजातियों की पुष्टि हो जाने के बाद, इसे एक नई पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। दोहराएं कदम 4.1.3-4.2.2 जब तक 10-20 व्यक्तियों प्रजातियों के स्तर पर पुष्टि कर रहे हैं ।
नोट: आसान पहचान के लिए, एफएसडब्ल्यू में 0.015% ट्राइकेन मीथेनसुलफोनेट (MS222) वाले पेट्री डिश में जानवरों को एनेस्थेटाइज करें। - यदि कोई ओ डायोनिका नहीं पाया जाता है, तो बीकर्स को एक या दो दिन के लिए निलंबित रखें। अपरिपक्व ओ डायोनिका हो सकता है जो बढ़ता रहेगा और पता लगाना आसान हो जाएगा। यदि कोई भी सप्ताह के बाद दिखाई नहीं देता है, तो नमूना त्याग दें, और फिर से नमूना लेने का प्रयास करें।
5. ओ डायोनिका के लिए खेती प्रोटोकॉल
- एक क्षेत्र एकत्र नमूना से एक ओ डायोनिका मोनोकल्चर की शुरुआत(चित्र 7)
नोट: शैवाल भोजन काम संस्कृतियों से दैनिक तैयार किया जाता है और प्रत्येक मोनोकल्चर बीकर को दिन में तीन बार 9 बजे, 12 बजे और शाम 5 बजे क्रमशः खिलाया जाता है (चरण ५.२ देखें) । जानवरों को 23 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है। इन परिस्थितियों में, ओकिनावा ओ डायोनिका जीवनचक्र 4 दिन(चित्रा 7C)है।- ओ डायोनिकाकी मोनोकल्चर शुरू करने के लिए, 120 जानवरों को अलग करें और एक नई बीकर में स्थानांतरित करें जिसमें 5 एल ताजा एफएसडब्ल्यू(चित्रा 7बी, सी)होता है।
- अगले सुबह, पीले गोनाड और अंडे के साथ महिलाओं के साथ पूरी तरह से परिपक्व पुरुषों की तलाश करें जो सुनहरे क्षेत्रों(चित्रा 8ए, बी)के रूप में दिखाई देते हैं।
- धीरे-धीरे 15 पुरुषों और 30 महिलाओं को एक नई बीकर में स्थानांतरित करके एक स्पॉनिंग बीकर बनाएं जिसमें 5 एमएल कुंद-अंत पिपेट के साथ 2.5 एल ताजा एफएसडब्ल्यू होता है।
नोट: यदि पर्याप्त पुरुष और महिलाएं नहीं हैं, तो एफएसडब्ल्यू के 1 एल वाले बीकर के लिए यथासंभव अधिक से अधिक वयस्कों को स्थानांतरित करें और उन्हें स्वाभाविक रूप से अंडे दें। मैनुअल हस्तांतरण के दौरान जानवरों के लिए शारीरिक तनाव को कम करने के लिए, उन्हें धीरे-धीरे पानी की सतह के नीचे छोड़ा जाना चाहिए। - जानवरों को स्वाभाविक रूप से अगली पीढ़ी को शुरू करने के लिए अंडे दें। पूंछ लार्वा निषेचन के लगभग 3 घंटे बाद दिखाई देना चाहिए।
नोट: स्पॉन पूरी तरह से परिपक्व जानवरों द्वारा अपने घरों को छोड़ने, सतह के पानी की ओर तैरने और उनके गेम्स को छोड़ने के द्वारा किया जाता है। सफल निषेचन स्पॉन बीकर के नीचे से समुद्री जल के 5-10 एमएल निकालने और एक माइक्रोस्कोप के नीचे दरार के साथ अंडे की पहचान करके पुष्टि की जा सकती है । - पहली सुबह के बाद स्पॉन (दिन 1) पर, फुलाया घरों के साथ जानवरों की एक नई पीढ़ी बीकर में दिखाई देना चाहिए । एक 500 एमएल हाथ से आयोजित बीकर का उपयोग करें धीरे एक नई ताजा fSW के 7.5 एल युक्त बीकर में स्पॉन बीकर की सामग्री हस्तांतरण (10 एल की कुल बनाने). छिड़काव गति से बचने के लिए कोण पर डालो।
- दूसरी सुबह (2 दिन) पर, मैन्युअल रूप से 150 जानवरों को एक नई बीकर में स्थानांतरित करें जिसमें 5 एल ताजा एफएसडब्ल्यू होता है।
- तीसरी सुबह (3 दिन) पर, मैन्युअल रूप से 120 जानवरों को ताजा एफएसडब्ल्यू के 5 एल के साथ एक नई बीकर में स्थानांतरित करें।
नोट: जानवरों के विकास को सिंक्रोनाइज़ करने के लिए, 2 और 3 दिन मैनुअल हस्तांतरण के दौरान समान आकार वाले व्यक्तियों का चयन करना महत्वपूर्ण है। एक ही ट्रांसफर में अधिकतम 10 जानवरों को साइफन किया जा सकता है। - चौथी सुबह (4 दिन) पर, पूरी तरह से परिपक्व जानवर दिखाई देने चाहिए। जीवनचक्र को बंद करने के लिए चरण 5.1.3 दोहराएं।
नोट: एक स्वचालित खिला पंप के लिए सप्ताहांत पर 5 बजे जानवरों को खिलाने के लिए खेती कर्मचारियों की उपस्थिति के बिना सेट किया जा सकता है ।
- कार्य संस्कृति से शैवाल भोजन की दैनिक तैयारी
- 660 एनएम पर कार्य संस्कृति के अवशोषण को मापें।
- डेली फीडिंग चार्ट के आधार पर, पता लगाएं कि विशिष्ट आकार(तालिका 3)के जानवरों के लिए कितनी शैवाल कोशिकाओं को खिलाने की आवश्यकता है।
- शैवाल विकास घटता(चित्रा 4)का उपयोग करके, किसी दिए गए दिन पर आवश्यक शैवाल भोजन (एमएल) की मात्रा की गणना करने के लिए नीचे दिए गए समीकरणों को हल करें।
- एक विशिष्ट दिन और खिलाने के समय के लिए आवश्यक एक विशेष शैवाल की मात्रा की गणना करने के लिए, निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करें:
जहां वाईए किसी दिए गए दिन पर शैवाल एकाग्रता है और ए प्रति फीडिंग की आवश्यकता शैवाल की मात्रा है। इसके अलावा, वाई ए से एक्सके बीच रैखिक संबंध , अवरोधन के लिए मूल्य(ग)और ढलान(एम) चित्र 4में दिखाए गए हैं। कश्मीर मूल्यों के लिए तालिका 3 को देखें। - उदाहरण के लिए, 5 एल संस्कृति में बनाए गए दिन 3 जानवरों के 9 AM फीडिंग में आवश्यक आइसोक्रिसिस एसपी की मात्रा की गणना करने के लिए और 0.234 (660 एनएम पर मापा गया) के शैवाल अवशोषण के साथ, निम्नलिखित गणना की गई:
नोट: इन समीकरणों को स्प्रेडशीट में स्टोर करें ताकि दैनिक भोजन राशि स्वचालित रूप से अवशोषण मापन, जानवरों के आकार और संस्कृति समुद्री जल की मात्रा(पूरक फ़ाइल 1)के आधार पर गणना की जाती है।
- एक विशिष्ट दिन और खिलाने के समय के लिए आवश्यक एक विशेष शैवाल की मात्रा की गणना करने के लिए, निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करें:
- शैवाल की गणना की मात्रा को 50 एमएल ट्यूब, सेंट्रलाइज को 5000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
- सुपरनिट निकालें। पुराने शैवाल मीडिया की जगह, ताजा एफएसडब्ल्यू के साथ मूल मात्रा तक ट्यूबों को वापस भरें।
- अगले फ़ीड के लिए उपयोग करने के लिए तैयार होने तक फ्रिज में तैयार भोजन स्टोर करें। अगली सुबह नया भोजन तैयार होने के बाद पुराने शैवाल भोजन को त्याग दें।
- सक्रिय चारकोल (वैकल्पिक)
नोट: पानी की गुणवत्ता बनाए रखने के लिए प्रत्येक संस्कृति बीकर में सक्रिय चारकोल के 10 ग्राम जोड़े जाते हैं। चारकोल का चार बार तक दोबारा इस् तेमाल किया जा सकता है। चारकोल बैग धीरे से खोलें संस्कृति बीकर्स में प्रवेश करने से चारकोल धूल से बचने के लिए।- एक कंटेनर में सक्रिय चारकोल के ~ 700 ग्राम स्थानांतरण। 48 घंटे के लिए ताजे पानी (एफडब्ल्यू) में भिगोएं और उन्हें नीचे बसने की अनुमति दें।
- अवशिष्ट चारकोल धूल को हटाने के लिए FW के साथ कुल्ला।
- 15-20 मिनट के लिए FW में चारकोल उबालें । गर्मी से निकालें और ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं ।
- कुल्ला जब तक सबसे लकड़ी का कोयला धूल हटा दिया जाता है, और पानी स्पष्ट हो जाता है ।
- एफएसडब्ल्यू युक्त 2 एल बीकर में साफ चारकोल स्टोर करें। धूल को प्रवेश करने से रोकने के लिए बीकर को कवर करें।
- जानवरों को स्थानांतरित करने से पहले प्रत्येक नए बीकर में चारकोल जोड़ें।
Representative Results
ओइकोपलुरा को नाव से या बंदरगाह से एक गैर-फ़िल्टरिंग कॉड-एंड(चित्रा 5)के साथ 100 माइक्रोन मेश प्लैंकटन नेट की धीमी, कोमल रस्सा द्वारा एकत्र किया जा सकता है। जानवरों की नाजुक प्रकृति के कारण, किसी भी आंदोलन से बचना महत्वपूर्ण है जो शारीरिक तनाव पैदा कर सकता है, जैसे कि नेट की किसी न किसी हैंडलिंग या नमूना जार में फंसी हुई हवा की जेब के कारण छिड़काव।
स्थानीय ओइकोपलुरा आबादी के मौसमी पैटर्न के साथ-साथ एक नमूना स्थल पर पानी की भौतिक विशेषताओं में साथ में उतार-चढ़ाव को समझना महत्वपूर्ण है। 2015 और 2019 के बीच नमूना लेने से इशिकावा में ओ डायोनिका की उपस्थिति में लगातार मौसमी भिन्नता का पता चला और ओकिनावा(चित्रा 6)में किन बंदरगाहों। सतह समुद्री जल का तापमान एक प्रमुख कारक प्रतीत होता है । ओ डायोनिका प्रमुख प्रजाति थी जब सतह समुद्री जल 28 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया था, और ओ लोंगिकाडा 24 डिग्री सेल्सियस और 27 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान पर ओ डायोनिका के साथ मौजूद था; हालांकि, ओ लोंगिकाडा 23 डिग्री सेल्सियस(चित्र 6A) से नीचेका प्रभुत्व है। लगातार कई दिनों की भारी बारिश के बाद लवणता में क्रमिक परिवर्तन ओ डायोनिका (चित्रा 6B)की बहुतायत के साथ सहसंबंधित नहीं था ।
ऊपर वर्णित नमूना प्रक्रियाओं का उपयोग करना, सबसे ओ डायोनिका हम बरामद उनके 4 दिन के जीवन चक्र(चित्रा 7C)के 2 और 3 दिन के बीच थे । परिपक्व पुरुषों को गोनाड के पीले रंग से पहचाना गया था जबकि मादा गोंड़ ने अंडे से सोने को झिलमिलाया जो व्यास में 70-80 माइक्रोन थे(चित्रा 8ए, बी)। अपरिपक्व ओ डायोनिका की पुष्टि उनकी पूंछ(चित्रा 8 डी)पर दो उप-ओएसिडल कोशिकाओं द्वारा की गई थी। स्थानीय जल में एक और प्रमुख प्रजाति, ओ लोंगिकाडा,आकार और आकृति विज्ञान में समान थी। हमने ओ लोंगिकाडा से ओ लोंगिकाडा को अलग करने के लिए निम्नलिखित मानदंडों का उपयोग किया38,,39,,40:पूंछ में उपकॉर्डल कोशिकाओं की कमी, ट्रंक में वेलम की उपस्थिति, और हर्मेफ्रोडिट गोनाड(चित्रा 8ई, एफ)की उपस्थिति। O. dioica अलग-अलग पूंछ मोरफोलोजी ओ लोंगिकाडा को ओ डायोनिकासे अलग करने के लिए भी उपयोगी हैं। जब घर के बिना एक बरकरार नग्न जानवर पार्श्व रूप से उन्मुख था, तो ओ लोंगिकाडा की पूंछ कम वक्रता के साथ अधिक सीधे थी, जिससे ओ डायोनिकाकी तुलना में यह "कठोर" उपस्थिति थी।
एक स्थिर ओइकोपलुरा संस्कृति प्रणाली स्थापित करने के लिए तीन सबसे महत्वपूर्ण कारक (i) उच्च जल गुणवत्ता को बनाए रखते हैं, (ii) इष्टतम भोजन व्यवस्था की पहचान करते हैं, और (iii) पुरुषों और महिलाओं की पर्याप्त संख्या के साथ एक स्पॉन बीकर स्थापित करते हैं। एक बहु-चरण फिल्टर प्रणाली(चित्रा 1)की शुरुआत से पानी की गुणवत्ता और संस्कृति की स्थिरता में सुधार हुआ। कृत्रिम समुद्री जल के लिए एक निस्पंदन प्रणाली आवश्यक नहीं है; हालांकि, प्राकृतिक समुद्री जल की लागत, उपलब्धता और सुविधा इसे तट के पास स्थित प्रयोगशालाओं के लिए एक बेहतर विकल्प बनाती है। भोजन व्यवस्था स्थापित करने के लिए, हम शैवाल विकास घटता है कि व्यक्तिगत प्रयोगशाला सेटिंग्स पर लागू मापने की सलाह देते हैं, क्योंकि तापमान और प्रकाश की स्थिति बहुत बदलती हैं । हमने शैवाल फ़ीड सांद्रता औररचनाओं को अनुकूलित करने के लिए पहले प्रकाशित फीडिंग शेड्यूल के साथ विकास घटता को संयुक्त किया(चित्र 4)। हम शैवाल भोजन(तालिका 2)की नए सिरे से आपूर्ति बनाए रखने के लिए एक सख्त शैवाल टीका कार्यक्रम का भी पालन करते हैं। स्वचालित फीडिंग सिस्टम हमें खेती करने वाले कर्मचारियों(चित्रा 2B)की उपस्थिति के बिना एक सुसंगत दैनिक भोजन कार्यक्रम बनाए रखने की अनुमति देता है।
एक बार इष्टतम समुद्री जल और खिलाने की स्थिति हासिल कर लेते हैं, एफएसडब्ल्यू के 2.5 एल में 15 पुरुषों और 30 महिलाओं के साथ एक स्पॉन बीकर बनाकर नई पीढ़ियों को शुरू करना महत्वपूर्ण है। यह अगले सुबह 1 दिन के जानवरों की एक अच्छी एकाग्रता सुनिश्चित करता है, जो 2 दिन पर 150 जानवरों को अलग करने के लिए पर्याप्त है, 3 दिन पर 120 और 4 दिन पर 45 परिपक्व वयस्कों को स्पॉन के लिए। यदि 4 दिन पर पर्याप्त पुरुष और महिलाएं नहीं हैं, तो एफएसडब्ल्यू के 1 एल के लिए यथासंभव अधिक से अधिक परिपक्व व्यक्तियों को इकट्ठा और स्थानांतरित करें और उन्हें स्वाभाविक रूप से इस उम्मीद में अंडे दें कि अगली पीढ़ी पर ले जाने के लिए पर्याप्त लार्वा होंगे। प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के बाद, ओ डायोनिका का जीवनचक्र 23 डिग्री सेल्सियस(चित्र 7 सी)पर 4 दिन है। हम मज़बूती से ओ डायोनिकाके छह स्वतंत्र जंगली आबादी की स्थापना की है, जिनमें से सभी 20 से अधिक पीढ़ियों तक चली ।
चित्रा 1: समुद्री जल फिल्टर प्रणाली की योजनाबद्ध।
(एऔर बी) जलाशय टैंक(सी)जलाशय टैंक में प्रवेश करने से पहले समुद्री जल को शुरू में 25 माइक्रोन फिल्टर इकाई के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है, जलाशय टैंक से समुद्री जल खींचने के लिए एक चुंबकीय ड्राइव पंप का उपयोग किया जाता है। इसके बाद जलाशय टैंक में लौटने से पहले समुद्री जल को दो पॉलीप्रोपाइलीन फिल्टर और एक यूवी स्टरलाइजर के माध्यम से धकेल दिया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: ओ डायोनिकाके लिए संस्कृति प्रणाली ।
(ए)स्वचालित डोजिंगBपंप के लिए समकालिक मोटर और शैवाल जलाशय के क्लोज-अप दृश्य का अवलोकन । सिलिकॉन ट्यूब ए और बी के आंतरिक व्यास क्रमशः 2 मिमी और 4 मिमी हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: ओ डायोनिकाके लिए स्टॉक संस्कृतियों ।
बाएं से- सी कैल्सीट्रांस, आइसोक्रिक्स एसपी, सिनेकोकोकस एसपी, और आर रेटिकुलाटा ~ 10 दिनों तक निरंतर प्रकाश के तहत 17 डिग्री सेल्सियस पर उगाए जाने के बाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: प्रमुख खाद्य प्रजातियों में से दो के लिए शैवाल विकास वक्र, सी कैल्शियम और आइसोक्रिसिस एसपी.
ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) के 660 एनएम पर तितर बितर भूखंड और(ए) सी कैल्सिट्रांस और(बी) इसोक्रीसिस एसपी के लिए कुल सेल सांद्रता। प्रत्येक बिंदु तीन माप के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। एक सेल काउंटर व्यवहार्य कोशिकाओं और कुल कोशिका सांद्रता (कोशिकाओं/एमएल) के प्रतिशत का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । माप 20 दिनों के लिए दर्ज किए गए थे (n = 47)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: ओइकोपलुरा नमूने के लिए संशोधित प्लैंकटन नेट।
एक हाथ से आयोजित प्लैंकटन नेट (100 माइक्रोन मेश) के कॉड-एंड को 500 एमएल वॉश-बॉटल से बदल दिया गया है। कॉड-एंड से 70 ग्राम वजन जुड़ा होता है। लगभग 5 मीटर रस्सी कुंजी अंगूठी से जुड़ी हुई है। कॉड-एंड को और सुरक्षित करने के लिए एक सुरक्षा पट्टा जुड़ा हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6: ओकिनावा में ओ डायोनिका की मौसमी ।
ओ डायोनिका और ओ की उपस्थिति और अनुपस्थिति। इशिकावा (26 डिग्री 25'39.3"एन 127 ° 49'56. में बंदरगाहों पर(ए)तापमान और(बी)लवणता में मौसमी परिवर्तन के संबंध में longicauda । 2015-2019 के बीच 6 "ई) और परिजन (26 डिग्री 26'40.2"एन 127 ° 55'00.3 "ई) । प्रत्येक प्रजाति वर्तमान के रूप में दर्ज की गई थी अगर ५० से अधिक जानवरों को मैन्युअल रूप से गिना गया था । सतही जल का तापमान और लवणता माप दर्ज किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 7: ओ डायोनिका मोनोकल्चर शुरू करने के लिए प्रवाह चार्ट।
(A)तीन, 500 एमएल प्लैंकटन नमूने एक नमूना स्थल से एकत्र किए जाते हैं(B)प्रत्येक नमूना जार पतला होता है और ओ डायोनिका को बाकी प्लैंकटन(सी)से अलग किया जाता है ओ डायोनिका की एक मोनोकल्चर मैन्युअल रूप से 120 दिन 3 जानवरों को एक नए बीकर में स्थानांतरित करके शुरू की जाती है जिसमें 5 एल ताजा फ़िल्टर किए गए समुद्री जल (एफएसडब्ल्यू) होते हैं। 30 महिलाओं, 15 पुरुषों और ताजा एफएसडब्ल्यू के 2.5 एल युक्त एक स्पॉन बीकर की स्थापना करें। पहली सुबह के बाद स्पॉनिंग (Day1), ध्यान से ताजा fSW के ७.५ एल युक्त बीकर में जानवरों की नई पीढ़ी के साथ स्पॉन बीकर खाली । दूसरे दिन के बाद स्पॉन (2 दिन), 5 एल ताजा fSW युक्त एक बीकर में १५० जानवरों को स्थानांतरित । तीसरे दिन के बाद स्पॉन (3 दिन), 5 एल ताजा fSW युक्त एक बीकर में १२० जानवरों के हस्तांतरण । अंतिम दिन (4 दिन) पर, अगली पीढ़ी की तैयारी में 30 महिलाओं, 15 पुरुषों और 2.5 एल ताजा एफएसडब्ल्यू युक्त एक नया स्पॉन बीकर स्थापित करें। जानवरों का 23 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिन का जीवनचक्र होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 8: ओइकोपलुरा स्प्प की पहचान । (ए-डी: ओ डायोनिका,ई और एफ: ओ लोंगिकाडा)।
(A)अंडे के साथ मादा ओ डायोनिका (B)नर ओ । शुक्राणु के साथ डायोनिका (सी)अपरिपक्व ओ डायोनिका(डी)अपरिपक्व ओ डायोनिका के वेंट्रल व्यू को सफेद तीर के साथ इंगित दो उपकोर्डल कोशिकाओं के साथ(ई)परिपक्व ओ लोंगिकाडा के वेंट्रल व्यू अंडे (तीर 1) और शुक्राणु (तीर 2)(एफ) ओ लोंगिका के पार्श्व दृश्य दिखा वेलम (3) । O. dioica कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| अभिकर्मकों | रासायनिक उत्पाद | राशि | अंतिम vol. (एमएल) | बंध्याकरण | स्टॉक/खोला गया |
| समाधान एक | एनए 2एडटा | 45 ग्राम | 1000 | ऑटोक्लेव | -20 डिग्री सेल्सियस / 4 डिग्री सेल्सियस |
| ननो3 | 100 ग्राम | ||||
| एच3बो3 | 33.6 ग्राम | ||||
| एनएएच2पीओ4 | 20 ग्राम | ||||
| एमएनएल2·4H2O | 0.36 ग्राम | ||||
| फेसीएल3·6H2O | 1.3 ग्राम | ||||
| समाधान बी | 1.0 एमएल | ||||
| समाधान बी | जेडएनसीएल2 | 2.1 ग्राम | 1000 | ऑटोक्लेव | 4 डिग्री सेल्सियस / 4 डिग्री सेल्सियस |
| कोसीएल2·6H2O | 2.0 ग्राम | ||||
| (एनएच4) 6मो7O24·4H2O | 0.9 ग्राम | ||||
| CuSO4·5H2O | 2.0 ग्राम | ||||
| * एचसीएल | - एमएल | ||||
| विटामिन | थिमिन (बी1)· Hcl | 200 मिलीग्राम | 1000 | ऑटोक्लेव | -20 डिग्री सेल्सियस / 4 डिग्री सेल्सियस |
| बायोटिन | 1 मिलीग्राम | ||||
| कोबालामिन (बी12) | 1 मिलीग्राम | ||||
| सोडियम सिलिकेट | ना 2एसआईओ3 | 5% | 1000 | 0.22 माइक्रोन फिल्टर | 4 डिग्री सेल्सियस / 4 डिग्री सेल्सियस |
| स्ट्रेप्टोमाइसिन | C21H39N7O12 | 25 मिलीग्राम/एमएल | 50 | 0.22 माइक्रोन फिल्टर | -20 डिग्री सेल्सियस /-20 डिग्री सेल्सियस |
तालिका 1: शैवाल भोजन के रखरखाव के लिए आवश्यक अभिकर् ताओं का नुस्खा। समाधान बी के लिए सूचीबद्ध सभी रासायनिक को भंग करने के बाद, एचसीएल को तब तक जोड़ा जाता है जब तक कि समाधान कोई टर्बिडिटी के साथ स्पष्ट नहीं हो जाता है। सभी अभिकर्णों को या तो ऑटोक्लेविंग (120 डिग्री सेल्सियस, 25 मिनट) या 0.22 मीटर फिल्टर के उपयोग से निष्फल किया जाता है। विटामिन स्टॉक को छोड़कर सभी अभिकर् चर निर्दिष्ट रसायन के अलावा निष्फल हो जाते हैं। विटामिन स्टॉक के लिए, पहले पानी को ऑटोक्लेव करें, और फिर सूचीबद्ध रसायन को भंग करें। स्टॉक और खोले गए अभिकर्णों के लिए भंडारण तापमान सूचीबद्ध हैं।
| संस्कृति प्रकार | शैवाल स्पीप। | एएसडब्ल्यू (एमएल) | विटामिन | समाधान एक | सोडियम सिलिकेट | स्ट्रेप्टोमाइसिन | शैवाल (एमएल) / | इनक्यूबेट/स्टोर | आवृत्ति |
| स्टॉक संस्कृति | चैटो | 60 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (केवल चाएटो) |
1/1000 (Syn के अलावा सभी) |
0.03 / स्टॉक | 17 डिग्री सेल्सियस / 4 डिग्री सेल्सियस | सप्ताह में दो बार |
| आईएसओ | 60 | 0.03 / स्टॉक | |||||||
| राइनो | 80 | 0.06 / स्टॉक | |||||||
| Syn | 60 | 0.03 / स्टॉक | |||||||
| उप-संस्कृति | चैटो | 500 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (केवल चाएटो) |
1/1000 (Syn के अलावा सभी) |
10 / स्टॉक | 17 डिग्री सेल्सियस / 17 डिग्री सेल्सियस | साप्ताहिक |
| आईएसओ | 500 | 10 / स्टॉक | |||||||
| राइनो | 500 | 20 / स्टॉक | |||||||
| Syn | 500 | 10 / स्टॉक | |||||||
| कार्य संस्कृति | चैटो | 400 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (केवल चाएटो) |
1/1000 (Syn के अलावा सभी) |
100 / उप | आरएम/आरएम | हर 4 दिन |
| आईएसओ | 400 | 100 / उप | |||||||
| राइनो | 400 | 150 / उप | |||||||
| Syn | 400 | 100 / उप |
तालिका 2: तीन शैवाल संस्कृति प्रकारों के रखरखाव के लिए निर्देश। ऑटोक्लेव समुद्री जल युक्त फ्लास्क में पूरक की निर्दिष्ट मात्रा जोड़ें। शैवाल संस्कृति की निर्दिष्ट मात्रा के साथ प्रत्येक फ्लास्क टीका। कुल्बेट और निर्धारित तापमान पर शैवाल संस्कृतियों को स्टोर करें। पिछले शेयर संस्कृति से नई स्टॉक संस्कृति और उप संस्कृति टीका, और पिछले उप संस्कृति से नई कार्य संस्कृति । नई स्टॉक संस्कृति, उप संस्कृति, और कार्य संस्कृति हर दो सप्ताह, एक सप्ताह, और चार दिन, क्रमशः टीका ओं । यह शेड्यूल ओ डायोनिका संस्कृति के लगभग 10 बीकर्स के लिए पर्याप्त भोजन प्रदान करता है। बैक-अप के रूप में प्रत्येक शैवाल संस्कृति प्रकार के 2 - 3 सेट बनाए रखें। आरएम - कमरे का तापमान।
| दिन | शैवाल स्पीप। | 9AM और 5PM | 12PM |
| 1 | चैटो | — | — |
| आईएसओ | 1000 | 2000 | |
| Syn | 20,000 | 40,000 | |
| 2 | चैटो | 1000 | 2000 |
| आईएसओ | 2000 | 2000 | |
| राइनो | 1000 | 1000 | |
| 3 | चैटो | 3000 | 4000 |
| आईएसओ | 3000 | 4000 | |
| राइनो | 1500 | 1500 | |
| 4 | चैटो | 1000 | 2000 |
| आईएसओ | 1000 | 2000 | |
| राइनो | 1000 | 1000 |
तालिका 3: शैवाल एकाग्रता प्रति खिला-गुलदस्ता एट अल से संशोधित ।27। ओकिनावा ओ डायोनिका के 4 दिवसीय जीवनचक्र के दौरान दैनिक भोजन के लिए उपयोग की जाने वाली शैवाल सांद्रता (कोशिकाएं एमएल-1)और शैवाल प्रजातियां।
पूरक फ़ाइल 1: दैनिक फीडिंग चार्ट। प्रत्येक संस्कृति बीकर के लिए दैनिक भोजन राशि स्वचालित रूप से दैनिक शैवाल अवशोषण माप (ओडी), जानवरों के आकार (दिन), और प्रत्येक संस्कृति बीकर में समुद्री जल (SW vol.) में प्रवेश करने के बाद गणना कर रहे हैं । आर रेटिकुलाटा और सिनेकोकोकस एसपी के विकास घटता गुलदस्ता एट अल से अनुकूलित किया गया। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक फ़ाइल 2: एक्रेलिक पैडल से सिंक्रोनस मोटर को कैसे कनेक्ट करें। एक हेक्सागॉन रिंच का उपयोग कर मोटर के लिए चप्पू पर कसकर पेंच। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
ओ डायोनिका संस्कृति की स्थापना में लचीलेपन को सुगम बनाने के लिए जानवरों के प्राकृतिक आवास को समझना जरूरी है । मौसमी डेटा भौतिक मापदंडों की श्रेणियों के बारे में जानकारी प्रदान करता है, जिसका उपयोग प्रयोगशाला खेती की स्थिति का मार्गदर्शन करने के लिए किया जा सकता है। यह जानवरों की प्रचुरता में मौसमी उतार-चढ़ाव को समझने में भी मदद करता है। ओकिनावा में, ओ डायोनिका सबसे मज़बूती से जून से अक्टूबर तक पाया जाता है । हालांकि, टोक्यो खाड़ी में, फरवरी औरअक्टूबर ४१में आबादी पीक । यद्यपि ओ डायोनिका की खेती अक्सर 20 डिग्री सेल्सियस या उससे कम27, 28,,,29पर बताई जाती है, ओकिनावान ओ डायोनिका 20 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान पर बेहतर अस्तित्व दिखाता है;28 इस तथ्य से समझाया जा सकता है कि ओकिनावा में न्यूनतम सतह समुद्री जल का तापमान ~ 20 डिग्री सेल्सियस(चित्र 6)है। ओ डायोनिका की प्रचुरता फाइटोप्लैंकटन खिलता42 और शिकारी बहुतायत43,44से भी प्रभावित हो सकता है । चाहे जहां ओ डायोनिका एकत्र कर रहे हैं, स्थानीय आबादी की मौसमी को समझने के नमूने और संस्कृति सफलता का मौका अधिकतम ।
उपयुक्त मौसम और स्थान को देखते हुए, शुद्ध नमूना न्यूनतम प्रयास के साथ बड़ी संख्या में ओइकोपलुरा एकत्र करने का एक प्रभावी तरीका है। छोटे जाल आकार (60-70 माइक्रोन) वाले प्लैंकटन जाल का उपयोग जानवरों के सभी चरणों को इकट्ठा करने के लिए भी किया जा सकता है। पूरी तरह से परिपक्व जानवरों को शायद ही कभी नेट में पाया जाता है, शायद जीवनचक्र के अंत में उनकी कमजोरी के कारण। इसलिए, नमूने के बाद प्रजातियों की पहचान उपकोशिक कोशिकाओं के सूक्ष्म अवलोकन द्वारा प्राप्त की जाती है। परिपक्व व्यक्ति आमतौर पर प्रयोगशाला में जानवरों के बढ़ने के साथ-साथ नमूने के बाद एक या दो दिन दिखाई देते हैं। हालांकि शुद्ध नमूना कुशल है, वैकल्पिक नमूना विधियों विभिन्न परिस्थितियों में आवश्यक हो सकता है। उदाहरण के लिए, शहरी क्षेत्रों के पास शुद्ध नमूना बड़ी संख्या में फाइटोप्लैंकटन एकत्र कर सकता है, जिससे ओइकोपलुराको अलग करना मुश्किल हो जाता है। ऐसे मामलों में, बंदरगाह से परे क्षेत्रों से सतह समुद्री जल या नाव नमूना एकत्र करने के लिए सरल बाल्टी नमूने की सिफारिश की जाती है। परिणामों से पता चला है कि लगातार बारिश के दिनों के कारण लवणता में क्रमिक परिवर्तन ओ डायोनिकाकी बहुतायत को प्रभावित नहीं करता था । हालांकि, उष्णकटिबंधीय चक्रवातों जैसे चरम मौसम की घटनाओं के तुरंत बाद किनारे नमूने से बचा जाना चाहिए। इन घटनाओं के कारण पानी के आश्रय शरीर में अचानक और कठोर जैव - रासायनिक परिवर्तन होते हैं ,46.46 तूफानी पानी के अपवाह में प्रदूषक, तलछट और अतिरिक्त पोषक तत्व हो सकते हैं, जो टर्बिडिटी और कम पानी की गुणवत्ता४७को बढ़ाते हैं । फ़िल्टर-फीडिंग प्लैंकटन, जैसे ओइकोपलुरा,अपने भोजन और सीमित गतिशीलता के कारण इन परिवर्तनों के लिए विशेष रूप से अतिसंवेदनशील हो सकते हैं। ऐसी परिस्थितियों में, हम कुछ दिनों के लिए नमूना स्थगित करने की सलाह देते हैं जब तक कि स्थानीय स्थिति सामान्य न हो जाए।
ओ डायोनिकाजैसे छोटे, फिल्टर-फीडिंग जीवों को बनाए रखने के लिए मल्टी-स्टेप फिल्टर सिस्टम की शुरुआत आवश्यक है। खराब फ़िल्टर किए गए समुद्री जल (उदाहरण के लिए, पिछली संस्कृति प्रणाली में 25 माइक्रोन जाल) का उपयोग करना, संस्कृति अक्सर विशेष रूप से गर्मियों के दौरान अस्थिर थी, संभावित रूप से फाइटोप्लैंकटन की उच्च बहुतायत के कारण। यद्यपि कुछ फाइटोप्लैंकटन ओ डायोनिका विकास के लिए फायदेमंद हैं, अन्य बायोटॉक्सिन का उत्पादन करते हैं जो ओ डायोनिका भ्रूण48के असामान्य विकास का कारण बन सकते हैं। इसके अलावा, चैटोसेरोस एसपीपी जैसे डायटोम्स की उच्च एकाग्रता ओ डायोनिका विकास के लिए संभावित रूप से हानिकारक होती है क्योंकि उनके पास लंबे सेटे हो सकते हैं जो घर को रोक सकते हैं और कुशल भोजन49को रोक सकते हैं। हम अक्सर छोटे जानवरों के घरों को सी कैल्सिट्रांस सेटे द्वारा भरा हुआ देखा जाता है; इसलिए, अब हम दिन 2 और पुराने(तालिका 3)में केवल जानवरों के लिए सी कैल्शियम फ़ीड करते हैं।
हालांकि यह यहां एक समस्या नहीं थी, ओ डायोनिका के छोटे पैमाने पर दीर्घकालिक खेती एक आनुवंशिक अड़चन के कारण जनसंख्या के आकार में अचानक बूंदों का अनुभव कर सकते हैं; ऐसे मामलों में, मार्टी-सोलंस एट अल29 हर 20 पीढ़ियों में संस्कृति में नए जंगली व्यक्तियों को जोड़ने की सलाह देते हैं।
ओइकोपलुरा संस्कृति प्रणाली लचीली है। एक सप्ताह के भीतर एक स्थिर संस्कृति स्थापित की जा सकती है। ओ डायोनिका की दीर्घकालिक खेती गैर-विशेषज्ञ उपकरणों के साथ एक मामूली बजट पर संभव है। ओइकोपलुरा के 5-10 बीकर्स के रखरखाव के लिए आवश्यक दैनिक प्रयास आम तौर पर 2 लोगों के साथ 2 घंटे से कम होता है। ओ डायोनिका को कृत्रिम समुद्री जल में भी बनाए रखा जा सकता है, जो प्राकृतिक समुद्री जल तक पहुंच के बिना उन लोगों के लिए फायदेमंद है28। ठोस संस्कृति और क्रायोप्रिजर्वेशन29का उपयोग करके शैवाल भोजन का दीर्घकालिक भंडारण संभव है। इसके अलावा, ओ डायोइका शुक्राणु क्रायोप्रीडिव किया जा सकता है, और एक वर्ष से अधिक50के लिए व्यवहार्य रहते हैं। इन सभी कारकों का मतलब है कि संस्कृतियों को आसानी से फिर से स्थापित किया जा सकता है । अंत में, Pleurobrachia सपाके आकस्मिक खेती के साथ पिछले अनुभव । सुझाव दे सकते हैं कि ओइकोपलुरा के लिए विकसित संस्कृति प्रणाली को संभावित रूप से नाजुक पेलाजिक जीवों के व्यापक समुदाय तक बढ़ाया जा सकता है।
O. डायोनिका विभिन्न जैविक क्षेत्रों में शक्तिशाली अंतर्दृष्टि प्रदान करना जारी रखता है। स्थानीय मौसमी की समझ, एक सावधानीपूर्वक संस्कृति प्रणाली, और कुछ समर्पित व्यक्ति प्रभावी संस्कृति को कम प्रयास के साथ स्थापित करने की अनुमति देते हैं। ओइकोपलुरा संस्कृति प्रणाली पारिस्थितिकी, विकास, जीनोमिक्स और इस अद्वितीय समुद्री तार के विकास से संबंधित जैविक क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए आधारभूत संसाधन प्रदान करती है।
Disclosures
लेखक के पास घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है।
Acknowledgments
हम संस्कृति प्रणाली की स्थापना में उनके समर्थन के लिए गर्थ इल्स्ले के आभारी हैं । हम जल्दी नमूना और प्रजातियों की पहचान के प्रयासों के लिए रित्सुको सुयामा और सिल्वेन गिलोट के योगदान को स्वीकार करते हैं । विशेष धन्यवाद हिरोकी निशिदा, ताकेशी ओनुमा और तात्सुया ओमोटेज़ाको के कारण उनके उदार समर्थन और मार्गदर्शन के लिए हैं, जिसमें स्थानीय संस्कृति प्रणाली की प्रारंभिक स्थापना और जानवरों और माइक्रोलगल संस्कृति को साझा करना शामिल है। हम डैनियल चौरउट, जीन-मैरी बुकी, ऐनी अजोर्ड, क्रिस्टियन कैनेस्ट्रो और अल्फोन्सो फेरांडेज़-रुल्डन को नमूना और खेती पर अपनी विशेषज्ञता साझा करने के लिए भी धन्यवाद देते हैं। जय डेंटन, चार्ल्स प्ली और जेफरी जॉली ने पांडुलिपि पर अमूल्य प्रतिक्रिया प्रदान की। शार्लोट वेस्ट ने शैवाल गणना के लिए एक सामान्यीकृत समीकरण तैयार किया। अंत में, हम धन के लिए OIST धन्यवाद, मैरी कोलिंस और सुरक्षित नमूना प्रक्रियाओं पर सलाह के लिए OIST फील्डवर्क सुरक्षा समिति, culturing और नमूना उपकरण के निर्माण के लिए OIST मशीन की दुकान के कर्मचारियों, और समुद्री जल देने के लिए कोइची टोडा ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
| Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
| Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
| Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
| Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
| Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
| Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
| Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
| Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
| TCW-5N-PPS | |||
| TCW-1N-PPS | |||
| Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
| Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
| Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
| Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
| Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
| Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
| UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
| Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |
References
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