Summary
כאן מוצגות שיטות כדי להבין השפעות אנטי סרטניות של לקטובצילוס ללא תאי supernatant (LCFS). קווי תאים סרטניים המעי הגס מראים מקרי מוות של תאים כאשר מטופלים עם LCFS בתרבויות תלת-ממד. תהליך יצירת כדוריות יכול להיות ממוטב בהתאם לפיגומים ושיטות הניתוח המוצגות שימושיות להערכת מסלולי האיתות המעורבים.
Abstract
כתב יד זה מתאר פרוטוקול להערכת מקרי מוות של תאים סרטניים בפרואידים תלת ממדיים (תלת-ממדיים) של תאים סרטניים רב תאיים באמצעות מזונות-על מתרבית תאי התסיסה לקטובצילוס , הנחשבים לתרבויות פרוביוטיקה. השימוש בתרביות תלת-ממד לבדיקת תחליב-על נטול תאי לקטובצילוס (LCFS) הם אפשרות טובה יותר מבדיקה במונו-שכבתיים דו-ממדיים, במיוחד לאור העובדה שתסיסה של L. יכולה לייצר השפעות אנטי-סרטניות במעיים. L. תסיסה supernatant זוהה להחזיק השפעות אנטי-שגשוג מוגבר נגד מספר תאים סרטן המעי הגס (CRC) בתנאי תרבית 3D. מעניין, תופעות אלה היו קשורים מאוד למודל התרבות, הדגמת היכולת הבולטת של L. תסיסה לגרום למוות תאים סרטניים. כדוריות יציבות נוצרו מ- CRCs מגוונים (תאים סרטניים המעי הגס) באמצעות הפרוטוקול המוצג להלן. פרוטוקול זה של יצירת כדורי תלת-ממדי הוא חיסכון בזמן וחסכוני. מערכת זו פותחה כדי לחקור בקלות את ההשפעות נגד סרטן של LCFS בסוגים מרובים של כדורי CRC. כצפוי, כדורי CRC שטופלו ב- LCFS גרמו מאוד למוות תאי במהלך הניסוי וביעו סמנים מולקולריים ספציפיים אפופטוזיס כפי שניתחו על ידי qRT-PCR, סופג מערבי, וניתוח FACS. לכן, שיטה זו היא בעלת ערך לחקר הכדאיות של התאים והערכת היעילות של תרופות נגד סרטן.
Introduction
פרוביוטיקה הם המיקרואורגניזמים היתרון ביותר במעיים שמשפר את ההומוסטזיס החיסוני ואת חילוף החומרים שלהאנרגיה המארחת 1. פרוביוטיקה מ לקטובצילוס וביפידובקטריום הם המתקדמים ביותר מסוגו שנמצאו במעי2,3. חקירות קודמות הראו כי לקטובצילוס יש השפעות מעכבות ואנטי-פרוliferative על מספר סוגי סרטן, כולל סרטן המעי הגס4. יתר על כן, פרוביוטיקה למנוע מחלות מעי דלקתיות, מחלת קרוהן, קוליטיס כיבית5,6. עם זאת, רוב המחקרים עם פרוביוטיקה בוצעו דו מימדי (2D) monolayers שגדלים על משטחים מוצקים.
מערכות תרבית מלאכותית חסרות תכונות סביבתיות, שאינן טבעיות לתאים סרטניים. כדי להתגבר על מגבלה זו, מערכות תרבות תלת מימדיות (3D) פותחו7,8. תאים סרטניים בתלת-ממד מראים שיפורים במונחים של מנגנונים ביולוגיים בסיסיים, כגון כדאיות תאים, התפשטות, מורפולוגיה, תקשורת תא-תאים, רגישות לתרופות, ורלוונטיות vivo9,10. יתר על כן, כדורי עשויים מסוגים רב תאיים של סרטן המעי הגס ותלויים באינטראקציות בין תאים לבין המטריצה החוץ תאית (ECM)11. המחקר הקודם שלנו דיווח כי פרוביוטיקה תאים ללא תאים supernatant (CFS) המיוצר באמצעות תסיסה לקטובצילוס הראה השפעות אנטי סרטניות על תרביות תלת-ממדיות של סרטן המעי הגס (CRC) תאים12. הצענו כי CFS היא אסטרטגיה חלופית מתאימה לבדיקת השפעות פרוביוטיות על כדורי תלת מימד12.
כאן, אנו מציגים גישה שיכולה להכיל סוגים רב תאיים של סרטן המעי הגס 3D לניתוח ההשפעות הטיפוליות של supernatant ללא תאים פרוביוטיים (CFS) על מספר מערכות חיקוי סרטן המעי הגס 3D. שיטה זו מספקת אמצעי לניתוח של השפעות פרוביוטיקה ואנטי סרטן הקשורות במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרביות תאים חיידקיים והכנת לבצילוס סופרנטנט ללא תאים (LCFS)
הערה: שלבים 1.2 – 1.9 מתבצעים בחדר אנאירובי.
- הכן צלחת אגר MRS ומרק המכיל L-ציסטאין ולחטא על ידי autoclaving.
- לפני הדגירה צלחת אגר MRS בתא אנאירובי H2 מתוחזק ב 37 °C (50 °F) עם חמצן 20 ppm.
- להפשיר ציר חיידקי לקטובצילוס ולחסן את צלחת אגר עם תרבית החיידקים(איור 1A (i).
- דגירה חיידקים במשך 2 - 3 ימים בתא אנאירובי H2 ב 37 °C (7 °F) ו 20 ppm חמצן עד מושבות חיידקים בודדים מתקבלים.
- לשטוף ולייבש את צינור תרבות אנרובי סוג Hungate. תאט-סטוב את צינור התרבות ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- ואז לדגור על הצינור בתא אנאירובי H2 ב 37 °C (7 °F) ו 20 ppm חמצן כדי להסיר חמצן.
- מניחים 2 - 3 מ"ל של מרק MRS לתוך הצינור. לאטום את הצינור עם פקק גומי בוטיל ולברג את הכובע.
- להשיג מושבה אחת עם לולאה למקם אותו לתוך צינור תרבות 1.5 מ"ל עם 500 μL של 1x PBS. (איור 1A (ii).
- השעיית המושבה באמצעות מזרק של 1 מ"ל (איור 1A (iii). לעשות זאת על ידי החדרת המחט של מזרק 1 mL במרכז מכסה הצינור, שאיפה המושבה המושעה ולאחר מכן resuspending אותו בחזרה למדיית מרק MRS. (איור 1A (iv).
- לדגור על מדיית מרק MRS באינקובטור שייקר במשך יומיים (37 °C (37 °C), 5% CO2, 200 סל"ד).
- מדוד את הצפיפות האופטית (OD) באמצעות ספקטרופוטומטר לניטור עקומות צמיחה חיידקיות עד שהספיגה ב- OD620 תגיע ל-2.0.
- הפרד את כדורי החיידקים ואת המדיה המותנית על ידי צנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 15 דקות. לשטוף את כדורי חיידקים שנאספו עם 1x PBS ו resuspend ב 4 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי. אין לכלול אנטיביוטיקה במדיום.
- לשמור על כדורי חיידקים ב RPMI ודגרה באינקובטור שייקר עבור 4 שעות ב 37 °C (5% CO2 במהירות של 100 סל"ד.
- להכנת supernatant פרוביוטיקה, להסיר את הכדור החיידקי באמצעות צנטריפוגה ב 1000 x גרם, במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F). מסנן סטרילי את supernatant התאושש באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב −80 °C (50 °F) עד השימוש.
2. דור כדורי
-
הכנת קווי תאים סרטניים המעי הגס
- לגדל DLD-1, HT-29, וקווי תא WiDr כמו monolayers עד 70-80% conהשפעה ולדגירה את הצלחת ב 37 °C בחממה2 CO 5% (בינוני צמיחה: RPMI המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין).
- עבור תאים הגדלים בצלחת פטרי 100 מ"מ, לשטוף את הצלחת פעמיים עם 4 מ"ל של 1x PBS. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ודגרה צלחת פטרי במשך 2 דקות ב 37 °C בחממה5% CO 2 כדי לנתק את התאים.
- לאחר הדגירה, לבדוק את ניתוק התא תחת מיקרוסקופ ולנטרל טריפסין-EDTA עם 5 מ"ל של מדיום צמיחה.
- העבר את התאים המנותקים לצינור חרוט 15 מ"ל וצנטריפוגה במשך 3 דקות ב 300 x g.
- השלך את supernatant ו resuspend בעדינות עם 3 מ"ל של מדיה צמיחה.
- לספור את התאים עם כחול טריפן כדי לקבוע תאים קיימא באמצעות hemocytometer. (איור 1B (i))
-
היווצרות כדורית
- בצינור חרוט 15 מ"ל, לדלל את התאים מ 2.1.5 כדי להשיג 1 - 2 x 105 תאים / מ"ל (איור 1B (ii))
- הוסף ריכוז סופי של 0.6% מתילצלולוז להשעיית התא והעבר את התאים המדוללים למאגר סטרילי.
הערה: עבור כל קו תא, יש לצית את כמות המתילצלולוז הדרושה ולהיקבע בהתאם. - השתמש pipette multichannel כדי לחלק 200 μL של תאים לכל באר של חיבור אולטרה נמוך 96-היטב מיקרו-לוח תחתון עגול. (איור 1B (iii))
- לדגור את הצלחת ב 37 °C בחממה5% CO 2 עבור 24 - 36 שעות.
- לאחר 24 - 36 שעות, התבונן בלוח תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח היווצרות כדורית.
3. טיפול בתאי סרטן המעי הגס תלת-ממדיים עם LCFS
- צור כדוריות כמתואר בשלבים 2 ו -3.
- לפני ביצוע הטיפול LCFS, להפשיר את LCFS קפוא בטמפרטורת החדר (RT) במשך 10 - 20 דקות.
- לחסן את פתרון מניית LCFS למדיום צמיחה. לדלל באופן סדרתי ל 25%, 12.5%, ו 6% במדיום הצמיחה (כלומר, 25% LCFS = 150 μL של בינוני צמיחה + 50 μL של LCFS).
- להוציא את צלחת תרבית התא המכיל כדורי מן האינקובטור ולהסיר כמה שיותר של מדיום הצמיחה ככל האפשר מכל באר באמצעות 200 μL pipette.
- הוסף את מדיה הצמיחה עם LCFS על התאים ודגרה ב 37 °C בחממהCO 2 5% עבור 24 - 48 שעות.
הערה: אמצעי האחסון שישמש יהיה תלוי בגודל הצלחת כדלקמן: 2 מ"ל עבור לוחות תרבית תאים 6-well; 200 μL עבור 96-טוב לוחות תרבית התא.
4. כדאיות תאים עבור כדורי
- הכן 8 - 10 כדורי סרטן המעי הגס שטופלו ב- LCFS בלוחות רב-באריים אטומים (בוצעו 48 שעות לאחר טיפול LCFS).
- להפשיר את ריאגנט הכדאיות התא (ראה טבלה של חומרים) ב 4 °C (75 °F) ללילה.
- יש לתעד את ריאגנט הכדאיות של התא לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- לפני ביצוע ההסתה, להסיר 50% של מדיה הצמיחה מן spheroids.
- הוסף 100 μL של ריאגנט הכדאיות התא לכל באר.
הערה: אמצעי האחסון שישמש תלוי בגודל הצלחת כדלקמן: 100 μL עבור לוחות תרבית תאים 96-well. - מערבבים את ריאגנט במרץ במשך 5 דקות כדי לקדם תמוגה התא.
- דגירה במשך 30 דקות – 2 שעות ב 37 °C (7 °F).
- תקליט את ההארה.
5. ניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותי בזמן אמת עבור כדוריות
- עבור כל תנאי, להכין 10 - 15 כדוריות בצינור 2 מ"ל צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 400 x גרם.
- השליכו את הסופרנט ושטפו את כדוריות פעמיים ב-1 מ"ל של PBS 1x קר כקרח.
הערה: הימנע צנטריפוגה, תן כדורי להתיישב. - שאפו כמה שיותר PBS 1x ולבודד RNA באמצעות ערכה זמינה מסחרית.
- סנתז cDNA מ- 1 מיקרוגרם של RNA באמצעות ערכה זמינה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
- הכן תערובת ראשית כדי להפעיל את כל הדוגמאות במשולש (ראה טבלה 1 וטבלה 2).
- בצע את ההגברה ב 20 μL של תערובת תבנית מאסטר לתוך כל צלחת qPCR היטב.
- מערבבים תגובות היטב ומסתובבים במידת הצורך.
- הפעל דוגמאות בהתאם להמלצות יצרן המכשירים (טבלה 3).
6. סופג מערבי מפרואידים
הערה: בעת איסוף כדוריות, להשתמש 200 μL pipette לחתוך את סוף הטיפים כדי למנוע הפרעה למבנה שלהם.
- עבור כל תנאי, להכין 30 - 40 כדוריות בצינור 2 מ"ל.
- מניחים את הצינור על קרח ולתת את כדורי להתיישב לתחתית צינור 2 מ"ל.
- להשליך את supernatant ולשטוף את כדורי פעמיים 1 מ"ל קר כקרח 1x PBS
הערה: הימנע צנטריפוגה, תן כדורי להתיישב. - שאפו כמה שיותר PBS 1x ולהוסיף חיץ RIPA עם קוקטייל מעכב פרוטאז (10 כדורי = 30 μL של חיץ RIPA).
- ללקק את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה ולבצע sonication עבור 30 s עם 30 s של מנוחה על קרח במשך 10 מחזורים.
- צנטריפוגות החלבון lysates ב 15000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F).
- קבעו את ריכוז החלבון עבור כל תא ליסייט.
- לפני הטעינה, להרתיח כל תא lysate במאגר מדגם ב 100 °C (50 °F) במשך 10 דקות.
- לטעון כמויות שוות של חלבון לתוך הבארות של ג'ל SDS-PAGE ולהפעיל את הג'ל עבור 1 - 2 שעות ב 100 V.
- מעבירים את החלבון מהג'ל לקרום PVDF.
- לאחר ההעברה, לחסום את הממברנה במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר באמצעות חוצץ חסימה (5% חלב רזה + TBS עם 0.05% Tween-20).
- לדגור על הממברנה עם 1:1,000 דילול של נוגדן ראשוני (טבלה 4) ב 1x TBST עם 5% חוצץ BSA ב 4 °C (5 °F) לילה.
- לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST, 15 דקות עבור כל לשטוף.
- לדגור על הממברנה עם 1:2,500 דילול של נוגדן משני במאגר חסימה בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות (ראה טבלה של חומרים).
- לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST, 15 דקות עבור כל לשטוף.
- הכן את הממברנה לגילוי HRP עם מצע כימותרפי.
- לרכוש תמונות מלימינסנט.
7. פרופיליום יודיד (PI) כתמים של כדורי
- הכן 5-10 כדוריות כמתואר בשלב 4.1 והנח את כדוריות באינקובטור ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2.
- לדלל 1 מ"ג / מ"ל מלאי של PI 1:100 ב 1x PBS.
- מוציאים 50% מהמדיום מכל באר של צלחת 96-well.
- הוסף 100 μL של פתרון PI לכל באר ומניחים את הבארות באינקובטור ב 37 °C (5° C) ו 5% CO2 עבור 10 - 15 דקות.
- לשטוף את פתרון PI עם PBS 1x.
- הוסף 200 μL של מדיום צמיחה ולצלם תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לנתח את עוצמת הפלואורסצנטיות באמצעות תמונה J כדי לקבל את ספירת הכדאיות של הכדוריד.
8. ניתוח FACS של כדוריות
- ליצור כדוריות כמתואר בעבר.
- עבור כל תנאי, להכין 30 - 40 כדוריות בצינור FACS וצנטריפוגה במשך 3 דקות ב 400 x g ו RT.
- שאפו את supernatant ולשטוף את כדוריות ב 3 מ"ל של 1x PBS, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 400 x g במשך 3 דקות ב 4 °C (70 °F).
- לשאוף supernatant ולהוסיף 200 μL של 0.25% טריפסין-EDTA, ולאחר מכן דגירה ב RT במשך 2 -3 דקות.
הערה: זמן הדגירה תלוי בגודל הכדור וסוג התא. - הוסף 1 מ"ל של מאגר FACS ונתק בעדינות את כדורי הכדוריד באמצעות פיפטה של 200 μL.
- צנטריפוגות התאים מנותקים ב 400 x g ו 4 °C (55 °F) במשך 3 דקות.
הערה: מאגר FACS = 1x PBS + 2.5% FBS, מסונן באמצעות מסנן עליון של 0.22 מיקרומטר. - השלך את supernatant ולהוסיף 7-AAD / Annexin V ריאגנט (7AAD (5 μL), Annexin V (5 μL)/מדגם).
- מערבולת בעדינות את התאים ודגרה במשך 13 - 30 דקות ב RT בחושך.
- הוסף 500 μL של מאגר FACS וסנן את התאים באמצעות מבחנות פוליסטירן חרוט כדי להסיר תאים צבירה.
- צנטריפוגה ב 400 x g ו 4 °C (5 °F) במשך 3 דקות.
- הוסף 500 μL של מאגר כריכת Annexin V לכל צינור ו resuspend.
- לנתח באמצעות cytometer זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מתארים את הפרוטוקול של קבלת כדוריות מקווי תאים שונים של סרטן המעי הגס. תוספי עם methylcellulose נדרש כדי ליצור כדוריות. אנו מציגים גם שיטה של הכנת LCFS ולהציג מודל כדי ללמוד את המתאם בין פרוביוטיקה וסרטן המעי הגס. תצורה כדורית ופרוטוקולי הכנה LCFS מודאים באופן סכמטי באיור 1A,B. כפי שניתן לראות באיור 2A, ריכוז מתיל צלולוז של 0.6% הופך את התאים הסרטניים לפרואידים קומפקטיים. תוצאה זו מצביעה על כך שספרואידים יכולים להיווצר ממספר סוגים של סרטן המעי הגס באמצעות פרוטוקול המתיל צלולוז שלנו. לאחר מכן, כדורי טופלו עם 25% LCFS והמורפולוגיה נחקרה לאחר 48 שעות באמצעות מיקרוסקופ אור. כפי שניתן לראות באיור 3A, כדורי הקבוצות שטופלו ב- LCFS הציגו משטחים משובשים. כדי לחקור את ההשפעות נגד סרטן של LCFS בריכוזים מתאימים, כדורי טופלו במשך 48 שעות עם מינונים שונים של LCFS: 0 (שליטה), 6%, 12.5%, ו 25%. שיבושים במורפולוגיה של כדורית נצפו בספרואידים שטופלו ב-25% LCFS, כפי שמוצג באיור 3B. בנוסף, כדורי טופלו עם 25% LCFS עבור 24 שעות ו 48 שעות, ושיבושים מורפולוגיה כדורית נצפו לאחר 48 שעות של טיפול. תמונות מיקרוסקופיות של כדוריות מוצגות באיור 3C.
לאחר 48 שעות, הדגימות הוערכו עם בדיקה קיימא התא, ומוות תאים סרטן המעי הגס נצפתה על טיפול עם LCFS באופן תלוי במינון, גבוה יותר את כמות LCFS גבוה יותר את המוות התא הנצפה (איור 3D). אנחנו, אם כן, הכתמנו את הדגימות עם פרופידיום יודיד (PI) כדי לצפות אפופטוזיס. כצפוי, האינדוקציה של אפופטוזיס היה תלוי במינון LCFS (איור 4A,B,C). RT-PCR בוצע כדי לזהות את השינויים בסמנים מולקולריים של אפופטוזיס כלומר, BAX, BAK ו NOXA (איור 5A,B). לבסוף, סמני אפופטוזיס נחקרו באמצעות סופג מערבי ונספח V/7AAD באמצעות FACS(איור 6A, B, C, D). תצפיות אלה מראות כי LCFS ביעילות גרם אפופטוזיס במודל 3D.
איור 1: ייצוג סכמטי של היווצרות כדורית והכנת LCFS.
(A)תמונות ייצוג סכמטיות של פרוטוקול הדור LCFS מסומנות על-ידי (i-iv) (B)שרטוטים של היווצרות ספרואיד מתווך methylculose מסומנים על-ידי (i-iii). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: היווצרות כדורית בתיווך מתיל צלולוז.
(A)תמונות מייצגות של היווצרות כדורית בתיווך מתיל צלולוז של HT-29, DLD1 ו- WiDr. תאים נזרעו בצלחות תחתיות עגולות אולטרה-נמוכות 96-היטב עם ריכוזי מתיל צלולוז של 0.1-1.2% עבור 48 שעות. סרגל קנה מידה 10 מיקרומטר (n= 3 עבור כל ניסוי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הערכת ריכוז LCFS ומורפולוגיה כדורית.
(A)תמונות מייצגות של HT-29 שטופלו ב- LCFS עבור 48 שעות. סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר. (B)HT-29, DLD1, ו- WiDr spheroids שטופלו במינונים הולכים וגדלים של LCFS עבור 48 שעות. כל כדורי היה קצוות שיבשו ב 12.5-25% LCFS. סרגל קנה מידה 20 מיקרומטר (n = 3 עבור כל ניסוי)(C)מורפולוגיות ספרואידיות של HT-29, DLD1 ו- WiDr spheroids שטופלו ב- 25% LCFS עבור 24 ו - 48 שעות. סרגל קנה מידה 20 מיקרומטר (n = 3) (D)כדאיות תאים נמדדת, המוצגת כממוצעת ± SEM. ***, P < 0.05 (n = 3 עבור כל ניסוי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: כתמי יוד פרופידיום של כדוריות.
תמונות מייצגות של מכתים PI ב (A) HT-29, (B) DLD1, ו (C) WiDr spheroids לאחר 48 שעות של טיפול LCFS. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטיות והעלייה בעוצמת PI נמדדה באמצעות תמונה J. Scale bar 10 מיקרומטר. ה- SEM ± הממוצע מוצג. P < 0.05 (n = 3 עבור כל ניסוי)., אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: סמני אפופטוזיס זוהו באמצעות qRT-PCR.
סמני אפופטוזיס, כגון BAX, BAK ו- NOXA, היו כימותו. כימות mRNA מוצג כביטוי יחסי מנורמל ל-( A) β-actin ו- (B) 18s rRNA. ה- SEM ± הממוצע מוצג. P < 0.05 (n=3 עבור כל ניסוי)., אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: סמני אפופטוזיס נקבעו באמצעות ניתוח סופג מערבי וניתוח FACS של כדוריות.
באיור מוצגים כתמים מערביים של (A) HT-29, (B) DLD1, ו - (C) תאי WiDr לאחר טיפול LCFS. PARP1, BCL-XL ו- p-IκBα זוהו. β-א-אטין שימשה כבקרה פנימית. (D)ניתוח FACS של אפופטוזיס ב HT-29, DLD1, ו WiDr כדורי דגירה עם LCFS. תאים אפופוטוטיים זוהו על ידי העלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות של Annexin V-FITC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| התגובה | עוצמת קול ליחיד 20 μL |
| תערובת qPCR פי 2 | 10 μL |
| פריימר קדמי (10 pmols/μL) | 1 μL |
| פריימר הפוך (10 pmols/μL) | 1 μL |
| cDNA (50 ננוגרם/μL) | 1 μL |
| מים בדרגת PCR | 7 μL |
טבלה 1: תערובת תגובת PCR.
| תחל | רצף |
| באקס-פורוורד | CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG |
| BAX-הפוך | CCAGCCCATGATGGTTCTGAT |
| BAK-קדימה | ATGGTCACCTTACCTCTGCAA |
| BAK-הפוך | TCATAGCGTCGGTTGATGTCG |
| נוקסה-פורוורד | ACCAAGCCGGATTTGCGATT |
| נוקסה-הפוך | ACTTGCACTTGTTCCTCGTGG |
| 18s rRNA-Forward | GATGCGGCGGAAAATAG |
| 18s rRNA-הפוך | GCGTGGATTCTGCATAATGGT |
| β-אקטין-פורוורד | TCCTGTGGCATCCACGAAACT |
| β-אקין-הפוך | GAAGCATTTGCGGTGGACGAT |
טבלה 2: רצפי פריימר המשמשים בניתוח qRT-PCR.
| במה | טמפרטור (ºC) | זמן |
| denaturation ראשונית | 95 | 10 דקות |
| 40 מחזורים: | ||
| שלב 1 | 95 | 15 שניות |
| שלב 2 | 60 | 60 שניות |
| שלב עקומת התכה | 95 | 15 שניות |
| 60 | 60 שניות | |
| 95 | 15 שניות | |
טבלה 3: תנאי qRT-PCR.
| נוגדן | דילול |
| PARP 1 (C2-10) | 1:1000 |
| BCL-XL (H-5) | 1:1000 |
| p-IκBα (B-9) | 1:1000 |
| β-א-אקין (C4) | 1:1000 |
| עיזים נגד עכבר IgG (H +L) | 1:2500 |
| עיזים נגד ארנב IgG (H +L) | 1:2500 |
טבלה 4: נוגדנים המשמשים בניתוח כתם מערבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
microenvironment הרקמה, כולל תאים שכנים ואת מטריצה חוץ תאית (ECM), הוא בסיסי לייצור רקמות חיוני בשליטה על צמיחת התא ופיתוחרקמות 13. עם זאת, לתרבויות 2D יש מספר חסרונות, כגון הפרעה של אינטראקציות תאיות, כמו גם שינויים במורפולוגיה של תאים, סביבות חוץ תאיות, ואת הגישה של חטיבה14. מערכות תרבית תאים תלת-ממדית נחקרו בקפדנות כדי להתרבות טוב יותר באפקטים של vivo, והוכחו כמערכות מדויקות יותר לבדיקות סרטן במבחנה15,16. יש צורך במערכות מודל כדי לחזות בצורה מדויקת יותר תגובות מותאמות אישית לכימותרפיה17.
פיגומים תלת מימדיים פותחו להנדסת רקמות. הוא פועל כהפסד פונדקאי של ECM, המייצג את השטח הזמין של תאים סרטניים. בנוסף, הפיגומים מספקים אינטראקציות פיזיות להידבקות תאים והתפשטות תאים וגורמים לתאים ליצור הפצות מרחביות מתאימות ואינטראקציות תא-ECM או תאי-תאים18. הפולימר מתיל צלולוז (MC) נחקר ברציפות כדי לקבוע את התאמתו ביצירת מערכות הידרוג'ל מבוססות MC עבור יישומים בהנדסת תרבית תאים תלת-ממדית19,20. עם זאת, שילוב שלם של הידרוג'ל אלה לתוך ביו-חומרים כמו רשתות תאים 3D נשאר מאתגר מבחינה טכנית21. לכן, פרוטוקול היווצרות כדורי המוצג כאן ממליץ על titration של ריכוזי MC ואופטימיזציה עם נקודות זמן שונות עבור כל קו תא CRC. מאפיינים ספציפיים לקו התא, כגון צבירת תאים, כדאיות ומוות, יכולים להשפיע באופן משמעותי על כל אחד מהתנאים שבדקנו. שיטה זו יכולה לספק אמצעי ליצירת כדוריות אחידות לבדיקת LCFS על תאים סרטניים.
פרוביוטיקה, שהם חיידקים מועילים, לייצר מטבוליטים פעילים שיכולים לחקות השפעות אנטי סרטניות. לכן, המחקר שלנו נועד לבודד חיידקי חומצה לקטית (LAB) ולבדוק את ההשפעות האנטי סרטניות של תמציות חילוף החומרים שלהם מן הנטיות ללא תאים (CFS). המחקרים שלנו סיפקו שיטה להתבוננות בהשפעות של מזונות-על נטולי תאי תסיסה L. שגורמת למוות תאי אפופטוטי בתאי סרטן המעי הגס במערכת תלת-ממדית. רמות mRNA של סמני אפופטוזיס המעורבים במסלולים אפופטוטיים מושרים באופן דרמטי לאחר חשיפה LCFS בתנאים 3D. יתר על כן, רמות מופחתות של PARP1 ו- BCL-XL באו לידי ביטוי בבקרת הכדורידים 3D שטופלו ב- LCFS בהשוואה לבקרה באיור 4C, D,E. עיכוב של הפעלת NF-κB היה, גם, נצפתה בתרבויות 3D לאחר טיפול עם LCFS. יחד, היתרונות של תאים פולחניים בתלת-ממד כוללים הגדלת האינטראקציות בין תאי התא ותגובות למולקולות איתות כדי לחקות טוב יותר במערכות vivo. סופג מערבי באמצעות כדוריות יכול להוביל תובנות כמותיות על המצב של מולקולות איתות שונות.
קווי תאים יש מגבלות מסוימות כמודלים פרה-אקליניים של מחקר סרטן. לאחרונה, organoids סרטן נוצלו במודלים של טיפול אנטי סרטני אישי22,23. הטיפול של LCFS עם פרוביוטיקה באורגנוידים צפוי לשמש פלטפורמה חזקה כדי לבדוק השפעות אנטי סרטניות. יתר על כן, בדקנו רק אחד ממיני לקטובצילוס בין הפרוביוטיקה השונה במודל הסרטן. פרוביוטיקה שונים הם, גם, נבדקים למניעת תסמונת מטבולית, הפרעות אימונולוגיות, ונוירולוגיות24,25,26. LCFS מ Bifidobacterium, Saccharomyces, סטרפטוקוקוס, Enterococcus, ו Akkermansia מינים הם מועמדים פוטנציאליים לבדיקת יתרונות בריאותיים באמצעות סוגים שונים של מודלים למחלות27,28,29.
בהתבסס על מחקר זה, ניתן להסיק כי ההבנה של איתות בספירואידים ואת התגובות השונות לטיפול LCFS במודלים 3D עשוי להיות מועיל לבדיקת השפעות אנטי סרטניות באמצעות השיטה שהצענו. בנוסף, מודלים תלת-ממדיים של סרטן יכולים לספק מספר יתרונות שאינם אפשריים עם monolayers 2D מסורתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין גילויים פיננסיים רלוונטיים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי "קביעת תקני מדידה לכימיה וקרינה", מספר המענק KRISS-2020-GP2020-0003, ו"פיתוח תקני מדידה וטכנולוגיה לביו-חומרים והתכנסות רפואית", מספר המענק KRISS-2020-GP2020-0004, במימון מכון המחקר של קוריאה לתקנים ומדעים. מחקר זה נתמך גם על ידי משרד המדע ו- ICT (MSIT), קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF-2019M3A9F3065868), משרד הבריאות והרווחה (MOHW), המכון לפיתוח תעשיית הבריאות בקוריאה (KHIDI, HI20C0558), משרד המסחר, התעשייה והאנרגיה (MOTIE) והמכון להערכה של קוריאה לטכנולוגיה תעשייתית (KEIT, 20009350). תעודת זהות ORCID (הי מין יו: 0000-0002-5951-2137; דוקג'ין קאנג: 0000-0002-5924-9674; סליל קים: 0000-0003-3465-7118; ג'ו-און לי: 0000-0002-2495-1439; ג'ינה לי: 0000-0002-3661-3701). אנו מודים לפארק צ'אנג וו על הסיוע בניסויים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti - p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
References
- Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
- Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
- Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
- Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
- Harish, K., Varghese, T.
- Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557 (2019).
- Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886 (2018).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
- Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
- Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
- Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
- Drost, J., Clevers, H.
- Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
- Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F.
- Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
- Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
- Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711 (2019).
- Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).
