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Cancer Research

कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं की त्रि-आयामी स्फेरॉइड संस्कृतियों में प्रोबायोटिक्स के सेल-फ्री सुपरनेंट का उपयोग करके सेल डेथ का मूल्यांकन करना

Published: June 13, 2020 doi: 10.3791/61285
Automatic Translation
*1,2, *3, 1,4,5, 1, 1
1Microbiological Analysis Team, Group for Biometrology, Korea Research Institute of Standards and Science (KRISS), 2College of Pharmacy, Chungnam National University (CNU), 3Stem Cell Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), 4Convergent Research Center for Emerging Virus Infection, Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT), 5Department of Bio-Analysis Science, University of Science & Technology (UST)
* These authors contributed equally

Summary

यहां लैक्टोबेसिलस सेल-फ्री सुपरनेट (एलसीएफएस) के कैंसर विरोधी प्रभावों को समझने के लिए तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं। कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनें 3 डी संस्कृतियों में एलसीएफएस के साथ इलाज करते समय सेल से होने वाली मौतों को दिखाती हैं। पाड़ के आधार पर गोलाकार पैदा करने की प्रक्रिया को अनुकूलित किया जा सकता है और प्रस्तुत विश्लेषण विधियों में शामिल सिग्नलिंग रास्तों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी होते हैं।

Abstract

यह पांडुलिपि लैक्टोबेसिलस किण्वन सेल संस्कृति से सुपरनेटेंट का उपयोग करके कैंसर कोशिकाओं के बहुकोशिकीय प्रकार के तीन आयामी (3 डी) स्फेरॉइड में कैंसर सेल से होने वाली मौतों का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करतीहै, जिसे प्रोबायोटिक्स संस्कृतियों के रूप में माना जाता है। लैक्टोबेसिलस सेल-फ्री सुपरनैंट (एलसीएफएस) का परीक्षण करने के लिए 3डी संस्कृतियों का उपयोग 2डी मोनोलेयर्स में परीक्षण की तुलना में बेहतर विकल्प है, खासकर एल किण्वनम आंत के भीतर कैंसर विरोधी प्रभाव पैदा कर सकता है। एल किण्वितम सुपरनेटेंट की पहचान 3 डी संस्कृति स्थितियों में कई कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) कोशिकाओं के खिलाफ बढ़ी हुई एंटी-प्रोलिफेरेटिव प्रभाव के अधिकारी के लिए की गई थी। दिलचस्प बात यह है कि ये प्रभाव दृढ़ता से संस्कृति मॉडल से संबंधित थे, जो कैंसर सेल की मौत को प्रेरित करने के लिए एल किण्वनम की उल्लेखनीय क्षमता का प्रदर्शन करते थे। नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करके विविध सीआरसी (कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं) से स्थिर स्पेरोइड उत्पन्न हुए थे। 3डी स्फेरॉइड पैदा करने का यह प्रोटोकॉल समय की बचत और लागत प्रभावी है। इस प्रणाली को आसानी से सीआरसी स्फेरॉइड के कई प्रकार में LCFS के कैंसर विरोधी प्रभावों की जांच करने के लिए विकसित किया गया था । जैसा कि अपेक्षित था, सीआरसी स्पेरोइड्स ने प्रयोग के दौरान एलसीएफएस के साथ दृढ़ता से प्रेरित सेल डेथ का इलाज किया और क्यूआरटी-पीसीआर, वेस्टर्न ब्लॉटिंग और एफएसीएस विश्लेषण द्वारा विश्लेषण के अनुसार विशिष्ट एपोप्टोसिस आणविक मार्कर व्यक्त किए। इसलिए, यह विधि सेल व्यवहार्यता की खोज और कैंसर रोधी दवाओं की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए मूल्यवान है।

Introduction

प्रोबायोटिक्स आंत में सबसे लाभप्रद सूक्ष्मजीव हैं जो प्रतिरक्षा होरोस्टेसिस और मेजबान ऊर्जा चयापचय में सुधार करते हैं1। लैक्टोबेसिलस और बिफिडोबैक्टीरियम से प्रोबायोटिक्स आंत2,3में पाए जाने वाले अपनी तरह का सबसे उन्नत है। पिछली जांचों से पता चला है कि लैक्टोबेसिलस का कई कैंसरों पर निरोधात्मक और एंटीप्रोफेरेटिव प्रभाव है, जिसमें कोलोरेक्टल कैंसर4शामिल हैं । इसके अलावा, प्रोबायोटिक्स भड़काऊ आंत्र रोगों, क्रोन की बीमारी, और अल्सर कोलाइटिस5,6 कोरोकतेहैं। हालांकि, प्रोबायोटिक्स के साथ अधिकांश अध्ययन दो आयामी (2D) मोनोलेयर में किए गए थे जो ठोस सतहों पर उगाए जाते हैं।

कृत्रिम संस्कृति प्रणालियों में पर्यावरणीय सुविधाओं की कमी है, जो कैंसर कोशिकाओं के लिए स्वाभाविक नहीं है । इस सीमा को दूर करने के लिए, तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों को7,8विकसित किया गया है। 3 डी में कैंसर कोशिकाएं बुनियादी जैविक तंत्रों के संदर्भ में सुधार दिखाती हैं, जैसे सेल व्यवहार्यता, प्रसार, आकृति विज्ञान, सेल-सेल संचार, दवा संवेदनशीलता, और वीवो प्रासंगिकता9,10में। इसके अलावा, गोलाकार कोलोरेक्टल कैंसर के बहुकोशिकीय प्रकार से बने होते हैं और सेल-सेल इंटरैक्शन और एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम)11पर निर्भर होते हैं। हमारे पिछले अध्ययन में बताया गया है कि लैक्टोबेसिलस किण्वनम का उपयोग करके उत्पादित प्रोबायोटिक सेल-फ्री सुपरनैक्टेंट (सीएफएस) ने कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) कोशिकाओं12की 3 डी संस्कृतियों पर कैंसर विरोधी प्रभाव दिखाया। हमने प्रस्ताव किया कि सीएफएस 3डी स्फेरॉइड12पर प्रोबायोटिक प्रभावों के परीक्षण के लिए एक उपयुक्त वैकल्पिक रणनीति है ।

यहां, हम एक दृष्टिकोण पेश करते हैं जो कई 3 डी कोलोरेक्टल कैंसर की नकल प्रणालियों पर प्रोबायोटिक सेल-फ्री सुपरनेट (सीएफएस) के चिकित्सीय प्रभावों के विश्लेषण के लिए बहुकोशिकीय प्रकार के 3 डी कोलोरेक्टल कैंसर को समायोजित कर सकता है। यह विधि विट्रो में संबंधित प्रोबायोटिक और कैंसर विरोधी प्रभावों के विश्लेषण के लिए एक साधन प्रदान करती है।

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Protocol

1. बैक्टीरियल सेल संस्कृतियों और लैक्टोबेसिलस सेल-फ्री सुपरनेट (एलसीएफएस) की तैयारी

नोट: चरण 1.2 - 1.9 एक एनारोबिक कक्ष में आयोजित किए जाते हैं।

  1. एक एमआरएस एगर प्लेट और शोरबा तैयार करें जिसमें एल-सिस्टीन होता है और ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल करें।
  2. एच 2 एनारोबिक चैंबर में एमआरएस आगर प्लेट को20 पीपीएम ऑक्सीजन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया है।
  3. गल लैक्टोबेसिलस बैक्टीरियल स्टॉक और बैक्टीरियल कल्चर(चित्रा 1A (i)के साथ आगर प्लेट टीका लगाते हैं।
  4. एच 2 एनारोबिक चैंबर में 37 डिग्री सेल्सियस और20 पीपीएम ऑक्सीजन में 2 - 3 दिनों के लिए बैक्टीरिया को 37 डिग्री सेल्सियस और एकल जीवाणु उपनिवेशों प्राप्त होने तक 20 पीपीएम ऑक्सीजन के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. हंगरेट टाइप एनरोबिक कल्चर ट्यूब को धोकर सुखा लें। 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति ट्यूब को ऑटोक्लेव करें।
  6. इसके बाद एच2 एनारोबिक चैंबर में ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस और ऑक्सीजन को हटाने के लिए 20 पीपीएम ऑक्सीजन में इनक्यूबेट करें।
  7. ट्यूब में श्रीमती शोरबा के 2 - 3 एमएल रखें। एक ब्यूटिल रबर डाट के साथ ट्यूब सील और टोपी पेंच।
  8. एक पाश के साथ एक कॉलोनी प्राप्त करें और इसे 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ 1.5 एमएल कल्चर ट्यूब में रखें। (चित्रा 1A (ii)) ।
  9. 1 एमएल सिरिंज(चित्रा 1A (iii)का उपयोग करके कॉलोनी को निलंबित करें। ऐसा करके करें, ट्यूब ढक्कन के केंद्र में 1 मिलील सिरिंज की सुई डालें, निलंबित कॉलोनी को एस्पिरेशन करें और फिर इसे वापस एमआरएस शोरबा मीडिया में फिर से खर्च करें। (चित्रा 1A (iv)) ।
  10. 2 दिनों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 200आरपीएम) के लिए एक शेकर इनक्यूबेटर में एमआरएस शोरबा मीडिया को इनक्यूबेट करें।
  11. ऑड 620 पर अवशोषण2.0 तक पहुंचने तक बैक्टीरियल विकास घटता की निगरानी करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को मापें।
  12. 15 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा बैक्टीरियल छर्रों और वातानुकूलित मीडिया को अलग करें। एकत्र बैक्टीरियल छर्रों को 1x पीबीएस के साथ धोएं और आरपीएमआई 1640 के 4 एमएल में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक हुए पुनर्संकल करें। माध्यम में किसी भी एंटीबायोटिक दवाओं को शामिल न करें।
  13. आरपीएमआई में बैक्टीरियल छर्रों को बनाए रखें और 100 आरपीएम की गति से 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर4 घंटे के लिए शेकर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  14. प्रोबायोटिक सुपरनेट की तैयारी के लिए, 1000 x gपर अपकेंद्रित्र के माध्यम से बैक्टीरियल गोली को हटा दें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए। बाँझ-0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके बरामद सुपरनेट्टर को फ़िल्टर करें और उपयोग होने तक −80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. गोलाकारों का उत्पादन

  1. कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों की तैयारी
    1. डीएलडी-1, एचटी-29, और वाईडीआर सेल लाइनों को मोनोलेयर के रूप में 70-80% तक बढ़ाएं और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर (ग्रोथ मीडियम: आरपीएमआई युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिकिलिन-स्ट्रेप्टॉमीसिन में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    2. 100 मिमी पेट्री डिश में उगाई जाने वाली कोशिकाओं के लिए, 1x पीबीएस के 4 एमएल के साथ दो बार प्लेट धोएं। कोशिकाओं को अलग करने के लिए 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 0.25% ट्राइपसिन-ईडीटीए का 1 एमसीएल जोड़ें और पेट्री डिश को 37 डिग्री सेल्सियस पर2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. इनक्यूबेशन के बाद, माइक्रोस्कोप के नीचे सेल वियोजन की जांच करें और 5 एमएल विकास माध्यम के साथ ट्राइप्सिन-ईडीटीए को बेअसर करें।
    4. 300 x ग्रामपर 3 मिनट के लिए 15 एमएल शंकु नली और अपकेंद्रित्र के लिए अलग कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
    5. सुपरनेट को त्यागें और विकास मीडिया के 3 एमएल के साथ धीरे-धीरे रीसस्टॉन करें।
    6. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए ट्राइपैन ब्लू के साथ कोशिकाओं की गणना करें। (चित्रा 1B (i))
  2. स्फेरॉइड फॉर्मेशन
    1. एक 15 एमएल शंकु नली में, कोशिकाओं को 2.1.5 से पतला करने के लिए 1 - 2 x 105 कोशिकाओं/
    2. कोशिका निलंबन में 0.6% मिथाइलसेलुलोस की अंतिम एकाग्रता जोड़ें और पतला कोशिकाओं को बाँझ जलाशय में स्थानांतरित करें।
      नोट: प्रत्येक सेल लाइन के लिए, जरूरत मिथाइलसेल्यूलोस की मात्रा को तदनुसार और निर्धारित किया जाना चाहिए।
    3. अल्ट्रा-कम अटैचमेंट 96-अच्छी तरह से राउंड बॉटम माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं में 200 माइक्रोल कोशिकाओं को वितरित करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें। (चित्रा 1B (iii))
    4. 24 - 36 घंटे के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. 24 - 36 घंटे के बाद, स्फेरॉइड गठन सुनिश्चित करने के लिए एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे प्लेट का निरीक्षण करें।

3. एलसीएफएस के साथ 3 डी कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं का इलाज

  1. चरण 2 और 3 में वर्णित स्फेरॉइड उत्पन्न करें।
  2. एलसीएफ उपचार करने से पहले, 10 -20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर जमे हुए एलसीएफएस को पिघला दें।
  3. एलसीएफ स्टॉक समाधान को विकास माध्यम में टीका लगाएं। क्रमिक रूप से विकास माध्यम में 25%, 12.5%, और 6% तक पतला (यानी, 25% एलसीएफ = 150 माइक्रोन विकास माध्यम + 50 μL एलसीएफएस के)।
  4. इनक्यूबेटर से गोलाकार युक्त सेल संस्कृति प्लेट को बाहर निकालें और 200 माइक्रोल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से जितना संभव हो उतना विकास माध्यम हटा दें।
  5. कोशिकाओं पर एलसीएफएस के साथ विकास मीडिया जोड़ें और24 - 48 घंटे के लिए 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: उपयोग की जाने वाली मात्रा इस प्रकार प्लेट आकार पर निर्भर करेगी: 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों के लिए 2 एमएल; 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों के लिए 200 μL।

4. स्फेरॉइड के लिए सेल व्यवहार्यता

  1. तैयार 8 - 10 एलसीएफएस-इलाज कोलोरेक्टल कैंसर अपारदर्शी दीवारों वाली बहु-अच्छी प्लेटों में गोलाकार (एलसीएफएस उपचार के बाद सेल व्यवहार्यता परख 48 घंटे की जाती है)।
  2. रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल व्यवहार्यता अभिकर्ण (सामग्री की तालिकादेखें) को पिघलाएं।
  3. उपयोग से पहले कमरे के तापमान के लिए सेल व्यवहार्यता अभिकर्षक को बराबर करें।
  4. परख करने से पहले, स्पेरोइड से विकास मीडिया का 50% निकालें।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से सेल व्यवहार्यता अभिकर्ण के 100 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: मात्रा का उपयोग किया जाना इस प्रकार प्लेट आकार पर निर्भर करेगा: 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों के लिए 100 माइक्रोन।
  6. सेल लाइसिस को बढ़ावा देने के लिए 5 मिनट के लिए रिएजेंट को सख्ती से मिलाएं।
  7. 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट - 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे।
  8. ल्यूमिनेसेंस रिकॉर्ड करें।

5. गोलाकारों के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पॉलीमरेज चेन रिएक्शन विश्लेषण

  1. प्रत्येक स्थिति के लिए, 2 एमएल ट्यूब में 10 - 15 स्फेरॉइड तैयार करें और 400 x ग्रामपर 3 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें।
  2. सुपरनेट को छोड़ दें और बर्फ-ठंडे 1x पीबीएस के 1 मिलील में दो बार स्फेरॉइड धोएं।
    नोट: अपकेंद्रित्र से बचें, स्फेरॉइड को व्यवस्थित होने दें।
  3. जितना संभव हो 1x पीबीएस के रूप में अधिक aspirate और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर आरएनए अलग ।
  4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके आरएनए के 1 माइक्रोग्राम से सीडीएनए का संश्लेषण करें।
  5. ट्रिपलीकेट में सभी नमूनों को चलाने के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करें (तालिका 1 और तालिका 2देखें)।
  6. प्रत्येक क्यूपीसीआर प्लेट में टेम्पलेट मास्टर मिश्रण के 20 माइक्रोन में प्रवर्धन अच्छी तरह से करें।
  7. प्रतिक्रियाओं को अच्छी तरह से मिलाएं और यदि आवश्यक हो तो स्पिन करें।
  8. साधन निर्माता(तालिका 3)की सिफारिशों के अनुसार नमूने चलाएं।

6. स्फेरॉइड से पश्चिमी ब्लॉटिंग

नोट: गोलाकार इकट्ठा करते समय, 200 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करें और उनकी संरचना को परेशान करने से बचने के लिए सुझावों के अंत में कटौती करें।

  1. प्रत्येक स्थिति के लिए, 2 एमएल ट्यूब में 30 - 40 स्फेरॉइड तैयार करें।
  2. ट्यूब को बर्फ पर रखें और स्पेरोइड्स को 2 एमएल ट्यूब के नीचे बसने दें।
  3. सुपरनेट को त्यागें और 1 मिलील आइस-कोल्ड 1x पीबीएस में दो बार स्फेरॉइड धोएं
    नोट: अपकेंद्रित्र से बचें, स्फेरॉइड को व्यवस्थित होने दें।
  4. जितना संभव हो 1x पीबीएस के रूप में अधिक से अधिक aspirate और एक प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल के साथ रिपा बफर जोड़ें (10 spheroids = रिपा बफर के 30 माइक्रोन) ।
  5. कोशिकाओं को ऊपर और नीचे पाइपिंग करके और 10 चक्रों के लिए बर्फ पर आराम करने के 30 एस के साथ 30 एस के लिए सोनीशेशन का प्रदर्शन करें।
  6. सेंटीफ्यूज प्रोटीन 15000 एक्स ग्राम पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जाता है।
  7. प्रत्येक कोशिका के लिए प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।
  8. लोड होने से पहले, प्रत्येक सेल को 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर एक नमूना बफर में उबालें।
  9. एसडीएस-पेज जेल के कुओं में प्रोटीन की समान मात्रा लोड करें और 100 वी पर 1 - 2 घंटे के लिए जेल चलाएं।
  10. प्रोटीन को जेल से पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित करें।
  11. स्थानांतरित करने के बाद, एक अवरुद्ध बफर (0.05% ट्वीन-20 के साथ 5% स्किम मिल्क + टीबीएस) का उपयोग करके कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए झिल्ली को अवरुद्ध करें।
  12. 1x टीबीएसटी में प्राथमिक एंटीबॉडी(टेबल 4) के 1:1,000कमजोर पड़ने के साथ झिल्ली को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5% बीएसए बफर के साथ रात भर इनक्यूबेट करें।
  13. झिल्ली को टीबीस्ट के साथ तीन बार धोएं, प्रत्येक धोने के लिए 15 मिनट।
  14. 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अवरुद्ध बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी के 1:2,500 कमजोर पड़ने के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें (सामग्रियों की तालिकादेखें)।
  15. झिल्ली को टीबीस्ट के साथ तीन बार धोएं, प्रत्येक धोने के लिए 15 मिनट।
  16. एक रसायनिनसेंट सब्सट्रेट के साथ एचआरपी डिटेक्शन के लिए झिल्ली तैयार करें।
  17. रसायनरहित छवियों को प्राप्त करें।

7. प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) स्फेरॉइड का धुंधला

  1. चरण 4.1 में वर्णित 5-10 गोलाकार तैयार करें और स्पेरोइड्स को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक इनक्यूबेटर मेंरखें।
  2. 1x पीबीएस में पीआई 1:100 का 1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक पतला करें।
  3. 96-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं से माध्यम का 50% निकालें।
  4. प्रत्येक कुएं में पीआई समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें और कुओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखें और 10 - 15 मिनट के लिए 5% सीओ2।
  5. 1x पीबीएस के साथ पीआई समाधान को धोएं।
  6. विकास माध्यम के 200 μL जोड़ें और एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक छवि ले लो। स्पेरोइड की व्यवहार्यता गणना प्राप्त करने के लिए इमेज जे का उपयोग करके फ्लोरेसेंस तीव्रता का विश्लेषण करें।

8. स्फेरॉइड का FACS विश्लेषण

  1. पहले वर्णित स्फेरॉइड उत्पन्न करें।
  2. प्रत्येक स्थिति के लिए, 400 एक्स जी और आरटी पर 3 मिनट के लिए एक FACS ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 30 - 40 स्फेरोइड तैयार करें।
  3. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और 1x पीबीएस के 3 एमएल में स्फेरॉइड धोएं, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें।
  4. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 200 माइक्रोल जोड़ें, फिर 2 -3 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: इनक्यूबेशन समय गोलाकार आकार और सेल प्रकार पर निर्भर है।
  5. 1 एमएल एफएएफएस बफर जोड़ें और धीरे-धीरे 200 माइक्रोल पिपेट का उपयोग करके गोलाकार को अलग करें।
  6. 400 x ग्राम और 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अलग कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें।
    नोट: FACS बफर = 1x पीबीएस + 2.5% एफबीएस, 0.22 माइक्रोन टॉप फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया।
  7. सुपरनेट को त्यागें और 7-AAD/एनेक्सटिन वी रिएजेंट (7AAD (5 माइक्रोन), एनेक्सटिन वी (5μL) /नमूना जोड़ें ।
  8. धीरे से कोशिकाओं भंवर और अंधेरे में आरटी में 13-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  9. 500 μL FACS बफर जोड़ें और कुल कोशिकाओं को दूर करने के लिए शंकु पॉलीस्टीरिन टेस्ट ट्यूब का उपयोग कर कोशिकाओं को फ़िल्टर करें।
  10. 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज और 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
  11. प्रत्येक ट्यूब और रिसिपेंड में एनेक्सटिन वी बाइंडिंग बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें।
  12. एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके विश्लेषण करें।

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Representative Results

हम विविध कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों से गोलाकार प्राप्त करने के प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। मेथेरोइड उत्पन्न करने के लिए मिथाइलसेलुलोस के साथ पूरकता की आवश्यकता थी। हम एलसीएफएस तैयारी की एक विधि भी पेश करते हैं और प्रोबायोटिक्स और कोलोरेक्टल कैंसर के बीच सहसंबंध का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल पेश करते हैं। स्फेरॉइड गठन और एलसीएफएस तैयारी प्रोटोकॉल को चित्र 1ए,बीमें योजनाबद्ध ढंग से दर्शाया गया है। जैसा कि चित्रा 2 एमें दिखाया गया है, 0.6% की मिथाइलसेलुलोस एकाग्रता कैंसर कोशिकाओं को कॉम्पैक्ट स्फेरॉइड में बदल देती है। यह परिणाम इंगित करता है कि हमारे मिथाइलसेल्यूलोज प्रोटोकॉल का उपयोग करके कई प्रकार के कोलोरेक्टल कैंसर से स्फेरॉइड उत्पन्न किए जा सकते हैं। इसके बाद, स्फेरॉइड का इलाज 25% एलसीएफएस के साथ किया गया और हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 48 एच के बाद आकृति विज्ञान का अध्ययन किया गया। जैसा कि चित्र 3 एमें दिखाया गया है, एलसीएफएस के साथ इलाज किए गए समूहों के गोलाकारों ने बाधित सतहों का प्रदर्शन किया। उपयुक्त सांद्रता पर एलसीएफएस के कैंसर विरोधी प्रभावों की जांच करने के लिए, एलसीएफएस के विभिन्न खुराकों के साथ 48 घंटे के लिए स्फेरॉइड का इलाज किया गया: 0 (नियंत्रण), 6%, 12.5%, और 25%। 25% एलसीएफएस के साथ इलाज किए गए गोलाकार आकृति विज्ञान में व्यवधान देखा गया, जैसा कि चित्र 3बीमें दिखाया गया है। इसके अलावा, 24 एच और 48 एच के लिए 25% एलसीएफएस के साथ स्फेरॉयड का इलाज किया गया, और 48 एच के उपचार के बाद स्फेरॉइड आकृति विज्ञान में व्यवधान देखे गए। स्फेरॉइड की सूक्ष्म छवियां चित्र 3 सीमें दिखाई जाती हैं।

48 घंटे के बाद, नमूनों को सेल व्यवहार्यता परख के साथ मूल्यांकन किया गया, और खुराक पर निर्भर तरीके से एलसीएफएस के साथ उपचार पर कोलोरेक्टल कैंसर सेल डेथ देखी गई, एलसीएफएस राशि अधिक देखी गई सेल डेथ(चित्रा 3 डी)से अधिक हो गई। इसके बाद हमने एपोप्टोसिस का निरीक्षण करने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ नमूनों को दाग दिया । जैसा कि उम्मीद थी, एपोप्टोसिस का शामिल करना एलसीएफएस खुराक(चित्रा 4ए, बी, सी)पर निर्भर था। आर टी-पीसीआर को एपोप्टोसिस यानी बैक्स, बाक्स और एनओएक्सए(चित्रा 5ए, बी)के आणविक मार्कर में बदलाव का पता लगाने के लिए किया गया था । अंत में, एपोप्टोसिस मार्कर का अध्ययन किया गया था, जो एफएएफएस(चित्रा 6ए, बी, सी, डी)के माध्यम से पश्चिमी ब्लॉटिंग और एनेक्सटिन वी/7एएडी का उपयोग करके अध्ययन किया गया था। इन टिप्पणियों से पता चलता है कि एलसीएफएस ने 3डी मॉडल में एपोप्टोसिस को प्रभावी ढंग से प्रेरित किया।

Figure 1
चित्रा 1: गोलाकार गठन और एलसीएफएस तैयारी का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।
(A)एलसीएफ जनरेशन प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व छवियों को मिथाइलसेल्यूलोस-मध्यस्थता स्फेरॉइड गठन (आई-iii)द्वारा चिह्नित (आई-iv) (बी) स्कीमेटिक्स द्वारा चिह्नित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मिथाइलसेल्यूलोस-मध्यस्थता स्फेरॉइड गठन।
(A)एचटी-29, डीएलडी1 और वाईडीआर के मिथाइलसेल्यूलोस-मध्यस्थता स्फेरॉइड गठन की प्रतिनिधि छवियां। कोशिकाओं को अल्ट्रा-कम अटैचमेंट 96-अच्छी तरह से गोल बॉटम प्लेटों में 48 एच के लिए 0.1-1.2% की मिथाइलसेल्यूलोस सांद्रता के साथ वरीयता प्राप्त किया गया था। स्केल बार 10 माइक्रोन (प्रत्येक प्रयोग के लिए n = 3)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: एलसीएफएस एकाग्रता और गोलाकार आकृति विज्ञान का मूल्यांकन।
(A)एचटी-29 की प्रतिनिधि छवियां 48 घंटे के लिए एलसीएफ के साथ इलाज किया जाता है। स्केल बार 100 माइक्रोन। (B)एचटी-29, डीएलडी1, और वाईडीआर स्फेरॉइड 48 घंटे के लिए एलसीएफ की बढ़ती खुराक के साथ इलाज किया। सभी स्फेरॉइड ने 12.5-25% एलसीएफएस पर किनारों को बाधित किया था। स्केल बार 20 माइक्रोन (प्रत्येक प्रयोग के लिए एन = 3)(सी)एचटी-29, डीएलडी 1 और वाईडीआर स्फेरॉइड के स्फेरॉयड का इलाज 24 और 48 घंटे के लिए 25% एलसीएफएस के साथ किया जाता है। स्केल बार 20 माइक्रोन (एन = 3)(डी)मापा सेल व्यवहार्यता, मतलब ± एसईएम के रूप में दिखाया गया है * **,पी < 0.05 (एन = 3 प्रत्येक प्रयोग के लिए)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: स्फेरॉइड का प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला।
एलसीएफएस उपचार के 48 घंटे के बाद पीआई स्टेनिंग(ए)एचटी-29,(बी)डीएलडी1, और(सी)वाईडीआर स्फेरॉइड की प्रतिनिधि छवियां। छवियों को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अधिग्रहीत किया गया था और पीआई तीव्रता में वृद्धि को इमेज जे स्केल बार 10 माइक्रोन का उपयोग करके मापा गया था। एसईएम ± मतलब दिखाया गया है। , पी < 0.05 (एन = 3 प्रत्येक प्रयोग के लिए)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग करके एपोप्टोसिस मार्कर की पहचान की गई थी।
बैक्स, बाक और एनओएक्सए जैसे एपोप्टोसिस मार्कर की मात्रा निर्धारित की गई थी । एमआरएनए क्वांटिफिकेशन को एक सापेक्ष अभिव्यक्ति के रूप में प्रस्तुत किया जाता है जो(ए)β-ऐक्टिन और(बी)18s आरएनए के लिए सामान्यीकृत है। एसईएम ± मतलब दिखाया गया है। , पी < 0.05 (प्रत्येक प्रयोग के लिए एन = 3)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: एपोप्टोसिस मार्कर पश्चिमी ब्लॉटिंग और स्फेरॉइड के FACS विश्लेषण के माध्यम से निर्धारित किए गए थे।
आंकड़े में दिखाया गया है(ए)एचटी-29,(बी)DLD1, और (C) एलसीएफएस उपचार के बाद(सी)WiDr कोशिकाओं के पश्चिमी दाग हैं । PARP1, बीसीएल-एक्सएल, और पी-IοBα का पता चला। β-ऐक्टिन का इस्तेमाल इंटरनल कंट्रोल के तौर पर किया जाता था । (D)एचटी-29, डीएलडी1 और वाईडीआर स्फेरॉइड में एपोप्टोसिस का एफएसीएस विश्लेषण एलसीएफएस के साथ इनक्यूबेटेड है । एनेक्सटिन वी-फिटसी की फ्लोरेसेंस तीव्रता में वृद्धि से एपोटोटिक कोशिकाओं का पता चला । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रतिक्रिया वॉल्यूम प्रति सिंगल 20 माइक्रोल
2X क्यूपीसीआर मिक्स 10 माइक्रोल
फॉरवर्ड प्राइमर (10 pmols/μL) 1 माइक्रोल
रिवर्स प्राइमर (10 pmols/μL) 1 माइक्रोल
सीडीएनए (50 एनजी/μL) 1 माइक्रोल
पीसीआर ग्रेड पानी 7 माइक्रोन

तालिका 1: पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण।

प्रवेशिका अनुक्रम
बैक्स-फॉरवर्ड CCCGAGAGGTCTTTCCGG
बैक्स-रिवर्स सीसीजीसीसीकैटगेटगॉटटी
बाक-फॉरवर्ड ATGGTCACCTTACCTCTGCAA
बाक-रिवर्स TCATAGCGTAGTAGGATGTAGTCG
NOXA-फॉरवर्ड ACCAAGCCCCGATTGCGATT
NOXA-रिवर्स ACTTGCACTTTTTTCTCTGG
18s rRNA-फॉरवर्ड गेटगजीजीजीजीएैगैग
18s rRNA-रिवर्स GCGTGGATCTGCATAATGGT
β-ऐक्टिन-फॉरवर्ड TCCTGTGGCATCCCCACAAACT
β-ऐक्टिन-रिवर्स GAAGCATTTGGGGGGACGAT

तालिका 2: क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर दृश्य।

मंच अस्थायी (ºसी) समय
प्रारंभिक विकृति 95 10 मिनट
40 चक्र:
चरण 1 95 15 सेकंड
चरण 2 60 60 सेकंड
पिघलने वक्र चरण 95 15 सेकंड
60 60 सेकंड
95 15 सेकंड

तालिका 3: क्यूआरटी-पीसीआर की स्थिति।

रोग-प्रतिकारक तनूकरण
PARP 1 (C2-10) 1:1000
बीसीएल-एक्सएल (एच-5) 1:1000
पी-Iοbα (बी-9) 1:1000
β-ऐक्टिन (C4) 1:1000
बकरी विरोधी माउस IgG (एच + एल) 1:2500
बकरी विरोधी खरगोश IgG (एच + एल) 1:2500

तालिका 4: पश्चिमी दाग विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी।

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Discussion

ऊतक माइक्रोएनवायरमेंट, जिसमें पड़ोसी कोशिकाएं और एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) शामिल हैं, ऊतक उत्पादन के लिए मौलिक है और कोशिका विकास और ऊतक विकास13के नियंत्रण में महत्वपूर्ण है। हालांकि, 2डी संस्कृतियों के कई नुकसान हैं, जैसे सेलुलर इंटरैक्शन का व्यवधान, साथ ही सेल आकृति विज्ञान, बाह्राश वातावरण में परिवर्तन, और डिवीजन14का दृष्टिकोण। वीवो प्रभावों में बेहतर पुन: पेश करने के लिए 3 डी सेल कल्चर सिस्टम का कड़ाई से अध्ययन किया गया है, और इन विट्रो कैंसर परीक्षण15,16के लिए अधिक सटीक प्रणालियों के रूप में साबित किया गया है। मॉडल प्रणालियों की आवश्यकता है ताकि17कीमोथैरेपी के लिए व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं का अधिक सटीक रूप से अनुमान लगाया जा सके ।

ऊतक इंजीनियरिंग के लिए 3 डी मचान विकसित किया गया था। यह ईसीएम के सरोगेट लॉस के रूप में कार्य करता है, जो ट्यूमर कोशिकाओं के उपलब्ध स्थान का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, मचान सेल आसंजन और प्रसार के लिए शारीरिक बातचीत प्रदान करता है और कोशिकाओं को उचित स्थानिक वितरण और सेल-ईसीएम या सेल-सेल इंटरैक्शन18बनाने का कारण बनता है। मिथाइलसेल्यूलोस (एमसी) बहुलक का लगातार अध्ययन किया गया है ताकि 3डी सेल कल्चर इंजीनियरिंग19,20में अनुप्रयोगों के लिए एमसी-आधारित हाइड्रोजेल सिस्टम उत्पन्न करने में इसकी उपयुक्तता का निर्धारण किया जा सके । हालांकि, इन हाइड्रोगेलों को 3डी सेल नेटवर्क जैसे बायोमैटेरियल्स में बरकरार21तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना हुआ है । इसलिए, यहां प्रस्तुत स्फेरॉइड गठन प्रोटोकॉल प्रत्येक सीआरसी सेल लाइन के लिए विभिन्न समय बिंदुओं के साथ एमसी सांद्रता और अनुकूलन के शीर्षक की सिफारिश करता है। सेल लाइन-विशिष्ट विशेषताएं, जैसे सेल एकत्रीकरण, व्यवहार्यता और मृत्यु, हमारे द्वारा परीक्षण की गई प्रत्येक स्थिति को काफी प्रभावित कर सकती हैं। यह विधि कैंसर कोशिकाओं पर एलसीएफएस के परीक्षण के लिए एक समान स्फेरॉइड पैदा करने का साधन प्रदान कर सकती है।

प्रोबायोटिक्स, जो फायदेमंद बैक्टीरिया हैं, सक्रिय मेटाबोलाइट्स का उत्पादन करते हैं जो संभावित रूप से कैंसर विरोधी प्रभावों की नकल कर सकते हैं। इस प्रकार, हमारा अध्ययन लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया (लैब) को अलग करने और सेल-मुक्त सुपरनेटेंट (सीएफएस) से उनके मेटाबोलिक अर्क के कैंसर विरोधी प्रभावों का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। हमारे अध्ययनों ने एल किण्वन सेल-मुक्त सुपरनेटेंट के प्रभावों को देखने के लिए एक विधि प्रदान की जो 3 डी प्रणाली में कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं में एपोप्टोटिक सेल मौत को प्रेरित करती है। एपोप्टिक रास्तों में शामिल एपोप्टोसिस मार्कर के एमआरएनए स्तर 3 डी स्थितियों में एलसीएफ एक्सपोजर के बाद नाटकीय रूप से प्रेरित हैं। इसके अलावा, चित्रा 4सी, डी,ईमें नियंत्रण की तुलना में एलसीएफएस-इलाज 3 डी स्फेरॉइड नियंत्रण में PARP1 और बीसीएल-एक्सएल के घटते स्तरों को व्यक्त किया गया था। एनएफ-एनएबी सक्रियण का अवरोध एलसीएफएस के साथ उपचार के बाद 3 डी संस्कृतियों में भी मनाया गया था। सभी को एक साथ लिया, 3 डी में कोशिकाओं को बनाने के फायदों में सेल-सेल इंटरैक्शन और वीवो सिस्टम में बेहतर नकल करने के लिए अणुओं को संकेत देने के लिए प्रतिक्रियाएं बढ़ाना शामिल है। स्पेरोइड का उपयोग करके पश्चिमी ब्लॉटिंग विभिन्न सिग्नलिंग अणुओं की स्थिति में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि का कारण बन सकता है।

कोशिका रेखाओं कैंसर अनुसंधान के पूर्व नैदानिक मॉडल के रूप में कुछ सीमाएं हैं। हाल ही में, कैंसर ऑर्गेनॉइड का उपयोग व्यक्तिगत एंटी-कैंसर थेरेपी22, 23के मॉडलिंग में किया गया है। ऑर्गेनॉइड में प्रोबायोटिक्स के साथ एलसीएफ के उपचार को कैंसर विरोधी प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एक शक्तिशाली मंच के रूप में इस्तेमाल किए जाने की उम्मीद है। इसके अलावा, हमने कैंसर मॉडल में विभिन्न प्रोबायोटिक्स के बीच केवल लैक्टोबेसिलस प्रजातियों में से एक का परीक्षण किया। मेटाबोलिक सिंड्रोम, इम्यूनोलॉजिकल और न्यूरोलॉजिकल विकारों की रोकथाम के लिए विभिन्न प्रोबायोटिक्स का भी परीक्षण किया जा रहा है24,25,26। बिफिडोबैक्टीरियम, सैकोरोमिक्स, स्ट्रेप्टोकोकस, एंटोकोकसऔर अक्करमांसिया प्रजाति के एलएफएस विभिन्न प्रकार के रोग मॉडल 27,28 ,29के माध्यम से स्वास्थ्य लाभों के परीक्षण के लिए संभावित उम्मीदवार हैं ।

इस अध्ययन के आधार पर, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि स्फेरॉइड में सिग्नलिंग की समझ और 3 डी मॉडल में एलसीएफ उपचार के लिए विभिन्न प्रतिक्रियाएं हमारे द्वारा प्रस्तावित विधि का उपयोग करके कैंसर विरोधी प्रभावों का परीक्षण करने के लिए फायदेमंद हो सकती हैं। इसके अतिरिक्त, 3डी कैंसर मॉडल कई फायदे प्रदान कर सकते हैं जो पारंपरिक 2D मोनोलेयर के साथ संभव नहीं हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रासंगिक वित्तीय खुलासे नहीं हैं ।

Acknowledgments

इस शोध को "रसायन विज्ञान और विकिरण के लिए माप मानकों की स्थापना", अनुदान संख्या KRISS-2020-GP2020-0003, और "बायोमैटेरियल्स और मेडिकल कन्वर्जेंस के लिए मापन मानकों और प्रौद्योगिकी का विकास", अनुदान संख्या KRISS-2020-GP2020-0004 कार्यक्रमों, कोरिया अनुसंधान मानकों और विज्ञान संस्थान द्वारा वित्त पोषित द्वारा समर्थित किया गया था । इस शोध को विज्ञान और आईसीटी मंत्रालय (एमएसआईटी), नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ-2019M3A9F3065868), स्वास्थ्य और कल्याण मंत्रालय (MOHW), कोरिया स्वास्थ्य उद्योग विकास संस्थान (KHIDI, HI20C0558), व्यापार, उद्योग और ऊर्जा मंत्रालय (MOTIE), और कोरिया मूल्यांकन औद्योगिक प्रौद्योगिकी संस्थान (KEIT, 20009350) द्वारा भी समर्थन दिया गया । ORCID आईडी (ही मिन आ: 0000-0002-5951-2137; Dukjin कांग: 0000-0002-5924-9674; Seil किम: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun ली: 0000-0002-2495-1439; जिना ली: 0000-0002-3661-3701) । हम प्रयोगों के साथ सहायता के लिए चांग वू पार्क का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments

10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl		 Biorad 4561036 Pkg of 10
Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 100 covers
10x transfer buffer Intron IBS-BT031A 1 L
10X Tris-Glycine (W/SDS) Intron IBS-BT014 1 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case Corning SCT-200-C 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case
BD Difco Bacto Agar BD 214010 500 g
BD Difco Lactobacilli MRS Broth BD DF0881-17-5 500 g
CellTiter-Glo 3D Cell viability assay Promega G9681 100μl/assay in 96-well plates
Complete Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 11697498001 vial of 20 tablets
Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 Corning 21-040-CV 500 mL
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes fisher Scientific IPVH00010 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235 25/Pack, 500/Case
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044 500 mL
iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 Biorad 1708890 25 x 20 µL rxns
iTaq Universal SYBR Green Supermix Biorad 1725121 5 x 1 mL
Lactobacillus fermentum Korean Collection for Type Cultures KCTC 3112
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich C6852-25G 25 g
Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) TCI M0185 500 g
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL Applied Biosystems 4346906 20 plates
Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized Millipore SLGS033SB 250
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD Biolegend 640934 100 tests
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 100 mL
Propidium Iodide Introgen P1304MP 100 mg
RIPA Lysis and Extraction Buffer Thermo Fisher Scientific 89901 250 mL
RNeasy Mini Kit (250) Qiagen 74106 250
RPMI-1640 Gibco 11875-119 500 mL
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056 100 mL
Name of Materials/Equipment/Software Company Catalog Number Comments/Description
anti - p-IκBα (B-9) Santa cruze sc-8404 200 µg/mL
anti-BclxL (H-5) Santa cruze sc-8392 200 µg/mL
anti-PARP 1 (C2-10) Santa cruze sc-53643 50 µl ascites
anti-β-actin (C4) Santa cruze sc-47778 200 µg/mL
BD FACSVerse BD Biosciences San Diego, CA, USA
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader BioT S1LFA
CO2 incubator Thermo fisher HERAcell 150i
Conical tube 15 ml SPL 50015
Conical tube 50 ml SPL 50050
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate Sigma-Aldrich CLS7007
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate Sigma-Aldrich CLS3471
Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile Costar 4870
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermofisher C10228
Countess II FL Automated Cell Counter invitrogen AMQAF1000
EnSpire Multimode Reader Perkin Elmer Enspire 2300
Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel Eppendorf 3122000051
FlowJo software TreeStar Ashland, OR, USA
Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson immunoresearch 115-035-062 1.5 mL
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson immunoresearch 111-035-144 2.0 mL
GraphPad Prism 5 GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
ImageJ NIH
ImageQuant LAS 4000 mini Fujifilm Tokyo, Japan
Incubated shaker Lab companion SIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0, Fujifilm Tokyo, Japan
Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers Perkin Elmer Waltham, MA, USA
Phase-contrast microscope Olympus Tokyo, Japan
SPL microcentrifuge tube 1.5mL SPL 60015
SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile SPL 21012
StepOnePlus Real-Time PCR system Thermo Fisher Scientific Waltham, MA, USA
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors SONICS-vibra cell VC 505 500 Watt ultrasonic processor
Vinyl Anaerobic Chamber COY LAB PRODUCTS

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References

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कैंसर रिसर्च अंक 160 प्रोबायोटिक्स लैक्टोबेसिलस किण्वनम,कोलोरेक्टल कैंसर स्फेरॉइड 3 डी कल्चर लैक्टोबेसिलस सेल-फ्री सुपरनैंट (एलसीएफएस)
कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं की त्रि-आयामी स्फेरॉइड संस्कृतियों में प्रोबायोटिक्स के सेल-फ्री सुपरनेंट का उपयोग करके सेल डेथ का मूल्यांकन करना
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Lee, J., Lee, J. E., Kim, S., Kang, D., Yoo, H. M. Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells. J. Vis. Exp. (160), e61285, doi:10.3791/61285 (2020).

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