Summary
هنا يتم تقديم طرق لفهم الآثار المضادة للسرطان من اللاكتوباكيلوس الخلايا الخالية من الخلايا الفائقة (LCFS). تظهر خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم وفيات الخلايا عند علاجها باستخدام LCFS في الثقافات ثلاثية الأبعاد. يمكن تحسين عملية توليد كرويدات اعتمادا على السقالة وأساليب التحليل المقدمة مفيدة لتقييم مسارات الإشارات المعنية.
Abstract
تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لتقييم وفيات الخلايا السرطانية في كرويات ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) لأنواع متعددة الخلايا من الخلايا السرطانية باستخدام الخلايا الخارقة من زراعة خلايا الاختمار اللاكتوباكيلوس ، التي تعتبر ثقافات البروبيوتيك. استخدام الثقافات ثلاثية الأبعاد لاختبار اللاكتوباكيلوس الخالية من الخلايا الفائقة (LCFS) هي خيار أفضل من الاختبار في الطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد ، خاصة وأن L. fermentum يمكن أن تنتج تأثيرات مضادة للسرطان داخل الأمعاء. تم تحديد L. fermentum supernatant لامتلاك زيادة الآثار المضادة للتكاثر ضد العديد من خلايا سرطان القولون والمستقيم (CRC) في ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد. ومن المثير للاهتمام أن هذه الآثار كانت مرتبطة بقوة بنموذج الثقافة، مما يدل على القدرة الملحوظة ل. فيمرخوم للحث على موت الخلايا السرطانية. تم إنشاء كرويات مستقرة من CRCs متنوعة (خلايا سرطان القولون والمستقيم) باستخدام البروتوكول المعروض أدناه. هذا البروتوكول لتوليد كرويد 3D هو توفير الوقت وفعالة من حيث التكلفة. وقد تم تطوير هذا النظام للتحقيق بسهولة في الآثار المضادة للسرطان من LCFS في أنواع متعددة من كرويدات لجنة حقوق الطفل. كما هو متوقع، عالجت كرويات CRC مع LCFS موت الخلايا المستحث بقوة خلال التجربة وأعربت عن علامات جزيئية محددة للخلايا المبرمج كما تم تحليلها من قبل qRT-PCR، النشاف الغربي، وتحليل FACS. لذلك، هذه الطريقة قيمة لاستكشاف صلاحية الخلايا وتقييم فعالية الأدوية المضادة للسرطان.
Introduction
البروبيوتيك هي الكائنات الحية الدقيقة الأكثر فائدة في القناة الهضمية التي تحسن التوازن المناعي واستقلاب الطاقة المضيف1. البروبيوتيك من اللاكتوباكيلوس وبيفيدوباكتريا هي الأكثر تقدما من نوعها وجدت في الأمعاء2،3. وقد أظهرت التحقيقات السابقة أن Lactobacillus له آثار مثبطة ومكافحة الانتشار على العديد من أنواع السرطان, بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم4. وعلاوة على ذلك، البروبيوتيك منع أمراض التهاب الأمعاء، ومرض كرون، والتهاب القولون التقرحي5،6. ومع ذلك، أجريت معظم الدراسات مع البروبيوتيك في أحادية الأبعاد ثنائية الأبعاد (2D) التي تزرع على الأسطح الصلبة.
تفتقر أنظمة الثقافة الاصطناعية إلى السمات البيئية، وهو أمر غير طبيعي بالنسبة للخلايا السرطانية. للتغلب على هذا القيد، تم تطوير أنظمة ثقافة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد)7و8. تظهر الخلايا السرطانية في 3D تحسينات من حيث الآليات البيولوجية الأساسية ، مثل صلاحية الخلية ، والانتشار ، والمورفولوجيا ، والاتصالات الخلوية ، وحساسية الدواء ، وفيأهميةالجسم الحي 9،10. وعلاوة على ذلك، يتم إجراء كرويدات من أنواع متعددة الخلايا من سرطان القولون والمستقيم وتعتمد على التفاعلات الخلية الخلية ومصفوفة خارج الخلية (ECM)11. وقد ذكرت دراستنا السابقة أن الخلايا بروبيوتيك خالية من الخلايا supernatant (CFS) المنتجة باستخدام اللاكتوباكيلوس fermentum أظهرت آثار مضادة للسرطان على الثقافات 3D من سرطان القولون والمستقيم (CRC) خلايا12. اقترحنا أن لجنة الأمن الغذائي العالمي هو استراتيجية بديلة مناسبة لاختبار آثار بروبيوتيك على كرويدات 3D12.
هنا, نقدم نهجا يمكن أن تستوعب أنواع متعددة الخلايا من سرطان القولون والمستقيم 3D لتحليل الآثار العلاجية للخلايا بروبيوتيك supernatant خالية (CFS) على العديد من أنظمة محاكاة سرطان القولون والمستقيم 3D. توفر هذه الطريقة وسيلة لتحليل الآثار ذات الصلة بروبيوتيك ومكافحة السرطان في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. زراعة الخلايا البكتيرية وإعداد اللاكتوباكيلوس الخالية من الخلايا الفائقة (LCFS)
ملاحظة: يتم إجراء الخطوات 1.2 - 1.9 في غرفة اللاهوائية.
- إعداد لوحة أجار MRS ومرق تحتوي على L-السيستين وتعقيمها عن طريق الالاستعباد التلقائي.
- قبل احتضان لوحة أجار MRS في H2 غرفة اللاهوائية الحفاظ على 37 درجة مئوية مع الأكسجين 20 ppm.
- ذوبان اللاكتوباكيلوس الأسهم البكتيرية وتطعيم لوحة أجار مع الثقافة البكتيرية (الشكل 1A (1)).
- احتضان البكتيريا لمدة 2-3 أيام في H2 غرفة اللاهوائية في 37 درجة مئوية و 20 صفحة في الدقيقة الأكسجين حتى يتم الحصول على مستعمرات بكتيرية واحدة.
- غسل وتجفيف نوع Hungate أنبوب الثقافة اللاهوائية. أوتوكلاف أنبوب الثقافة في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- ثم احتضان الأنبوب في H2 غرفة اللاهوائية في 37 درجة مئوية و 20 ppm الأكسجين لإزالة الأكسجين.
- مكان 2 - 3 مل من مرق MRS في الأنبوب. ختم أنبوب مع سدادة مطاطية بوتيل والمسمار الغطاء.
- الحصول على مستعمرة واحدة مع حلقة ووضعها في أنبوب الثقافة 1.5 مل مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1x. (الشكل1A (2)).
- تعليق المستعمرة باستخدام حقنة 1 مل (الشكل 1A (iii)). القيام بذلك عن طريق, إدراج إبرة من حقنة 1 مل في وسط غطاء أنبوب, قرصنة مستعمرة علقت ومن ثم إعادة تعليق مرة أخرى في وسائل الإعلام مرق MRS. (الشكل 1A (4)).
- احتضان وسائل الإعلام مرق MRS في حاضنة شاكر لمدة 2 أيام (37 درجة مئوية، 5٪ CO2، 200 دورة في الدقيقة).
- قياس الكثافة البصرية (OD) باستخدام مطياف لرصد منحنيات النمو البكتيري حتى يصل الامتصاص في OD620 إلى 2.0.
- فصل الكريات البكتيرية ووسائل الإعلام مشروطة عن طريق الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 15 دقيقة. غسل الكريات البكتيرية التي تم جمعها مع برنامج تلفزيوني 1x وإعادة الإنفاق في 4 مل من RPMI 1640 تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنين. لا تقم بتضمين أي مضادات حيوية في الوسط.
- الحفاظ على الكريات البكتيرية في RPMI واحتضان في حاضنة شاكر لمدة 4 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 بسرعة 100 دورة في الدقيقة.
- لإعداد بروبيوتيك supernatant, إزالة بيليه البكتيرية عن طريق الطرد المركزي في 1000 x ز, لمدة 15 دقيقة في 4 °C. قم بتصفية المسخ الفائق المسترد باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر وتخزينه عند −80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. جيل من كرويدات
-
إعداد خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم
- تنمو DLD-1، HT-29، وخطوط خلايا WiDr كطبقات أحادية حتى 70-80٪ التقاء واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة5٪ CO 2 (متوسط النمو: RPMI تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين-streptomycin).
- للخلايا التي تزرع في طبق بيتري 100 ملم، وغسل لوحة مرتين مع 4 مل من برنامج تلفزيوني 1x. إضافة 1 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA واحتضان طبق بيتري لمدة 2 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة5٪ CO 2 لتفكك الخلايا.
- بعد الحضانة، تحقق من تفكك الخلية تحت المجهر وتحييد التريبسين-EDTA مع 5 مل من متوسط النمو.
- نقل الخلايا المفككة إلى أنبوب مخروطي 15 مل وطارد مركزي لمدة 3 دقائق عند 300 × ز.
- تجاهل supernatant و resuspend بلطف مع 3 مل من وسائل الإعلام النمو.
- عد الخلايا مع تريبان الأزرق لتحديد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم. (الشكل 1B (1))
-
تشكيل كروي
- في أنبوب مخروطي 15 مل، تمييع الخلايا من 2.1.5 للحصول على 1- 2 × 105 خلايا / مل (الشكل 1B (2))
- إضافة تركيز النهائي من 0.6٪ ميثيلسليلوز إلى تعليق الخلية ونقل الخلايا المخففة إلى خزان معقم.
ملاحظة: لكل خط الخلية، يجب أن يتم إعادة كمية الميثيلسليلوز اللازمة وتحديد وفقا لذلك. - استخدام ماصة متعددة القنوات للاستغناء عن 200 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من مرفق منخفض جدا 96 جيدا جولة أسفل لوحة صغيرة. (الشكل 1B (iii))
- احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة5٪ لمدة 24 - 36 ساعة.
- بعد 24 - 36 ساعة، مراقبة لوحة تحت المجهر الخفيف لضمان تشكيل كروية.
3. علاج الخلايا السرطانية ثلاثية الأبعاد مع LCFS
- إنشاء كرويدات كما هو موضح في الخطوتين 2 و 3.
- قبل إجراء علاج LCFS، قم بإذابة LCFS المجمدة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 -20 دقيقة.
- تلقيح حل أسهم LCFS في وسيط نمو. تخفيف تسلسلي إلى 25٪، 12.5٪، و 6٪ في متوسط النمو (أي، 25٪ LCFS = 150 ميكرولتر من متوسط النمو + 50 ميكرولتر من LCFS).
- إخراج لوحة ثقافة الخلية التي تحتوي على كرويدات من الحاضنة وإزالة أكبر قدر ممكن من متوسط النمو من كل بئر باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
- أضف وسائط النمو مع LCFS على الخلايا واحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪ لمدة 24 - 48 ساعة.
ملاحظة: يعتمد الحجم الذي سيتم استخدامه على حجم اللوحة كما يلي: 2 مل لصفائح زراعة الخلايا ذات 6 آبار؛ و 2 مل للوحة زراعة الخلايا ذات الخلايا 6-well; 200 ميكرولتر ل 96 لوحة ثقافة خلايا جيدة.
4. صلاحية الخلية للشفرات
- إعداد 8 - 10 كرويدات سرطان القولون والمستقيم المعالجة LCFS في لوحات متعددة الآبار مبهمة الجدران (يتم إجراء مقايسات قابلية بقاء الخلية 48 ساعة بعد علاج LCFS).
- إذابة كاشف قابلية الخلية (راجع جدول المواد)عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لليلة واحدة.
- توازن الكاشف قدرة الخلية على البقاء لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
- قبل إجراء الفحص، قم بإزالة 50٪ من وسائط النمو من كرويدات.
- إضافة 100 ميكرولتر من كاشف قدرة الخلية على البقاء إلى كل بئر.
ملاحظة: يعتمد الحجم الذي سيتم استخدامه على حجم اللوحة كما يلي: 100 ميكرولتر لألواح زراعة الخلايا ذات 96 بئرا. - خلط الكاشف بقوة لمدة 5 دقائق لتعزيز تحلل الخلية.
- حضانة لمدة 30 دقيقة - 2 ساعة في 37 درجة مئوية.
- سجل التألق.
5. تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي للشفرات
- لكل حالة، وإعداد 10-15 كروية في أنبوب 2 مل والطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 400 × ز.
- تجاهل supernatant وغسل كرويدات مرتين في 1 مل من الجليد الباردة 1x PBS.
ملاحظة: تجنب الطرد المركزي، دع كرويدات تستقر. - يستنشق أكبر قدر ممكن من برنامج تلفزيوني 1x وعزل الجيش الملكي النيبالي باستخدام مجموعة متاحة تجاريا.
- توليف cDNA من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام عدة المتاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- إعداد مزيج رئيسي لتشغيل كافة العينات في ثلاثية (انظر الجدول 1 والجدول 2).
- قم بإجراء التضخيم في 20 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للقالب في كل لوحة qPCR بشكل جيد.
- مزيج ردود الفعل بشكل جيد وتدور إذا لزم الأمر.
- تشغيل العينات وفقا لتوصيات الشركة المصنعة للآلة (الجدول 3).
6. النشاف الغربي من كرويدات
ملاحظة: عند جمع كرويدات، استخدم ماصة 200 ميكرولتر وقطع نهاية النصائح لتجنب إزعاج هيكلها.
- لكل حالة، وإعداد 30-40 كروية في أنبوب 2 مل.
- ضع الأنبوب على الجليد ودع كرويدات تستقر في الجزء السفلي من أنبوب 2 مل.
- تجاهل supernatant وغسل كرويدات مرتين في 1 مل الجليد الباردة 1x PBS
ملاحظة: تجنب الطرد المركزي، دع كرويدات تستقر. - اسبيرات أكبر قدر ممكن من برنامج تلفزيوني 1x وإضافة RIPA العازلة مع كوكتيل مثبط بروتيز (10 كرويدات = 30 ميكرولتر من العازلة RIPA).
- Lyse الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا وأداء سونيكيشن لمدة 30 ق مع 30 ق من يستريح على الجليد لمدة 10 دورات.
- الطرد المركزي lysates البروتين في 15000 س غ لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- تحديد تركيز البروتين لكل خلية lysate.
- قبل التحميل، قم بغلي كل خلية في عينة عازلة عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تحميل كميات متساوية من البروتين في آبار هلام SDS-PAGE وتشغيل هلام لمدة 1- 2 ساعة في 100 V.
- نقل البروتين من الجل إلى غشاء PVDF.
- بعد نقل، منع الغشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة باستخدام العازلة حجب (5٪ الحليب الخالي من الدسم + TBS مع 0.05٪ توين-20).
- احتضان الغشاء مع 1:1,000 التخفيف من الأجسام المضادة الأولية (الجدول 4) في TBST 1x مع 5٪ BSA العازلة في 4 °C بين عشية وضحاها.
- غسل الغشاء ثلاث مرات مع TBST، 15 دقيقة لكل غسل.
- احتضان الغشاء مع 1:2,500 تمييع الأجسام المضادة الثانوية في العازلة حجب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة (انظر جدول المواد).
- غسل الغشاء ثلاث مرات مع TBST، 15 دقيقة لكل غسل.
- إعداد الغشاء للكشف HRP مع ركيزة chemiluminescent.
- الحصول على صور تشيميلومينيسنت.
7. بروبيديوم يوديد (PI) تلطيخ كرويدات
- إعداد 5-10 كرويات كما هو موضح في الخطوة 4.1 ووضع كرويدات في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- تمييع 1 ملغ / مل من الأسهم PI 1:100 في برنامج تلفزيوني 1x.
- إزالة 50٪ من المتوسط من كل بئر من لوحة 96 جيدا.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول PI لكل بئر وضع الآبار في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 10 - 15 دقيقة.
- اغسل محلول PI باستخدام برنامج تلفزيوني 1x.
- إضافة 200 ميكرولتر من متوسط النمو واتخاذ صورة باستخدام المجهر مضان. تحليل كثافة الفلورية باستخدام صورة J للحصول على عدد صلاحية كروية.
8. تحليل FACS للشفرات
- إنشاء كرويات كما هو موضح سابقا.
- لكل حالة، قم بإعداد 30-40 كروية في أنبوب FACS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 400 × ز وRT.
- اسبيرات supernatant وغسل كرويدات في 3 مل من برنامج تلفزيوني 1x، ثم الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية.
- أسبيرات supernatant وإضافة 200 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين-EDTA، ثم احتضان في RT لمدة 2-3 دقائق.
ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على حجم كروية ونوع الخلية. - إضافة 1 مل من العازلة FACS وتفكيك بلطف كرويدات باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
- الطرد المركزي الخلايا المفككة في 400 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: FACS المخزن المؤقت = 1x PBS + 2.5٪ FBS، تمت تصفيته باستخدام مرشح أعلى 0.22 ميكرومتر. - تجاهل supernatant وإضافة 7-AAD/Annexin V كاشف (7AAD (5 ميكرولتر)، Annexin V (5 ميكرولتر)/عينة).
- دوامة بلطف الخلايا واحتضان لمدة 13 -30 دقيقة في RT في الظلام.
- إضافة 500 ميكرولتر من العازلة FACS وتصفية الخلايا باستخدام أنابيب اختبار البوليسترين مخروطية لإزالة الخلايا المجمعة.
- جهاز طرد مركزي عند 400 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق.
- إضافة 500 ميكرولتر من الملحق الخامس العازلة ملزمة لكل أنبوب وإعادة الإنفاق.
- تحليل باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن نصف بروتوكول الحصول على كرويدات من خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم المتنوعة. وكان مطلوبا مكملات مع ميثيلسليلوز لتوليد كرويدات. كما نقدم طريقة لإعداد LCFS وتقديم نموذج لدراسة العلاقة بين البروبيوتيك وسرطان القولون والمستقيم. يتم توضيح تشكيل كروي وبروتوكولات إعداد LCFS تخطيطيا في الشكل 1A،B. كما هو مبين في الشكل 2A، تركيز ميثيلسليلوز من 0.6 ٪ يحول الخلايا السرطانية إلى كرويدات مدمجة. تشير هذه النتيجة إلى أنه يمكن توليد كرويدات من عدة أنواع من سرطان القولون والمستقيم باستخدام بروتوكول ميثيلسليلوز الخاص بنا. بعد ذلك ، تم علاج كرويدات مع 25 ٪ LCFS ودرس مورفولوجيا بعد 48 ساعة باستخدام المجهر الخفيف. كما هو مبين في الشكل 3A، أظهرت كرويدات المجموعات المعالجة ب LCFS أسطحا معطلة. للتحقيق في الآثار المضادة للسرطان من LCFS بتركيزات مناسبة, تم علاج كرويدات ل 48 ح مع جرعات مختلفة من LCFS: 0 (السيطرة), 6٪, 12.5٪, و 25٪. ولوحظت اضطرابات في مورفولوجيا كروية في كرويات تعامل مع 25٪ LCFS، كما هو مبين في الشكل 3B. بالإضافة إلى ذلك ، تم علاج الكرويات بنسبة 25٪ LCFS لمدة 24 ساعة و 48 ساعة ، ولوحظت اضطرابات في مورفولوجيا كروية بعد 48 ساعة من العلاج. وتظهر الصور المجهرية للسفيرات في الشكل 3C.
بعد 48 ساعة، تم تقييم العينات مع اختبار صلاحية الخلية، ولوحظ موت الخلايا السرطانية القولون والمستقيم عند العلاج مع LCFS بطريقة تعتمد على الجرعة، وارتفاع كمية LCFS أعلى وفاة الخلية الملاحظة(الشكل 3D). نحن، ثم، ملطخة العينات مع يوديد البروبيديوم (PI) لمراقبة موت الخلايا المبرمج. كما هو متوقع، كان تحريض موت الخلايا المبرمج يعتمد على جرعة LCFS(الشكل 4A، B، C). تم إجراء RT-PCR للكشف عن التغيرات في العلامات الجزيئية لداء الخلايا المبرمج أي BAX و BAK و NOXA(الشكل 5A، B). وأخيرا، تمت دراسة علامات موت الخلايا المبرمج باستخدام النشاف الغربي وملحقات V/7AAD من خلال FACS(الشكل 6A، B، C، D). تظهر هذه الملاحظات أن LCFS تسبب بشكل فعال في موت الخلايا المبرمج في النموذج ثلاثي الأبعاد.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لتشكيل كروي وإعداد LCFS.
(أ)يتم تمييز صور التمثيل التخطيطي لبروتوكول توليد LCFS ب (i-iv) (B) يتم تمييز مخططات تشكيل كروي بوساطة الميثيلسليلوز ب (i-iii). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تشكيل كروي بوساطة الميثيلسليلوز.
(أ) صور تمثيلية لتشكيل كروية بوساطة ميثيلسليلوز من HT-29، DLD1، وWiDr. تم زرع الخلايا في المرفقات منخفضة للغاية 96-جيدا لوحات القاع جولة مع تركيزات ميثيلسليلوز من 0.1-1.2٪ لمدة 48 ساعة. شريط المقياس 10 ميكرومتر (n = 3 لكل تجربة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم تركيز LCFS ومورفولوجيا كروية.
(أ) صور تمثيلية ل HT-29 المعالجة ب LCFS لمدة 48 ساعة. شريط المقياس 100 ميكرومتر. (ب) HT-29، DLD1، و WiDr كرويدات تعامل مع جرعات متزايدة من LCFS لمدة 48 ساعة. وقد تعطلت جميع كرويات حواف في 12.5-25٪ LCFS. مقياس شريط 20 ميكرومتر (ن = 3 لكل تجربة) (C) مورفولوجيا كروية من HT-29، DLD1، وشفرات WiDr تعامل مع 25٪ LCFS لمدة 24 و 48 ساعة. مقياس شريط 20 ميكرومتر (ن = 3) (D) قياس صلاحية الخلية، كما هو موضح في المتوسط ± SEM. ***، P < 0.05 (ن = 3 لكل تجربة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تلطيخ يوديد البروبيديوم للشفرات.
صور تمثيلية من PI تلطيخ في (أ) HT-29، (ب) DLD1، و (C) WiDr كرويدات بعد 48 ساعة من العلاج LCFS. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر مضان وتم قياس الزيادة في كثافة PI باستخدام شريط مقياس الصورة J. 10 ميكرومتر. يتم عرض متوسط ± SEM. ، P < 0.05 (n = 3 لكل تجربة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تم تحديد علامات موت الخلايا المبرمج باستخدام qRT-PCR.
تم قياس علامات موت الخلايا المبرمج، مثل BAX و BAK و NOXA. يتم تقديم الكمية مرنا كتعبير نسبي تطبيع إلى (أ) β-أكتين و (ب) 18s rRNA. يتم عرض متوسط ± SEM. ، P < 0.05 (n = 3 لكل تجربة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تم تحديد علامات موت الخلايا المبرمج عن طريق النشاف الغربي وتحليل FACS للشفرات.
يظهر في الشكل بقع غربية من (A) HT-29 ، (B) DLD1 ، و (C) خلايا WiDr بعد علاج LCFS. تم الكشف عن PARP1، BCL-XL، وp-IκBα. β-أكتين كان يستخدم كرقابة داخلية. (د)تحليل FACS من موت الخلايا المبرمج في HT-29، DLD1، وشفرات WiDr المحتضنة مع LCFS. تم الكشف عن الخلايا المبرمج من خلال زيادة كثافة الفلورية من الملحق V-FITC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| رد فعل | الحجم لكل واحد 20 ميكرولتر |
| 2X مزيج qPCR | 10 ميكرولتر |
| التمهيدي الأمامي (10 pmols / μL) | 1 ميكرولتر |
| التمهيدي العكسي (10 pmols / μL) | 1 ميكرولتر |
| cDNA (50 نانوغرام/ميكرولتر) | 1 ميكرولتر |
| PCR درجة المياه | 7 ميكرولتر |
الجدول 1: خليط تفاعل PCR.
| التمهيدي | تسلسل |
| BAX إلى الأمام | سي سي سيغاغاغكتكتاتكاتكغاغ |
| BAX عكس | سي سي أي سي سي كاتجاتغكتغاتغات |
| باك إلى الأمام | أجتكاتكاتككتغا |
| BAK-عكس | تكتاغاتكغغاتغاتغاتكغ |
| نوسا إلى الأمام | أكاغسكغاتغاتغغغات |
| NOXA عكس | أكتغكاتكتغتكتكجتغ |
| 18s rRNA إلى الأمام | غاتغغغكغاغاتاتاغ |
| 18s rRNA عكس | جي جي جي غاكتكتغاتااتغ |
| β أكتين إلى الأمام | تكتجتغكاتكاكاغاكت |
| β أكتين عكس | غاغكاتات غغغغغاغات |
الجدول 2: تسلسلات التمهيدي المستخدمة في تحليل qRT-PCR.
| مرحلة | درجة الحرارة (درجة مئوية) | الوقت |
| التشبع الأولي | 95 | 10 دقائق |
| 40 دورة: | ||
| الخطوة الأولى | 95 | 15 ثانية |
| الخطوة الثانية | 60 | 60 ثانية |
| مرحلة منحنى الذوبان | 95 | 15 ثانية |
| 60 | 60 ثانية | |
| 95 | 15 ثانية | |
الجدول 3: شروط إعادة الإعمار و إعادة الإعمار.
| جسم | التخفيف |
| PARP 1 (C2-10) | 1:1000 |
| BCL-XL (H-5) | 1:1000 |
| p-IκBα (B-9) | 1:1000 |
| β-أكتين (C4) | 1:1000 |
| الماعز المضادة للفأرة IgG (H + L) | 1:2500 |
| الماعز المضادة الأرنب IgG (H + L) | 1:2500 |
الجدول 4: الأجسام المضادة المستخدمة في تحليل البقع الغربية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البيئة الدقيقة للأنسجة، بما في ذلك الخلايا المجاورة والمصفوفة خارج الخلية (ECM)، أمر أساسي لتوليد الأنسجة وحاسمة في السيطرة على نمو الخلايا وتطوير الأنسجة13. ومع ذلك ، فإن الثقافات 2D لها العديد من العيوب ، مثل تعطيل التفاعلات الخلوية ، وكذلك التعديلات في مورفولوجيا الخلايا ، والبيئات خارج الخلية ، ونهج القسم14. وقد درست بدقة نظم زراعة الخلايا 3D لتحسين إنتاج في آثار الجسم الحي, وثبت كأنظمة أكثر دقة لاختبار السرطان في المختبر15,16. هناك حاجة لأنظمة نموذجية للتنبؤ بدقة أكبر الاستجابات الشخصية للعلاج الكيميائي17.
تم تطوير السقالات ثلاثية الأبعاد لهندسة الأنسجة. وهو بمثابة فقدان بديل ل ECM ، مما يمثل المساحة المتاحة للخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك ، توفر السقالات تفاعلات مادية لتصاق الخلايا وانتشارها وتسبب الخلايا في تشكيل التوزيعات المكانية المناسبة وتفاعلات الخلية ECM أو الخلية الخلية18. وقد تم دراسة البوليمر methylcellulose (MC) باستمرار لتحديد مدى ملاءمتها في توليد أنظمة هيدروجيل MC المستندة للتطبيقات في هندسة ثقافة الخلية 3D19،20. ومع ذلك ، فإن دمج سليمة من هذه الهيدروجيلات في المواد الحيوية مثل شبكات الخلايا 3D لا يزال تحديا من الناحية الفنية21. ولذلك، فإن بروتوكول تشكيل كروي المعروضة هنا توصي المعايرة من تركيزات MC والتحسين مع نقاط زمنية مختلفة لكل خط خلية لجنة حقوق الطفل. يمكن أن تؤثر الخصائص الخاصة بخط الخلية، مثل تجميع الخلايا وقابليتها للحياة والوفاة، بشكل كبير على كل حالة من الحالات التي اختبرناها. يمكن أن توفر هذه الطريقة وسيلة لتوليد كرويات موحدة لاختبار LCFS على الخلايا السرطانية.
البروبيوتيك, وهي البكتيريا المفيدة, إنتاج الأيض النشطة التي يمكن أن تحاكي الآثار المضادة للسرطان. وهكذا، تم تصميم دراستنا لعزل بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) واختبار الآثار المضادة للسرطان من مقتطفات الأيض من الخلايا الخالية من الخلايا (CFS). قدمت دراساتنا طريقة لمراقبة آثار الخلايا التخمير L. supernatants الخالية من الخلايا التي تحفز موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية القولون والمستقيم في نظام 3D. يتم تحريض مستويات الحمض النووي الريبي من علامات موت الخلايا المبرمج المشاركة في مسارات المبرمج بشكل كبير بعد التعرض LCFS في ظروف 3D. وعلاوة على ذلك، تم التعبير عن انخفاض مستويات PARP1 و BCL-XL في التحكم الكروي ثلاثي الأبعاد المعالج من LCFS مقارنة بالتحكم في الشكل 4C,D,E. لوحظ أيضا تثبيط تنشيط NF-κB في الثقافات ثلاثية الأبعاد بعد العلاج باستخدام LCFS. وتشمل مزايا زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد مجتمعة زيادة التفاعلات بين الخلايا والاستجابات لجزيئات الإشارات لمحاكاة أفضل في أنظمة الجسم الحي. النشاف الغربي باستخدام كرويات يمكن أن يؤدي إلى رؤى كمية في حالة جزيئات الإشارات المختلفة.
خطوط الخلايا لها بعض القيود كنماذج ما قبل السريرية لأبحاث السرطان. في الآونة الأخيرة ، وقد استخدمت الأجهزة السرطانية في النمذجة من العلاج الشخصي المضاد للسرطان22،23. ومن المتوقع أن يستخدم علاج LCFS مع البروبيوتيك في organoids كمنصة قوية لاختبار الآثار المضادة للسرطان. وعلاوة على ذلك، اختبرنا واحد فقط من الأنواع Lactobacillus بين البروبيوتيك المختلفة في نموذج السرطان. البروبيوتيك المختلفة هي, أيضا, يجري اختبارها للوقاية من متلازمة التمثيل الغذائي, المناعي, والاضطرابات العصبية24,25,26. LCFS من Bifidobacterium, Saccharomyces, المكورات العقدية, المكورات المعوية, وأنواع أكرمانسيا هي المرشحين المحتملين لاختبار الفوائد الصحية من خلال أنواع مختلفة من نماذج المرض27,28,29.
استنادا إلى هذه الدراسة، يمكن استنتاج أن فهم الإشارات في كرويدات والاستجابات المختلفة لعلاج LCFS في نماذج ثلاثية الأبعاد قد تكون مفيدة لاختبار الآثار المضادة للسرطان باستخدام الطريقة التي اقترحناها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر نماذج السرطان ثلاثية الأبعاد العديد من المزايا غير الممكنة مع الطبقات الأحادية التقليدية ثلاثية الأبعاد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يملك صاحبا البلاغ أي إفصاحات مالية ذات صلة.
Acknowledgments
وقد دعم هذا البحث "وضع معايير قياس الكيمياء والإشعاع"، ورقم المنحة KRISS-2020-GP2020-0003، و"تطوير معايير القياس والتكنولوجيا للمواد الحيوية والتقارب الطبي"، ورقم المنحة KRISS-2020-GP2020-0004، بتمويل من المعهد الكوري للبحوث للمعايير والعلوم. كما تم دعم هذا البحث من قبل وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (MSIT)، والمؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (NRF-2019M3A9F3065868)، ووزارة الصحة والرعاية الاجتماعية (MOHW)، والمعهد الكوري لتنمية الصناعة الصحية (KHIDI، HI20C0558)، ووزارة التجارة والصناعة والطاقة (MOTIE)، ومعهد التقييم الكوري للتكنولوجيا الصناعية (KEIT، 20009350). معرف ORCID (هي مين يو: 0000-0002-5951-2137; دوكجين كانغ: 0000-0002-5924-9674; سيل كيم: 0000-0003-3465-7118; جو أون لي: 0000-0002-2495-1439; جينا لي: 0000-0002-3661-3701). نشكر تشانغ وو بارك للمساعدة في التجارب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti - p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
References
- Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
- Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
- Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
- Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
- Harish, K., Varghese, T.
- Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557 (2019).
- Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886 (2018).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
- Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
- Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
- Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
- Drost, J., Clevers, H.
- Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
- Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F.
- Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
- Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
- Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711 (2019).
- Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).
