Summary
Oikopleura dioica er en sækdyr model organisme i forskellige områder af biologi. Vi beskriver prøvetagningsmetoder, artsidentifikation, dyrkningsopsætning og dyrkningsprotokoller for dyrene og algefoder. Vi fremhæver nøglefaktorer, der har bidraget til at styrke kultursystemet og drøfte de mulige problemer og beslutninger.
Abstract
Oikopleura dioica er et planktonakkorat med exceptionel filter-fodring evne, hurtig generation tid, bevaret tidlig udvikling, og en kompakt genom. Af disse grunde betragtes det som en nyttig model organisme for marine økologiske undersøgelser, evolutionære udviklingsmæssige biologi, og genomik. Da forskning ofte kræver en stabil forsyning af dyreressourcer, er det nyttigt at etablere et pålideligt kultursystem med lav vedligeholdelse. Her beskriver vi en trinvis metode til etablering af en O. dioica kultur. Vi beskriver, hvordan du vælger potentielle prøvetagningssteder, indsamlingsmetoder, identifikation af dyr og opsætningen af dyrkningssystemet. Vi yder fejlfindingsrådgivning baseret på vores egne erfaringer. Vi fremhæver også kritiske faktorer, der hjælper med at opretholde et robust kultursystem. Selv om kulturprotokollen her er optimeret til O. dioica,håber vi, at vores prøveteknik og kulturopsætning vil inspirere til nye ideer til at vedligeholde andre skrøbelige pelagiske hvirvelløse dyr.
Introduction
Model organismer har været medvirkende til at løse mange biologiske spørgsmål, herunder dem, der vedrører udvikling, genetik, og fysiologi. Desuden fremmer yderligere modelorganismer nye opdagelser og er derfor afgørende for at opnå en større forståelse af naturen1,2. Marine zooplankton er forskellige grupper af organismer , der spiller en vigtig rolle i havets økosystemer3,4,5,6. På trods af deres overflod og økologiske betydning er gelatinøse organismer såsom planktonsækdyr ofte underrepræsenteret i planktonbiodiversitetsundersøgelser, fordi deres gennemsigtighed og skrøbelighed gør indsamling og identifikation udfordrende7,8. Tilpassede prøveudtagningsteknikker og laboratoriekultation muliggør en nærmere observation af dyrene in vitro, hvilket har fremmet kendskabet til planktonsækdyrs biologi9,10,11og12.
Larvaceans (Appendicularians) er en klasse af frisvømning marine sækdyr bestående af omkring 70 beskrevne arter på verdensplan8,13. Da de er en af de mest udbredte grupper i zooplanktonsamfund14,15,16,17, larvaceans udgør en primær fødekilde for større planktonismer såsom fiskelarver18,19. I modsætning til ascidians-the sessile sækikater-larvaceans bevare en haletudse-lignende morfologi og forblive planktonisk hele deres liv20. Hvert dyr bor inde i en selvbygget, indviklede filter-fodring struktur kendt som et hus. De ophobes partikler i deres huse ved at skabe vandstrømme gennem bølgende bevægelse af deres haler21. Tilstoppede huse kasseres hele dagen, hvoraf nogle danner kulstofaggregater og i sidste ende synker til havbunden22; larvaceans spiller således en stor rolle i den globale kulstofflux23. De fleste arter er rapporteret at leve i pelagisk zone inden for de øverste 100 m afvandsøjlen 13; men den gigantiske larvacean Bathochordaeus er kendt for at bebo dybder på 300 m24. En undersøgelse af Bathochordaeus i Monterey Bay, Californien viste, at dyrene også tjener som en biologisk vektor af mikroplast, hvilket tyder på en potentiel betydning for at forstå den rolle, appendicularians i den vertikale transport og distribution af mikroplast i havene25.
Oikopleura dioica, en art af larvacean, har tiltrukket sig opmærksomhed i de seneste år som en model organisme på grund af flere bemærkelsesværdige egenskaber. Det er almindeligt rapporteret i hele verdenshavene. Det er især rigelige i kystnære farvande26,som giver nem prøveudtagning fra kysten. Langsigtet, stabil dyrkning er mulig med både naturligt og kunstigt havvand27,28,29. Temperaturafhængige generationstider er så korte som 4-9 dage i laboratorieforhold. Det har høj frugtbarhed med hver hun i stand til at producere >300 æg hele året. Som en sækikat, det indtager en vigtig fylogenetisk position for at forstå chordate evolution30,31. På 70 Mb, O. dioica har den mindste identificerede genom blandt alle chordates32. Blandt larvaceans, O. dioica er den eneste beskrevne ikke-hermafroditiske arter hidtil33.
Den første succesfulde O. dioica-kultur med laboratoriedyrkede mikroalger blev rapporteret af Paffenhöfer34. Den oprindelige kultur protokol ved hjælp af synkrone motorer og padler blev udviklet af Fenaux og Gorsky35 og senere vedtaget af flere laboratorier. For nylig, Fujii et al.36 rapporterede O. dioica dyrkning i kunstigt havvand, en robust kultur system og felt indsamling blev beskrevet af Bouquet et al.27 og en optimeret protokol for en forenklet, overkommelig system blev rapporteret af Marti-Solans et al.29. Bortset fra den traditionelle Oikopleura kultursystem, en nyligt rapporteret design med en dobbelt rør opdræt tank har også potentiale til kultur Oikopleura sp. kr.
Vi præsenterer en detaljeret protokol for at indlede en O. dioica monokultur baseret på en kombination af protokoller udviklet af store Oikopleura forskningsgrupper på Sars International Centre for Marine Molecular Biology27, Universitetet i Barcelona29, Osaka University28, og vores egne observationer. I tidligere offentliggjorte kultur protokoller, detaljerede oplysninger om sammensætningen af alge medier, shore prøvetagning teknikker, og Oikopleura identifikation blev kun groft beskrevet, hvilket efterlader en masse tvetydighed. Her, ved hjælp af visuel information i video-protokollen, har vi samlet alle de kritiske oplysninger, der er nødvendige for at oprette en O. dioica kultur fra bunden i en enkel, trin-for-trin måde. Vi beskriver, hvordan man skelner O. dioica fra en anden almindeligt rapporteret arter, O. longicauda, som er en af de mest udfordrende trin. Selv om de eksisterende kultursystemer kan anvendes til dyrkning af O. dioica på verdensplan, fremhæver vi betydningen af protokoljustering baseret på lokale miljøforhold. De præsenterede oplysninger kombinerer bredt offentliggjorte data samt viden opnået gennem erfaring. Den nuværende protokol er velegnet til forskere, der er interesseret i at etablere en kultur fra bunden.
Protocol
1. O. dioica kultur facilitet
- Vandfiltersystem (figur 1)
- Opsaml naturligt havvand fra en havn på 2-3 m dybde. Havvandet passerer gennem et sandfilter (porestørrelse 1,4 mm) og transport til en fælles reservoirtank i laboratoriet. Brug et beholderfilter til at cirkulere vandet for at opretholde vandkvaliteten i den fælles beholdertank.
- I et kulturrum skal der oprettes et flertrinsfiltersystem bestående af en 100 L reservoirtank med en magnetisk drevpumpe, 5 μm og 1 μm polypropylensårpatronfiltre og en UV-sterilisator (100 V) (Figur 1).
- Overfør havvandet fra den fælles reservoirtank til dyrkningsrummets reservoirtank. Havvandet føres gennem en 25 μm filterenhed (figur 1A,B),før det kommer ind i dyrkningsrumsbeholderen. Havvandet cirkuleres gennem 5- og 1 μmfiltre natten over for grundigt at fjerne partikler, der potentielt kan hindre udviklingen af dyr.
BEMÆRK: Et ekstra filter med større maskestørrelse (25-50 μm) er nyttigt for at forhindre større partikler i at tilstoppe patronfiltrene med mindre maskestørrelser. Det filtrerede havvand (fSW) er klar til brug den følgende morgen.
-
Oikopleura-kulturenhed (figur 2)
- Hold dyrene i 5 eller 10 L runde, gennemsigtige plast bægerglas.
- Placer dyrkningsbægere på en stabil, to-niveau rustfrit stål reol (L x W x H = 150 cm x 45 cm x 90 cm) med en 5 mm tyk, gennemsigtig akryl overflade bord.
- Placer hvide lysstofrør under akryloverfladen for at belyse dyrene fra bunden af bægeret.
- Placer en sort plastfolie bag bægeret. Det sorte ark skaber kontrast og forbedrer visualiseringen af de gennemsigtige dyr.
- Tilslut synkrone elektriske motorer til akrylpadler (L x H = 8 cm x 27 cm) (Supplerende fil 2). Ophæng padlerne i dyrkningsæglerne fra parallelle skinner, der løber langs reolens længde (Figur 2A).
- Tænd for motorerne for at generere en blid cirkulær bevægelse i bægeret ved 15 omdr./min.
BEMÆRK: Dyr i deres cellulose huse er neutralt opdrift; vandcirkulationen hjælper dog med at holde æg, larver og algefoder, der skal suspenderes og fordeles jævnt i kulturbægeret.
- Automatisk doseringspumpe (valgfrit)
BEMÆRK: En automatisk fodringsenhed reducerer personalebehovet, især i weekenderne.- Kalibrer mængden af dispenservæske fra en automatisk doseringspumpe i henhold til producentens anvisninger.
- Brug 50 ml rør som algereservoirer.
- Bor to 5 mm huller på hætterne på 50 ml rør for at passere gennem flyselskabets slanger. Tilslut et rør til en standard akvarium luftpumpe til at indføre luftbobler, og det andet rør til indløbsporten af doseringspumpen (Figur 2B).
BEMÆRK: Indførelse af en tynd strøm af luftbobler er med til at forhindre alger i at falde til ro på bunden af rørene. - Programmer tid og volumen af algefoder, der skal udleveres på en given dag.
- Alger station
- Brug en reol (L x W x H = 90 cm x 46 cm x 115 cm) til at placere fire 1 L runde bundkolber, der indeholder algearbejdskulturer (se trin 2.1).
- Belyse arbejdskulturerne igen ved at placere lysstofrør bag kolberne.
- Tætningskolber med to-hullers gummipropper.
- Før en 1 ml engangspipette gennem gummiproppen. Brug flyselskab slange til at forbinde pipetten til et akvarium luftpumpe. Der indføres en strøm af luftbobler i kolben.
2. Mikroalgalmad
- Indledning af algekulturer
BEMÆRK: Opretholde tre sæt af kulturer (bestand, sub-, og arbejdskulturer) for tre mikroalgal arter, Chaetoceros calcitrans, Isochrysis sp., Rhinomonas reticulata, og en art af cyanobakterier, Synechococcus sp.. Stock og sub-kulturer bruges som back-ups. Arbejdskulturen bruges til daglig fodring.- Tilbered reagenser, der er nødvendige for dyrkning af mikroalger og cyanobakterier (tabel 1).
- Autoklave (121 °C, 25 min) 60 – 80 ml fSW i en 100 ml Erlenmeyerkolbe skal indledes med henblik på at igangsætte stamkultur. Aseptisk podning specificeret mængde modificeret Conway medium27 og mikroalger (Tabel 2). For eksempel at vaccinere en bestandskultur af C. calcitrans, autoklave 60 ml havvand, aseptisk podes 30 μL hver af vitamin og opløsning A, 15 μL natriumsilikat, 60 μL streptomycin og 30 μL C. calcitran fra den tidligere bestandskultur.
BEMÆRK: R. reticulata skifter fra rødlig-pink til orangish-brun, når den udsættes for for meget lys. Flyt dem væk fra lyset, når de er begyndt at vende fra klar til lys pink. - Bestandskulturen bevares i en inkubator, der er indstillet til 17 °C, med kontinuerlig belysning. Efter ca. 10 dage skifter kulturen farve for at angive algevækst (Figur 3). Når farverne vises, flytte dem til 4 °C for langtidsopbevaring i op til 1 måned.
- På en ren bænk, aseptisk pode en sub-kultur fra bestanden kultur (Tabel 2). Inkuber ved 17 °C med kontinuerlig belysning. Efter alge farver vises, fortsætte med at gemme dem i kuvøsen op til 2 uger.
- Inokulere arbejdskultur fra subkultur (Tabel 2). Kolben forsegles med en gummihætte, og der indsættes 1 ml engangspipette. Kolben flyttes til algestationen og ved stuetemperatur holdes ved stuetemperatur med en 8 timers lysperiode. Forsyning med konstant beædning. Forny arbejdskulturen hver 4.
- Rør materiel og sub-kulturer to gange om dagen ved at hvirvle.
BEMÆRK: Langtidsopbevaring af algekultur på faste medier og kryopræservering er muligt op til 3 måneder og 1 år, henholdsvis29.
- Oprettelse af algevækstkurver (valgfrit)
BEMÆRK: Nøjagtig vurdering af fodringsmængden er vigtig for at opretholde en stabil dyrkning af O. dioica. Vi skabte vækstkurver for to primære algefødearter, Chaetoceros calcitrans og Isochrysis sp.- Forbered C. calcitrans og Isochrysis sp. arbejdskulturer (tabel 2).
- For hver arbejdskulturart udtages der tre separate prøver, og absorbansen måles ved 660 nm ved hjælp af et spektrofotometer. Tag de gennemsnitlige målinger af tre eksemplarer fra hver arbejdskultur.
- Efter producentens anvisninger for en automatiseret celle tæller, forberede algeprøver til optælling. Tæl hver prøve tre gange. Tag gennemsnittet af tre optællinger for at bestemme det samlede antal celler i hver prøve.
- Fortsæt med at tælle dagligt, indtil der registreres ca. 50 gennemsnitlige målinger.
- Opret vækstkurver for begge algearter (figur 4).
3. Felt samling af vilde Oikopleura spp.
- Modificeret planktonnet (figur 5)
BEMÆRK: Nøglen til vellykket prøveudtagning af Oikopleura spp. er den langsomme bugsering af et planktonnet med en vægtet, ikke-filtrerende torskeende. Figur 5 viser et skematisk diagram over et modificeret planktonnet.- Kodning af et håndholdt planktonnet udskiftes med en modificeret 500 ml skrue-top vaskeflaske.
- Bor et hul med en diameter på 3 cm i vaskeflaskens diameter på 4 cm, så vand og dyr kan komme ind i torskeenden.
- Sæt flaskedækslet i slutningen af planktonnettet. Wrap det stramt med elektrisk tape. Fastgør hætten yderligere med en slangeklemme i rustfrit stål.
- Fastgør en vægt på 70 g på ydersiden af den modificerede torskeende med lynlåsbånd.
- Fastgør sikkerhedssnoren for yderligere at sikre torskeenden.
- Valg af samlingssteder (Figur 6)
BEMÆRK: Alle prøvesamlinger blev godkendt af OIST Fieldwork Safety Committee. Der kan være sæsonudsving i tilstedeværelsen af Oikopleura spp. afhængigt af placeringen (Figur 6). Undgå prøveudtagning umiddelbart efter ekstreme vejrforhold såsom kraftige regnstorme.- Brug satellitvisningen på et kortwebsted til at identificere potentielle prøvetagningssteder. Vi fokuserede på havne og fiskeri moler, der er let tilgængelige med bil og placeret inde bugter eller i nærheden af havet drop-offs, hvor plankton tendens til at akkumulere: Ishikawa havn i Kin Bay, Okinawa, Japan (GPS: 26 ° 25'39,3 "N 127 ° 49'56,6 "E).
- Besøg potentielle prøvetagningssteder for at vurdere kysttilgængelighed og sikkerhed på hvert sted. Få indsamlingstilladelse fra de lokale myndigheder efter behov.
- Prøveudtagningsprocedure
- Kast planktonnettet i havet og lad torskeenden synke 1-2 m under vandoverfladen.
- Slæb nettet vandret i hånden ved 50-100 cm s-1. Fortsæt bugsering ved at gå frem og tilbage i 2-5 minutter. Juster bugseringstid i henhold til den overflod af fytoplankton i havnen, med kortere blår, når der er mere fytoplankton.
BEMÆRK: Larvaceans er skrøbelige dyr. Hurtig bugsering eller gentagen støbning af nettet kan beskadige dyr, der er fanget i torskeenden. - Løft forsigtigt nettet. Overfør langsomt indholdet af torskeenden til en 500 ml rund glasflaske. Fyld prøveflasken helt med havvand for at undgå luftbobler.
BEMÆRK: Tilstedeværelsen af Oikopleura spp. kan bekræftes ved at se prøveflasker mod en sort baggrund. De fleste dyr forlader deres huse, mens de indsamles. Derfor er mikroskopisk observation nødvendig for identifikation på artsniveau. - Prøveudtagningen gentages, indtil der opsamles tre 500 ml flasker.
- Mål saltholdighed, temperatur og klorofyl a ved hjælp af en CTD profiler til at registrere rækken af fysiske parametre, hvor dyrene naturligt findes.
- Saml 10-15 L overfladehavvand i en spand for at akklimatisere dyr i laboratoriemiljøet.
4. Isolering og identifikation af dyr (figur 7, figur 8)
-
Oikopleura spp. identifikation
BEMÆRK: Andre planktoniske organismer, der kan ligne Oikopleura spp. ved første øjekast omfatter chaetognaths, Fritillaria spp., nematoder, fiskelarver med blommesække, og Ciona spp. larver.- For at akklimatisere dyrene til laboratorieforhold overføres hver 500 ml prøve til et 10 L bægerglas indeholdende 1:1-forholdet mellem overfladehavvand fra prøveudtagningsstedet og filtreret havvand (fSW), der holdes i laboratoriet (figur 7A,B). Bægerglassets volumen justeres til 5-10 L afhængigt af planktonprøvens koncentration.
BEMÆRK: Hvis planktonprøven indeholder uønsket snavs, skal du løbe gennem et groft filter (maskestørrelse ~600 μm), før den overføres til et 10 L-bægerglas. - Brug en pagaj fastgjort til en synkron elektrisk motor (15 omdr./min.) og hold planktonen i affjedring natten over (trin 1.2.5).
- Identificer Oikopleura spp. ved at lede efter 1-2 mm lange, haletudsede dyr, der bølgede deres haler inde i et sfærisk, gennemsigtigt hus. Nogle dyr kan være midlertidigt fri-svømning uden husene. Overfør forsigtigt ~ 5 dyr til en tom petriskål ved hjælp af en stump-end pipette.
- For slægt identifikation, evict dyr fra deres huse ved forsigtigt stikke huset med en overførsel pipette.
- Overhold husløse dyr under et 20-40x mørkefeltmikroskop, og bekræft Oikopleura spp (Figur 8).
- For at akklimatisere dyrene til laboratorieforhold overføres hver 500 ml prøve til et 10 L bægerglas indeholdende 1:1-forholdet mellem overfladehavvand fra prøveudtagningsstedet og filtreret havvand (fSW), der holdes i laboratoriet (figur 7A,B). Bægerglassets volumen justeres til 5-10 L afhængigt af planktonprøvens koncentration.
-
O. identifikation af dioica
BEMÆRK: O. dioica kan identificeres visuelt ved tilstedeværelsen af fuldt modne hanner og hunner eller to store subvælgte celler placeret på den distale halvdel af deres haler. Afstanden mellem to subvælge celler kan variere mellem individer.- Kontroller derefter, om der er en fuldt modnet Oikopleura med en gonade fyldt med æg (Figur 8A) eller sædceller (Figur 8B). Hvis dyret kun har æg eller sædceller, springe til trin 4.2.3, da det er O. dioica, den eneste beskrevne ikke-hermafroditiske arter.
- Hvis dyret er umodent (figur 8C), skal du kigge efter to subvælgte celler for enden af halen (figur 8D).
- Når arten er bekræftet, overføre det til en ny petriskål. Trin 4.1.3-4.2.2 indtil 10-20 individer bekræftes på artsniveau.
BEMÆRK: For lettere identifikation, bedøvelse af dyr i en petriskål, der indeholder 0,015% tricainmetanasulfonat (MS222) i fSW. - Hvis der ikke findes O. dioica, skal du holde bægerglasset suspenderet i en ekstra dag eller to. Der kan være umodne O. dioica, der vil fortsætte med at vokse og blive lettere at blive opdaget. Hvis der ikke vises nogen efter en uge, skal du kassere prøven og prøve at prøve igen.
5. Dyrkningsprotokol for O. dioica
- Påbegyndelse af en O. dioica monokultur fra et felt indsamlet prøve (Figur 7)
BEMÆRK: Algemad tilberedes dagligt af arbejdskulturer, og hvert monokulturbæger fodres tre gange om dagen kl. Dyrene holdes ved 23 °C. Under disse omstændigheder er Okinawa O. dioica livscyklus 4 dage (Figur 7C).- At indlede en monokultur af O. dioica, isolere 120 dyr og overføre til et nyt bægerglas indeholdende 5 L frisk fSW (figur 7B,C).
- Den følgende morgen, kigge efter fuldt modne hanner med gule gonader og hunner med æg, der vises som gyldne kugler (Figur 8A,B).
- Lav et gydebæger ved forsigtigt at overføre 15 hanner og 30 hunner til et nyt bægerglas indeholdende 2,5 L frisk fSW med en 5 ml stump-end pipette.
BEMÆRK: Hvis der ikke er nok hanner og hunner, overføres så mange voksne som muligt til et bægerglas indeholdende 1 L fSW og lade dem gyde naturligt. For at minimere fysisk stress for dyr under manuel overførsel, bør de langsomt siphoned og frigives under vandoverfladen. - Lad dyrene gyde naturligt for at starte den næste generation. Tailed larver skal vises cirka 3 timer efter befrugtning.
BEMÆRK: Gydning udføres af fuldt modne dyr, der forlader deres huse, svømmer mod overfladevandet og frigiver deres kønsceller. Vellykket befrugtning kan bekræftes ved at udvinde 5-10 ml havvand fra bunden af gydebæger og identificere æg med spaltninger under et mikroskop. - Den første morgen efter gydningen (dag 1) skal der vises en ny generation af dyr med oppustede huse i bægeret. Brug et håndbæger på 500 ml til forsigtigt at overføre indholdet af gydebægerglasset til et nyt bægerglas indeholdende 7,5 L frisk fSW (i alt 10 L). Hæld i en vinkel for at undgå en sprøjtbevægelse.
- Den anden morgen (dag 2) overføres 150 dyr manuelt til et nyt bægerglas indeholdende 5 L frisk fSW.
- På den tredje morgen (dag 3) overføres 120 dyr manuelt til et nyt bægerglas med 5 L frisk fSW.
BEMÆRK: For at synkronisere udviklingen af dyr, er det vigtigt at vælge personer med lignende størrelser under manuel overførsel på dag 2 og 3. Højst 10 dyr kan siphoneds i en enkelt overførsel. - På den fjerde morgen (dag 4) skal der vises fuldt modne dyr. Gentag trin 5.1.3 for at lukke livscyklussen.
BEMÆRK: En automatiseret fodring pumpe kan indstilles til at fodre dyrene på 5 PM i weekenden uden tilstedeværelse af dyrkning personale.
- Daglig tilberedning af algemad fra arbejdskultur
- Arbejdskulturens absorbans måles ved 660 nm.
- Find ud af, hvor mange algeceller der skal fodres med dyr af specifik størrelse (tabel 3).
- Brug algevækstkurverne (figur 4) til at løse nedenstående ligninger for at beregne mængden af algefoder (ml), der kræves på en given dag.
- For at beregne mængden af en bestemt alger, der er nødvendig for en bestemt dag og fodringstid, skal du bruge følgende ligning:
Hvor YA er algekoncentrationen på en given dag, og A er den mængde alger, der er behov for pr. fodring. Desuden er det lineære forhold mellem YA til x, værdierne for skæringspunkt (c) og hældning (m) vist i figur 4. Der henvises til tabel 3 for K-værdier. - For eksempel, at beregne mængden af Isochrysis sp. behov ved en 9 AM fodring af Dag 3 dyr opretholdes i en 5 L kultur og med alge absorbans på 0,234 (målt ved 660 nm), følgende blev beregnet:
BEMÆRK: Opbevar disse ligninger i et regneark, så den daglige fodringsmængde beregnes automatisk på grundlag af absorbansmålinger, dyrenes størrelse og mængden af kulturhavvand (supplerende fil 1).
- For at beregne mængden af en bestemt alger, der er nødvendig for en bestemt dag og fodringstid, skal du bruge følgende ligning:
- Den beregnede mængde alger overføres til 50 ml rør, centrifugeteres ved 5000 x g i 5 min ved 20 °C.
- Fjern supernatanten. Fyld rørene tilbage op til det oprindelige volumen med frisk fSW, der erstatter gamle algemedier.
- Opbevar tilberedt mad i køleskabet, indtil de er klar til brug til det næste foder. Kassér den gamle algemad efter ny mad er tilberedt næste morgen.
- Aktivt kul (valgfrit)
BEMÆRK: Der tilsættes 10 g aktivt kul til hvert kulturbægerglas for at opretholde vandkvaliteten. Trækul kan genbruges op til fire gange. Åbn kulposen langsomt for at undgå, at trækulstøv kommer ind i kulturbægeret.- Overfør ~700 g aktivt kul i en beholder. Soak i ferskvand (FW) i 48 timer og lad dem til at bosætte sig på bunden.
- Skyl med FW for at fjerne resterende kulstøv.
- Kog trækul i FW i 15-20 min. Fjern fra varmen og lad det køle af.
- Skyl indtil de fleste kulstøv er fjernet, og vandet bliver klart.
- Ren trækul opbevares i 2 L bægerglas indeholdende fSW. Dæk bægeret tildybes for at forhindre støv i at trænge ind.
- Tilsæt trækul til hver ny bæger, før dyrene overføres.
Representative Results
Oikopleura kan opsamles fra en båd eller fra en havn ved langsom, blid bugsering af et 100 μm mesh planktonnet med en ikke-filtrering af torskeende (Figur 5). På grund af dyrenes skrøbelige natur er det vigtigt at undgå enhver bevægelse, der kan forårsage fysisk stress, såsom hårdhændet håndtering af nettet eller sprøjt på grund af en fanget luftlomme i prøveglasset.
Det er vigtigt at forstå det sæsonmæssige mønster af lokale Oikopleura populationer samt de ledsagende udsving i vandets fysiske egenskaber på et prøvetagningssted. Stikprøver mellem 2015 og 2019 afslørede konsekvente sæsonudsving i tilstedeværelsen af O. dioica i Ishikawa og Kin havne i Okinawa (Figur 6). Overfladehavvand temperatur synes at være en vigtig faktor. O. dioica var den dominerende art, når overfladehavvand nåede ≥28 °C, og O. longicauda sameksisterede med O. dioica ved temperaturer mellem 24 °C og 27 °C; O. longicauda dominerede dog under 23 °C (figur 6A). Gradvis ændring i saltholdighed efter flere på hinanden følgende dage med kraftig regn korrelerer ikke med overfloden af O. dioica (Figur 6B).
Ved hjælp af de prøvetagningsprocedurer, der er beskrevet ovenfor, var de fleste O. dioica vi genvundet mellem dag 2 og 3 i deres 4-dages livscyklus (Figur 7C). Modne hanner blev anerkendt af den gule farve gonader mens kvindelige gonader flimrede guld fra æg, der var 70-80 μm i diameter (Figur 8A,B). Umodne O. dioica blev bekræftet af to subvælgte celler på halerne (Figur 8D). En anden dominerende art i de lokale farvande, O. longicauda, var ens i størrelse og morfologi. Vi brugte følgende kriterier til at skelne O. longicauda fra O. dioica38,39,40: en mangel på subchordal celler i halen, tilstedeværelsen af velum i stammen, og tilstedeværelsen af en hermafrodit gonade ( Figur8E, F). De forskellige hale morfologier er også nyttige til at skelne O. longicauda fra O. dioica. Når en intakt nøgen dyr uden huset var orienteret sideværts, halen af O. longicauda var mere lige med mindre krumning, hvilket giver det en "stivere" udseende i forhold til O. dioica.
De tre vigtigste faktorer for at etablere et stabilt Oikopleura kultursystem er i) opretholdelse af høj vandkvalitet, ii) at identificere den optimale fodring regime, og (iii) oprettelse af en gydebæger med tilstrækkeligt antal hanner og hunner. Indførelsen af et flertrinsfiltersystem (figur 1) forbedrede kulturens vandkvalitet og stabilitet. Et filtreringssystem er ikke nødvendigt for kunstigt havvand; men omkostningerne, tilgængeligheden og bekvemmeligheden ved naturligt havvand gør det til en bedre løsning for laboratorier beliggende nær kysten. For at etablere fodringsregimet anbefaler vi at måle algevækstkurver, der gælder for individuelle laboratorieindstillinger, da temperatur og lysforhold varierer meget. Vi kombinerede vækstkurverne med tidligere offentliggjorte fodringsplaner for at optimere algefoderkoncentrationer og -sammensætninger27 (Figur 4). Vi følger også en streng alge vaccination tidsplan for at opretholde en frisk forsyning af alge fødevarer (Tabel 2). Den automatiserede fodring system giver os mulighed for at opretholde en konsekvent daglig fodring tidsplan uden tilstedeværelse af dyrkning personale (Figur 2B).
Når optimale havvands- og fodringsforhold er opnået, er det vigtigt at starte nye generationer ved at skabe et gydebæger med 15 hanner og 30 hunner i 2,5 L fSW. Dette sikrer en god koncentration af dag 1 dyr den følgende morgen, hvilket er tilstrækkeligt til at isolere 150 dyr på dag 2, 120 på dag 3 og 45 voksne på dag 4 for gydning. Hvis der ikke er nok hanner og hunner på dag 4, indsamle og overføre så mange modne individer som muligt til 1 L fSW og lad dem gyde naturligt i håb om, at der vil være nok larver til at fortsætte på den næste generation. Efter den angivne protokol er O. dioicas livscyklus 4 dage ved 23 °C (figur 7C). Vi har pålideligt etableret seks uafhængige vilde populationer af O. dioica, som alle varede mere end 20 generationer.
Figur 1: Skematisk havvandsfiltersystem.
( A og B) Havvand filtreres i første omgang gennem en 25 μm filterenhed, før det kommer ind i reservoirtanken (C) En magnetisk drevpumpe bruges til at trække havvand fra reservoirtanken. Havvandet skubbes derefter gennem to polypropylenfiltre og en UV-sterilisator, før det vender tilbage til reservoirtanken. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kultursystem for O. dioica.
(A) Oversigt over kultursystemet (B) Nærbillede af synkron motor- og algebeholder til den automatiserede doseringspumpe. Indvendige diametre af siliciumrør A og B er henholdsvis 2 mm og 4 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Stock kulturer for O. dioica.
Fra venstre- C. calcitrans, Isochrysis sp., Synechococcus sp., og R. reticulata efter at være vokset ved 17 °C under kontinuerligt lys i ~ 10 dage. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Algevækstkurve for to af de vigtigste fødevarearter, C. calcitrans og Isochrysis sp..
Punktområder med optisk massefylde (OD) ved 660 nm og samlede cellekoncentrationer for (A) C. calcitrans og (B) Isochrysis sp.. Hvert punkt repræsenterer gennemsnittet af tre målinger. En celletæller blev brugt til at bestemme procentdelen af levedygtige celler og samlede cellekoncentrationer (celler/ml). Målingerne blev registreret i 20 dage (n = 47). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Modificeret planktonnet til prøveudtagning af Oikopleura.
Torskeenden af et håndholdt planktonnet (100 μm mesh) erstattes med en vaskeflaske på 500 ml. Torskeenden er knyttet en vægt på 70 g. Ca. 5 m reb er fastgjort til nøgleringen. En sikkerhedssnor er fastgjort for yderligere at sikre torskeendet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Sæsonudsving af O. dioica i Okinawa.
Tilstedeværelse og fravær af O. dioica og O. longicauda i forbindelse med sæsonbetingede ændringer i (A) temperatur og (B) saltholdighed i havne i Ishikawa (26°25'39.3"N 127°49'56 .6"E) og Kin (26°26'40.2"N 127°55'00.3"E) mellem 2015-2019. Hver art blev registreret som til stede, hvis mere end 50 dyr blev optalt manuelt. Temperatur- og saltholdighedsmålinger af overfladevand blev registreret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Rutediagram for påbegyndelse af O. dioica monokultur.
(A) Der udtages tre, 500 ml planktonprøver fra et prøvetagningssted (B) Hver prøvekrukke fortyndes, og O. dioica isoleres fra resten af plankton (C) En monokultur af O. dioica påbegyndes ved manuelt at overføre 120 dag 3-dyr til et nyt bægerglas indeholdende 5 L frisk filtreret havvand (fSW). Der opstilles et gydebæger med 30 hunner, 15 hanner og 2,5 l frisk fSW. Den første morgen efter gydningen (dag1) tømmes forsigtigt gydebæger med den nye generation af dyr i et bægerglas indeholdende 7,5 L frisk fSW. På den anden dag efter gydningen (dag 2) overføres 150 dyr til et bægerglas med 5 L frisk fSW. På den tredje dag efter gydningen (dag 3) overføres 120 dyr til et bægerglas med 5 L frisk fSW. På den sidste dag (dag 4) skal der opstilles et nyt gydebæger med 30 hunner, 15 hanner og 2,5 L frisk fSW som forberedelse til den næste generation. Dyrene har en 4-dages livscyklus ved 23 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Identifikation af Oikopleura spp. (A-D: O. dioica, E og F: O. longicauda).
(A) Kvinde O. dioica med æg (B) Han O. dioica med sædceller (C) Lateral visning af umodne O. dioica (D) Ventrale syn på umodne O. dioica med to subvælge celler angivet med hvide pile (E) Ventral visning af modne O. longicauda transporterer æg (pil 1) og sæd (pil 2) (F) Lateral visning af O. longicaica viser veudalum (pil 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagenser | Kemiske produkter | Beløb | Endelig vol. (ml) | Sterilisation | Lager / Åbnet |
| Løsning A | Na2EDTA | 45 g | 1000 | Autoklave | -20 °C / 4 °C |
| NaNO3 | 100 g | ||||
| H3BO3 | 33,6 g | ||||
| NaH2PO4 | 20 g | ||||
| MnCl2·4H2O | 0,36 g | ||||
| FeCl3·6H2O | 1,3 g | ||||
| Løsning B | 1,0 ml | ||||
| Løsning B | ZnCl2 | 2,1 g | 1000 | Autoklave | 4 °C / 4 °C |
| CoCl2·6H2O | 2,0 g | ||||
| (NH4)6Mo7O24·4H2O | 0,9 g | ||||
| CuSO4·5H2O | 2,0 g | ||||
| *HCl | -- ml | ||||
| Vitamin | Thiamin (B1) · Hcl | 200 mg | 1000 | Autoklave | -20 °C / 4 °C |
| Biotin | 1 mg | ||||
| Kobalamin (B12) | 1 mg | ||||
| Natriumsilikat | Na2Sio3 | 5% | 1000 | 0,22 μm filter | 4 °C / 4 °C |
| Streptomycin | C21H39N7O12 | 25 mg/ml | 50 | 0,22 μm filter | -20 °C / -20 °C |
Tabel 1: Opskrift på reagenser, der er nødvendige for vedligeholdelse af algefoder. Efter opløsning af alle de kemikalier, der er angivet for opløsning B, tilsættes HCl, indtil opløsningen bliver klar uden uklarhed. Alle reagenser steriliseres ved enten autoklavering (120 °C, 25 min) eller ved brug af et 0,22 m filter. Alle reagenser undtagen vitaminlagrene steriliseres efter tilsætning af specificeret kemikalie. For vitamin lagre, autoklave vandet først, og derefter opløse de anførte kemiske. Lagertemperaturer og åbne reagenser er anført.
| Kulturtype | Alge spp. | ASW (mL) | Vitamin | Løsning A | Natriumsilikat | Streptomycin | Alger (mL) / Kulturtype | Inkuber / Store | Frekvens |
| Aktiekultur | Chaeto (Chaeto) | 60 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (Kun Chaeto) |
1/1000 (Alle undtagen Syn) |
0.03 / lager | 17°C/ 4°C | Hver anden uge |
| Iso | 60 | 0.03 / lager | |||||||
| Rhino | 80 | 0.06 / lager | |||||||
| Syn. | 60 | 0.03 / lager | |||||||
| Underkultur | Chaeto (Chaeto) | 500 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (Kun Chaeto) |
1/1000 (Alle undtagen Syn) |
10 / lager | 17°C | Ugentlige |
| Iso | 500 | 10 / lager | |||||||
| Rhino | 500 | 20 / lager | |||||||
| Syn. | 500 | 10 / lager | |||||||
| Arbejdskultur | Chaeto (Chaeto) | 400 | 1/2000 | 1/2000 | 1/4000 (Kun Chaeto) |
1/1000 (Alle undtagen Syn) |
100 / sub | RM / RM | Hver 4. |
| Iso | 400 | 100 / sub | |||||||
| Rhino | 400 | 150 / sub | |||||||
| Syn. | 400 | 100 / sub |
Tabel 2: Instruktion i vedligeholdelse af tre algekulturtyper. Der tilsættes den angivne mængde kosttilskud til kolber, der indeholder autoklatret havvand. Hver kolbe podes med en bestemt mængde algekultur. Inkubere og opbevare algekulturer ved bestemte temperaturer. Pod ny aktiekultur og subkultur fra den tidligere bestandskultur og ny arbejdskultur fra den tidligere underkultur. Pod ny aktiekultur, subkultur og arbejdskultur hver anden uge, en uge og fire dage. Denne tidsplan giver nok mad til ca. 10 bægerglas af O. dioica kultur. Vedligehold 2 – 3 sæt af hver algekulturtype som back-ups. RM – rumtemperatur.
| Dag | Alge spp. | 9:00 og 17:00 | Kl. |
| 1 | Chaeto (Chaeto) | — | — |
| Iso | 1000 | 2000 | |
| Syn. | 20,000 | 40,000 | |
| 2 | Chaeto (Chaeto) | 1000 | 2000 |
| Iso | 2000 | 2000 | |
| Rhino | 1000 | 1000 | |
| 3 | Chaeto (Chaeto) | 3000 | 4000 |
| Iso | 3000 | 4000 | |
| Rhino | 1500 | 1500 | |
| 4 | Chaeto (Chaeto) | 1000 | 2000 |
| Iso | 1000 | 2000 | |
| Rhino | 1000 | 1000 |
Tabel 3: Algekoncentration pr. fodring - modificeret fra Bouquet et al.27. Algekoncentrationer (celler mL-1) og algearter, der anvendes til daglig fodring i Okinawa O. diocas 4-dages livscyklus.
Supplerende fil 1: Daglig fodring diagram. De daglige fodringsmængder for hvert dyrkningsbæger beregnes automatisk efter indtastning af daglige algeabsorberingsmålinger (OD), dyrenes størrelse (Dag) og mængden af havvand (SW vol.) i hvert kulturbægerglas. Vækstkurver af R. reticulata og Synechococcus sp. blev tilpasset fra Bouquet et al.27. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Fil 2: Sådan tilsluttes synkron motor til akryl pagaj. Fast skrue på pagajen til motoren ved hjælp af en sekskant skruenøgle. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
For at fremme fleksibiliteten i etableringen af O. dioica kultur, er det vigtigt at forstå dyrenes naturlige habitat. Sæsondata giver oplysninger om de forskellige fysiske parametre, som kan bruges til at styre laboratoriedyrkningsforhold. Det hjælper også med at forstå sæsonmæssige udsving i overflod af dyr. I Okinawa, O. dioica er mest pålideligt fundet fra juni til oktober. Men i Tokyo bay, befolkninger peak i februar og oktober41. Selv om dyrkning af O. dioica ofte rapporteres ved 20 °C eller lavere27,28,29, viser Okinawan O. dioica bedre overlevelse ved temperaturer over 20 °C; dette kan forklares ved, at mindstetemperaturen for havvand i okinawa er ~20 °C (figur 6). Overfloden af O. dioica kan også være påvirket af fytoplanktonblomstring42 og rovdyr overflod43,44. Uanset hvor O. dioica er indsamlet, forstår sæsonudsving af lokalbefolkningen maksimerer chancen for prøveudtagning og dyrkning succes.
I betragtning af den passende sæson og placering, netto prøveudtagning er en effektiv måde at indsamle et stort antal Oikopleura med minimal indsats. Planktonnet med mindre maskestørrelse (60-70 μm) kan også anvendes til opsamling af alle dyrenes faser. Fuldt modne dyr findes sjældent i nettet, måske på grund af deres skrøbelighed ved slutningen af livscyklussen. Derfor opnås artsidentifikation efterfulgt af prøveudtagning ved mikroskopisk observation af subvælgske celler. Modne individer vises normalt en eller to dage efter prøveudtagningen, efterhånden som dyrene fortsætter med at vokse i laboratoriet. Selv om nettoprøvetagning er effektiv, kan alternative prøveudtagningsmetoder være nødvendige under forskellige omstændigheder. For eksempel kan nettoprøvetagning nær byområder indsamle et stort antal fytoplankton, hvilket gør det vanskeligt at isolere Oikopleura. I sådanne tilfælde anbefales det at udtage en simpel skovlprøve til optagning af overfladehavvand eller bådudtagning fra områder uden for havnen. Resultaterne viste, at den gradvise ændring i saltholdigheden som følge af på hinanden følgende dage med regn ikke påvirkede overfloden af O. dioica; det bør dog undgås, at der udtages prøver på land umiddelbart efter ekstreme vejrforhold såsom tropiske cykloner. Disse begivenheder forårsager pludselige og drastiske biogeokemiske ændringer i et beskyttet vandområde45,46. Regnvandsafstrømningen kan medføre forurenende stoffer, sedimenter og overskydende næringsstoffer, hvilket øger uklarheden og lavere vandkvalitet47. Filter-fodring plankton, såsom Oikopleura, kan være særligt modtagelige for disse ændringer på grund af deres form for fodring og begrænset mobilitet. I sådanne tilfælde anbefaler vi at udsætte prøveudtagningen i et par dage, indtil de lokale forhold vender tilbage til normal.
Indførelsen af et flertrinsfiltersystem er afgørende for at opretholde små, filterfodringsorganismer som O. dioica. Ved hjælp af dårligt filtreret havvand (f.eks. et 25 μm mesh i det tidligere kultursystem) var kulturen ofte ustabil især om sommeren, potentielt på grund af den højere forekomst af fytoplankton. Selv om nogle fytoplankton er til gavn for O. dioica vækst, andre producerer biotoksiner, der kan forårsage unormal udvikling af O. dioica embryoner48. Hertil kommer, en høj koncentration af diatomer såsom Chaetoceros spp. er potentielt skadelige for O. dioica vækst, da de kan besidde lange setae, som kan tilstoppe huset og forhindre effektiv fodring49. Vi observerede ofte huse af små dyr, der tilstoppes af C. calcitrans setae; Derfor fodrer vi nu kun C. calcitrans til dyr på dag 2 og ældre(tabel 3).
Selv om det ikke var et problem her, kan små langsigtede dyrkning af O. dioica opleve pludselige fald i befolkningens størrelse på grund af en genetisk flaskehals; I sådanne tilfælde anbefaler Martí-Solans et al.29 at tilføje nye vilde individer til kulturen hver 20.
Oikopleura kultursystemet er fleksibelt. En stabil kultur kan etableres inden for en uge. Langsigtet dyrkning af O. dioica er mulig på et beskedent budget med ikke-specialudstyr. Den daglige indsats, der kræves for vedligeholdelse af 5-10 bægerglas af Oikopleura er generelt mindre end 2 timer med 2 personer. O. dioica kan også opretholdes i kunstigt havvand, hvilket er til gavn for dem uden adgang til naturligt havvand28. Langtidsopbevaring af algefødevarer er mulig ved hjælp af fast kultur og kryopræservering29. Desuden kan O. dioica sædceller kryopræpareres, og forblive levedygtige i mere end et år50. Alle disse faktorer betyder, at kulturer let kan genetableres. Endelig tidligere erfaringer med utilsigtet dyrkning af Pleurobrachia sp. kan tyde på, at det dyrkningssystem, der er udviklet til Oikopleura, potentielt kan udvides til at omfatte et bredere fællesskab af skrøbelige pelagiske organismer.
O. dioica fortsætter med at give stærk indsigt i forskellige biologiske områder. En forståelse af lokal sæsonudsving, en omhyggelig kultur system, og et par dedikerede personer tillader effektiv kultur, der skal etableres med lille indsats. Oikopleura kultursystem giver baseline ressourcer til at undersøge en bred vifte af biologiske områder vedrørende økologi, udvikling, genomik, og udviklingen af denne unikke marine chordate.
Disclosures
Forfatteren har intet at erklære.
Acknowledgments
Vi er Garth Ilsley taknemmelige for hans støtte til etableringen af kultursystemet. Vi anerkender Ritsuko Suyamas og Sylvain Guillots bidrag til tidlig prøveudtagning og vurdering af artsidentifikation. Særlig tak skyldes Hiroki Nishida, Takeshi Onuma og Tatsuya Omotezako for deres generøse støtte og vejledning hele vejen igennem, herunder indledende etablering af det lokale dyrkningssystem og deling af dyr og mikroalgekultur. Vi takker også Daniel Chourrout, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristian Cañestro og Alfonso Ferrández-Roldán for at dele deres ekspertise inden for prøveudtagning og dyrkning. Jai Denton, Charles Plessy og Jeffrey Jolly gav uvurderlig feedback på manuskriptet. Charlotte West formulerede en generaliseret ligning for algeberegning. Endelig takker vi OIST for finansieringen, Mary Collins og OIST Fieldwork Safety Committee for rådgivning om sikre prøveudtagningsprocedurer, personalet i OIST maskinværksted for opførelse af dyrknings- og prøveudstyr og Koichi Toda til levering af havvand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
| Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
| Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
| Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
| Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
| Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
| Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
| Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
| Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
| TCW-5N-PPS | |||
| TCW-1N-PPS | |||
| Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
| Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
| Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
| Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
| Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
| Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
| UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
| Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |
References
- Travis, J. Is It What We Know or Who We Know? Choice of Organism and Robustness of Inference in Ecology and Evolutionary Biology (American Society of Naturalists Presidential Address). The American Naturalist. 167 (3), 303-314 (2006).
- Jenner, R. A., Wills, M. A. The choice of model organisms in evo-devo. Nature Reviews Genetics. 8 (4), 311-314 (2007).
- Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
- Wilson, S., Ruhl, H., Smith, J. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Steinberg, D. K., Lomas, M. W., Cope, J. S. Long-term increase in mesozooplankton biomass in the Sargasso Sea: Linkage to climate and implications for food web dynamics and biogeochemical cycling. Global Biogeochemical Cycles. 26 (1), 1004 (2012).
- Lombard, F., Kiørboe, T. Marine snow originating from appendicularian houses: Age-dependent settling characteristics. Deep Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers. 57 (10), 1304-1313 (2010).
- Fenaux, R. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 251-264 (1998).
- Hopcroft, R. R. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. , Contemporaty Publishing International. 45-57 (2005).
- Walters, T. L., Gibson, D. M., Frischer, M. E. Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e59832 (2019).
- Deibel, D. Feeding mechanism and house of the appendicularian Oikopleura vanhoeffeni. Marine Biology. 93 (3), 429-436 (1986).
- Spada, F., et al. Molecular patterning of the oikoplastic epithelium of the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 20624-20632 (2001).
- Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. , Contemporaty Publishing International. 59-85 (2005).
- Tokioka, T. Studies on the distribution of appendicularians and some thaliaceans of the North Pacific, with some morphological notes. Publication of the Seto Marine Biological Laboratory. (8), 351-443 (1960).
- Alldredge, A. L. Discarded appendicularian houses as sources of food, surface habitats, and particulate organic matter in planktonic environments. Limnology and Oceanography. 21 (1), 14-24 (1976).
- Clarke, C., Roff, J. C. Abundance and biomass of herbivorous zooplankton off Kingston, Jamaica, with estimates of their annual production. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 31 (4), 423-437 (1990).
- Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Zooplankton growth rates: extraordinary production by the larvacean Oikopleura dioica in tropical waters. Journal of Plankton Research. 17 (2), 205-220 (1995).
- Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Production of tropical larvaceans in Kingston Harbour, Jamaica: are we ignoring an important secondary producer. Journal of Plankton Research. 20 (3), 557-569 (1998).
- Mochioka, N., Iwamizu, M. Diet of anguilloid larvae: leptocephali feed selectively on larvacean houses and fecal pellets. Marine Biology. 125 (3), 447-452 (1996).
- Sakaguchi, S. O., et al. Morphological identity of a taxonomically unassigned cytochrome c oxidase subunit i sequence from stomach contents of juvenile chum salmon determined using polymerase chain reaction. Fisheries Science. 83 (5), 757-765 (2017).
- Fenaux, R. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 25-34 (1998).
- Sato, R., Tanaka, Y., Ishimaru, T. House production by Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) under laboratory conditions. Journal of Plankton Research. 23 (4), 415-423 (2001).
- Flood, R., Deibel, D. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 105-124 (1998).
- Alldredge, A. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. , Contemporaty Publishing International. 309-326 (2005).
- Katija, K., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. New technology reveals the role of giant larvaceans in oceanic carbon cycling. Science Advances. 3 (5), 1602374 (2017).
- Katija, K., Choy, C. A., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. From the surface to the seafloor: How giant larvaceans transport microplastics into the deep sea. Science Advances. 3 (8), 1700715 (2017).
- Hidaka, K. Species composition and horizontal distribution of the appendicularian community in waters adjacent to the Kuroshio in winter-early spring. Plankton and Benthos Research. 3 (3), 152-164 (2008).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359-370 (2009).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: culture, genome, and cell lineages. Development, Growth & Differentiation. 50, 239-256 (2008).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica culturing made easy: A Low-Cost facility for an emerging animal model in Evo Devo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), 146-152 (2016).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Seo, H. C., et al. Miniature genome in the marine chordate Oikopleura dioica. Science. 294 (5551), 2506 (2001).
- Fredriksson, G., Olsson, R. The subchordal cells of Oikopleura dioica and O. albicans (Appendicularia, Chordata). Acta Zoologica. 72 (4), 251-256 (1991).
- Paffenhöfer, G. A. The cultivation of an appendicularian through numerous generations. Marine Biology. 22 (2), 183-185 (1973).
- Fenaux, R., Gorsky, G. Nouvelle technique d'élevage des appendiculaires. Rapports et Procés-Verbaux des Réunions-Commission Internationale pour l'Exploration Scientifique de la Mer Méditerranée. 29, 291-292 (1985).
- Fujii, S., Nishio, T., Nishida, H. Cleavage pattern, gastrulation, and neurulation in the appendicularian, Oikopleura dioica. Development Genes and Evolution. 218 (2), 69-79 (2008).
- Patry, W. L., Bubel, M., Hansen, C., Knowles, T. Diffusion tubes: a method for the mass culture of ctenophores and other pelagic marine invertebrates. PeerJ. 8, 8938 (2020).
- Fenaux, R. The classification of Appendicularia (Tunicata): history and current state. Memoires de I'Institut oceanographique. , (1993).
- Shiga, N. Illustrated Guide to Marine Plankton in Japan. Chihara, M., Murano, M. , Tokai University Press. 1393-1414 (1997).
- Gorsky, G., Castellani, C. Marine Plankton: A practical guide to ecology, methodology, and taxonomy. Castellani, C., Edwards, M. , Oxford University Press. 599-606 (2017).
- Sato, R., Ishibashi, Y., Tanaka, Y., Ishimaru, T., Dagg, M. J. Productivity and grazing impact of Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) in Tokyo Bay. Journal of Plankton Research. 30 (3), 299-309 (2008).
- Nakamura, Y., Suzuki, K., Suzuki, S. Y., Hiromi, J. Production of Oikopleura dioica (Appendicularia) following a picoplankton 'bloom'in a eutrophic coastal area. Journal of Plankton Research. 19 (1), 113-124 (1997).
- Nakamura, Y. Blooms of tunicates Oikopleura spp. and Dolioletta gegenbauri in the Seto Inland Sea, Japan, during summer. Hydrobiologia. 385 (1-3), 183-192 (1998).
- Uye, S. I., Ichino, S. Seasonal variations in abundance, size composition, biomass and production rate of Oikopleura dioica (Fol)(Tunicata: Appendicularia) in a temperate eutrophic inlet. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 189 (1-2), 1-11 (1995).
- Tsuchiya, K., et al. Phytoplankton community response and succession in relation to typhoon passages in the coastal waters of Japan. Journal of Plankton Research. 36 (2), 424-438 (2014).
- Lopez-Lopez, L., et al. Effects of typhoons on gelatinous carnivore zooplankton off Northern Taiwan. Cahiers de Biologie Marine. 53, 349-355 (2012).
- Ares, Á, et al. Extreme storm-induced run-off causes rapid, context-dependent shifts in nearshore subtropical bacterial communities. bioRxiv. , (2019).
- Torres-Águila, N. P., et al. Diatom bloom-derived biotoxins cause aberrant development and gene expression in the appendicularian chordate Oikopleura dioica. Communications Biology. 1 (1), 1-11 (2018).
- Troedsson, C., Frischer, M. E., Nejstgaard, J. C., Thompson, E. M. Molecular quantification of differential ingestion and particle trapping rates by the appendicularian Oikopleura dioica as a function of prey size and shape. Limnology and Oceanography. 52 (1), 416-427 (2007).
- Ouchi, K., Nishino, A., Nishida, H. Simple procedure for sperm cryopreservation in the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Zoological Science. 28 (1), 8-11 (2011).
