Summary
Aqui são apresentados métodos para entender os efeitos anticânculos do supernatante livre de células Lactobacillus (LCFS). As linhas de células cancerígenas colorretais mostram mortes celulares quando tratadas com LCFS em culturas 3D. O processo de geração de esferoides pode ser otimizado dependendo do andaime e os métodos de análise apresentados são úteis para avaliar as vias de sinalização envolvidas.
Abstract
Este manuscrito descreve um protocolo para avaliar as mortes de células cancerígenas em esferoides tridimensionais (3D) de tipos multicelulares de células cancerígenas usando supernacantes da cultura celular fermentum Lactobacillus, consideradas culturas probióticas. O uso de culturas 3D para testar o supernante livre de células Lactobacillus (LCFS) é uma opção melhor do que testar em monocamadas 2D, especialmente porque l. fermentum pode produzir efeitos anti-câncer dentro do intestino. L. fermentum supernante foi identificado por possuir efeitos anti-proliferativos aumentados contra várias células de câncer colorretal (CRC) em condições de cultura 3D. Curiosamente, esses efeitos estavam fortemente relacionados com o modelo de cultura, demonstrando a notável capacidade de L. fermentum para induzir a morte celular cancerígena. Esferoides estáveis foram gerados a partir de diversos CRCs (células cancerosas colorretais) utilizando o protocolo apresentado abaixo. Este protocolo de geração de spheroid 3D é uma economia de tempo e rentável. Este sistema foi desenvolvido para investigar facilmente os efeitos anticâncológicos do LCFS em vários tipos de spheroids CRC. Como esperado, os spheróides crc tratados com LCFS induziram fortemente a morte celular durante o experimento e expressaram marcadores moleculares específicos de apoptose, conforme analisado por qRT-PCR, manchas ocidentais e análise FACS. Portanto, este método é valioso para explorar a viabilidade celular e avaliar a eficácia de medicamentos anticâncológicos.
Introduction
Os probióticos são os microrganismos mais vantajosos no intestino que melhoram a homeostase imunológica e o metabolismo energético hospedeiro1. Os probióticos de Lactobacillus e Bifidobacterium são os mais avançados do seu tipo encontrados no intestino2,3. Investigações anteriores mostraram que Lactobacillus tem efeitos inibitórios e antiproliferativos em vários cânceres, incluindo câncer colorretal4. Além disso, os probióticos previnem doenças inflamatórias intestinais, doença de Crohn e colite ulcerativa5,6. No entanto, a maioria dos estudos com probióticos foram realizados em monocamadas bidimensionais (2D) cultivadas em superfícies sólidas.
Sistemas de cultura artificial carecem de características ambientais, o que não é natural para células cancerosas. Para superar essa limitação, foram desenvolvidos sistemas de cultura tridimensionais (3D)7,8. Células cancerígenas em 3D apresentam melhorias em termos de mecanismos biológicos básicos, como viabilidade celular, proliferação, morfologia, comunicação celular, sensibilidade a medicamentos e relevância in vivo9,10. Além disso, os esferoides são feitos de tipos multicelulares de câncer colorretal e dependem de interações célula-células e da matriz extracelular (ECM)11. Nosso estudo anterior relatou que o supernaente probiótico livre de células (CFS) produzido usando o fermentum Lactobacillus mostrou efeitos anticânculos nas culturas 3D das células de câncer colorretal (CRC)12. Propusemos que o CFS é uma estratégia alternativa adequada para testar efeitos probióticos em esferoides 3D12.
Aqui, apresentamos uma abordagem que pode acomodar tipos multicelulares de câncer colorretal 3D para a análise de efeitos terapêuticos de supernanato probiótico livre de células (CFS) em vários sistemas de imitação de câncer colorretal 3D. Este método fornece um meio para a análise de efeitos probióticos e anticâncicos relacionados in vitro.
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Protocol
1. Culturas celulares bacterianas e preparação de supernanato livre de células Lactobacillus (LCFS)
NOTA: As etapas 1.2 – 1.9 são realizadas em câmara anaeróbica.
- Prepare uma placa de ágar MRS e caldo contendo L-cisteína e esterilize por autoclaving.
- Pré-incubar a placa de ágar MRS em H2 câmara anaeróbica mantida a 37 °C com 20 ppm de oxigênio.
- Descongele o caldo bacteriano Lactobacillus e inocula a placa de ágar com a cultura bacteriana (Figura 1A (i)).
- Incubar bactérias por 2 a 3 dias em H2 câmara anaeróbica a 37 °C e 20 ppm de oxigênio até que sejam obtidas colônias bacterianas únicas.
- Lave e seque o tubo de cultura aneróbica do tipo Hungate. Autoclave o tubo de cultura a 121 °C por 15 min.
- Em seguida, incubar o tubo na câmara anaeróbica H2 a 37 °C e 20 ppm de oxigênio para remover oxigênio.
- Coloque 2 - 3 mL de caldo MRS no tubo. Sele o tubo com uma rolha de borracha de butyl e enrosque a tampa.
- Obtenha uma única colônia com um laço e coloque-a no tubo de cultura de 1,5 mL com 500 μL de 1x PBS. (Figura 1A (ii)).
- Suspenda a colônia usando uma seringa de 1 mL (Figura 1A (iii). Faça isso inserindo a agulha da seringa de 1 mL no centro da tampa do tubo, aspirando a colônia suspensa e, em seguida, reutilizando-a de volta na mídia de caldo MRS. (Figura 1A (iv)).
- Incubar a mídia de caldo MRS em uma incubadora de shaker por 2 dias (37 °C, 5% DE CO2, 200 rpm).
- Meça a densidade óptica (OD) usando um espectotômetro para monitorar as curvas de crescimento bacteriana até que a absorção em OD620 atinja 2,0.
- Separe as pelotas bacterianas e a mídia condicionada por centrifugação a 1.000 x g por 15 min. Lave as pelotas bacterianas coletadas com 1x PBS e resuspend em 4 mL de RPMI 1640 suplementada com soro bovino fetal de 10%. Não inclua antibióticos no meio.
- Mantenha as pelotas bacterianas em RPMI e incubar em uma incubadora de shaker por 4h a 37 °C com 5% de CO2 a uma velocidade de 100 rpm.
- Para a preparação do supernanato probiótico, remova a pelota bacteriana através de centrifugação a 1000 x g,por 15 min a 4 °C. Filtro estéril o supernanato recuperado usando um filtro de 0,22 μm e armazene a −80 °C até usar.
2. Geração de esferoides
-
Preparando linhas de células cancerígenas colorretais
- Cresça as linhas celulares DLD-1, HT-29 e WiDr como monocamadas até 70-80% de confluência e incubar a placa a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5% (Meio de crescimento: RPMI contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina).
- Para células cultivadas em placa de Petri de 100 mm, lave a placa duas vezes com 4 mL de 1x PBS. Adicione 1 mL de 0,25% de trippsina-EDTA e incubar a placa de Petri por 2 min a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5% para dissociar as células.
- Após a incubação, verifique se há dissociação celular sob um microscópio e neutralize a trippsina-EDTA com 5 mL de meio de crescimento.
- Transfira as células dissociadas para um tubo cônico de 15 mL e centrífuga por 3 min a 300 x g.
- Descarte o supernatante e resuspend suavemente com 3 mL de mídia de crescimento.
- Conte as células com azul tripano para determinar células viáveis usando um hemócito. (Figura 1B (i))
-
Formação esferoide
- Em um tubo cônico de 15 mL, dilui as células de 2,1,5 para obter 1 - 2 x 105 células/mL (Figura 1B (ii))
- Adicione concentração final de 0,6% de metilcelulose à suspensão celular e transfira as células diluídas para um reservatório estéril.
NOTA: Para cada linha celular, a quantidade de metilcelulose necessária deve ser titulada e determinada em conformidade. - Use uma pipeta multicanal para distribuir 200 μL de células para cada poço de um acessório ultra-baixo de 96 poços de microplacão traseiro redondo. (Figura 1B (iii))
- Incubar a placa a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5% por 24 a 36 h.
- Após 24 - 36 h, observe a placa sob um microscópio leve para garantir a formação de esferoides.
3. Tratar células cancerígenas colorretais 3D com LCFS
- Gerar esferoides como descrito nas etapas 2 e 3.
- Antes de realizar o tratamento LCFS, descongele o LCFS congelado à temperatura ambiente (RT) por 10 a 20 min.
- Inocular a solução de estoque LCFS em um meio de crescimento. Diluir em série para 25%, 12,5% e 6% no meio de crescimento (ou seja, 25% LCFS = 150 μL de crescimento médio + 50 μL de LCFS).
- Retire a placa de cultura celular contendo esferoides da incubadora e remova o máximo possível do meio de crescimento de cada poço usando uma pipeta de 200 μL.
- Adicione a mídia de crescimento com LCFS nas células e incubar a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5% para 24 - 48 h.
NOTA: O volume a ser utilizado dependerá do tamanho da placa da seguinte forma: 2 mL para placas de cultura celular de 6 poços; 200 μL para placas de cultura celular de 96 poços.
4. Viabilidade celular para esferoides
- Prepare 8 - 10 esferoides de câncer colorretal tratados com LCFS em placas multi-bem de paredes opacas (ensaios de viabilidade celular são realizados 48 h após o tratamento LCFS).
- Descongele o reagente de viabilidade celular (ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante a noite.
- Equilibre o reagente de viabilidade celular à temperatura ambiente antes do uso.
- Antes de realizar o ensaio, remova 50% da mídia de crescimento dos esferoides.
- Adicione 100 μL de reagente de viabilidade celular a cada poço.
NOTA: O volume a ser utilizado dependerá do tamanho da placa da seguinte forma: 100 μL para placas de cultura celular de 96 poços. - Misture o reagente vigorosamente por 5 minutos para promover a lise celular.
- Incubar por 30 min – 2 h a 37 °C.
- Regisso recorde a luminescência.
5. Análise quantitativa de reação em cadeia de polimerase em tempo real para esferoides
- Para cada condição, prepare 10 a 15 esferoides em um tubo de 2 mL e centrífuga por 3 min a 400 x g.
- Descarte o supernatante e lave os esferoides duas vezes em 1 mL de 1x PBS gelado.
NOTA: Evite a centrifugação, deixe os spheróides se acalmarem. - Aspire o máximo possível do PBS 1x e isole o RNA usando um kit comercialmente disponível.
- Sintetizar cDNA a partir de 1 μg de RNA usando um kit comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante.
- Prepare uma mistura mestra para executar todas as amostras em triplicado (ver Tabela 1 e Tabela 2).
- Execute bem a amplificação em 20 μL da mistura mestre do modelo em cada placa qPCR.
- Misture bem as reações e gire se necessário.
- Executar amostras conforme as recomendações do fabricante do instrumento(Tabela 3).
6. Mancha ocidental de esferoides
NOTA: Ao coletar esferoides, use uma pipeta de 200 μL e corte a extremidade das pontas para evitar perturbar sua estrutura.
- Para cada condição, prepare 30 a 40 esferoides em um tubo de 2 mL.
- Coloque o tubo no gelo e deixe os esferoides se acomodarem até o fundo do tubo de 2 mL.
- Descarte o supernatante e lave os esferoides duas vezes em 1 mL gelado 1x PBS
NOTA: Evite a centrifugação, deixe os spheróides se acalmarem. - Aspire o máximo possível do PBS 1x e adicione tampão RIPA com um coquetel inibidor de protease (10 esferoides = 30 μL de tampão RIPA).
- Lyse as células por pipetting para cima e para baixo e realize a sonicação para 30 s com 30 s de descanso no gelo por 10 ciclos.
- Centrifugar as proteínas lysates a 15000 x g para 15 min a 4 °C.
- Determine a concentração de proteína para cada lise celular.
- Antes de carregar, ferva cada célula em um tampão de amostra a 100 °C por 10 minutos.
- Carregue quantidades iguais de proteína nos poços do gel SDS-PAGE e execute o gel por 1 - 2 h a 100 V.
- Transfira a proteína do gel para a membrana PVDF.
- Após a transferência, bloqueie a membrana por 1h à temperatura ambiente usando um tampão de bloqueio (5% de leite desnatado + TBS com 0,05% Tween-20).
- Incubar a membrana com diluições de 1:1.000 de anticorpo primário(Tabela 4) em 1x TBST com tampão BSA de 5% a 4 °C durante a noite.
- Lave a membrana três vezes com TBST, 15 min para cada lavagem.
- Incubar a membrana com diluições de 1:2.500 de anticorpo secundário no tampão de bloqueio à temperatura ambiente por 2 h (ver Tabela de Materiais).
- Lave a membrana três vezes com TBST, 15 min para cada lavagem.
- Prepare a membrana para detecção de HRP com um substrato chemiluminescente.
- Adquira imagens quemiluminescentes.
7. Mancha de esferida de propidium (PI) de esferoides
- Prepare 5-10 esferoides conforme descrito na Etapa 4.1 e coloque os esferoides em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
- Diluir um estoque de 1 mg/mL de PI 1:100 em 1x PBS.
- Retire 50% do meio de cada poço da placa de 96 poços.
- Adicione 100 μL da solução PI para cada poço e coloque os poços em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 10 a 15 min.
- Lave a solução PI com 1x PBS.
- Adicione 200 μL de meio de crescimento e tire uma imagem usando um microscópio de fluorescência. Analise a intensidade da fluorescência usando a imagem J para obter a contagem de viabilidade do esferoide.
8. Análise FACS de esferoides
- Gerar esferoides como descrito anteriormente.
- Para cada condição, prepare 30 - 40 esferoides em um tubo FACS e centrífuga por 3 min a 400 x g e RT.
- Aspire o supernasal e lave os esferoides em 3 mL de 1x PBS, depois centrífuga a 400 x g por 3 min a 4 °C.
- Aspire o supernaente e adicione 200 μL de 0,25% Trypsin-EDTA, depois incubar na RT por 2 -3 min.
NOTA: O tempo de incubação depende do tamanho esferoide e do tipo celular. - Adicione 1 mL de tampão FACS e dissocia suavemente os esferoides usando uma pipeta de 200 μL.
- Centrifugar as células dissociadas a 400 x g e 4 °C por 3 min.
NOTA: Tampão FACS = 1x PBS + 2,5% FBS, filtrado usando um filtro superior de 0,22 μm. - Descarte o supernasal e adicione reagente 7-AAD/Annexin V (7AAD (5 μL), Anexo V (5 μL)/amostra).
- Vórtice suavemente as células e incubar por 13 - 30 min no RT no escuro.
- Adicione 500 μL de tampão FACS e filtre as células usando tubos de teste de poliestireno cônico para remover células agregadas.
- Centrifugar a 400 x g e 4 °C por 3 min.
- Adicione 500 μL de tampão de ligação Anexo V a cada tubo e resuspend.
- Analise usando um citômetro de fluxo.
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Representative Results
Descrevemos o protocolo de obtenção de esferoides de diversas linhas de células cancerígenas colorretais. A suplementação com metilcelulose foi necessária para gerar esferoides. Também apresentamos um método de preparação do LCFS e apresentamos um modelo para estudar a correlação entre probióticos e câncer colorretal. Os protocolos de formação de spheroid e LCFS são ilustrados esquematicamente na Figura 1A,B. Como mostrado na Figura 2A,a concentração de metilcelulose de 0,6% transforma as células cancerígenas em esferoides compactos. Este resultado indica que os esferoides podem ser gerados a partir de vários tipos de câncer colorretal usando nosso protocolo de metilcelulose. Em seguida, os esferoides foram tratados com 25% de LCFS e a morfologia foi estudada após 48 h usando um microscópio leve. Como mostrado na Figura 3A,os esferoides dos grupos tratados com LCFS exibiram superfícies rompidas. Para investigar os efeitos anticâncológicos da LCFS em concentrações adequadas, os esferoides foram tratados por 48 h com várias doses de LCFS: 0 (controle), 6%, 12,5% e 25%. Interrupções na morfologia esferoide foram observadas em esferoides tratados com 25% de LCFS, como mostra a Figura 3B. Além disso, os esferoides foram tratados com 25% de LCFS para 24h e 48 h, e foram observadas interrupções na morfologia esferoide após 48h de tratamento. Imagens microscópicas dos esferoides são mostradas na Figura 3C.
Após 48 h, as amostras foram avaliadas com ensaio de viabilidade celular, e a morte de células cancerígenas colorretais foi observada após o tratamento com LCFS de forma dependente da dose, maior a quantidade de LCFS maior que a morte celular observada(Figura 3D). Manchamos, então, as amostras com iodeto de propídio (PI) para observar apoptose. Como esperado, a indução da apoptose dependia da dose LCFS (Figura 4A,B,C). O RT-PCR foi realizado para detectar as alterações nos marcadores moleculares da apoptose, ou seja, BAX, BAK e NOXA (Figura 5A,B). Por fim, foram estudados marcadores de apoptose utilizando-se manchas ocidentais e anexas V/7AAD através de FACS (Figura 6A,B,C,D). Essas observações mostram que o LCFS induziu efetivamente apoptose no modelo 3D.
Figura 1: Representação esquemática da formação esferoide e preparação do LCFS.
(A) As imagens de representação esquemática do protocolo de geração LCFS são marcadas por (i-iv) (B) Os esquemas da formação esferoide mediada por metilcelulose são marcados por (i-iii). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Formação esferoide mediada por metilcelulose.
(A) Imagens representativas da formação esferoide mediada por metilcelulose de HT-29, DLD1 e WiDr. As células foram semeadas em placas inferiores de 96 poços com concentrações de metilcelulose de 0,1-1,2% para 48 h. Barra de escala 10 μm (n=3 para cada experimento). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação da concentração de LCFS e morfologia esferoida.
(A) Imagens representativas do HT-29 tratado com LCFS por 48 h. Barra de escala 100 μm. (B) HT-29, DLD1 e WiDr spheroids tratados com doses crescentes de LCFS por 48 h. Todos os esferoides tinham bordas rompidas em 12,5-25% LCFS. Barra de escala 20 μm (n=3 para cada experimento) (C) Morfologias esferoides de spheroids HT-29, DLD1 e WiDr tratadas com 25% de LCFS para 24 e 48 h. Barra de escala 20 μm (n = 3) (D) Viabilidade celular medida, mostrada como média ± SEM. ***, P < 0,05 (n = 3 para cada experimento). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Mancha de iodeto de propidium dos esferoides.
Imagens representativas da mancha de PI em (A) HT-29, (B) DLD1, e(C) WiDr spheroids após 48 h de tratamento LCFS. As imagens foram adquiridas utilizando um microscópio de fluorescência e o aumento da intensidade de PI foi medido utilizando-se a barra de escala image J. 10 μm. A média ± SEM é mostrada. , P < 0,05 (n = 3 para cada experimento). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Foram identificados marcadores de apoptose utilizando-se qRT-PCR.
Foram quantificados marcadores de apoptose, como BAX, BAK e NOXA. a quantificação mRNA é apresentada como uma expressão relativa normalizada para (A) β-actin e (B) 18s rRNA. A média ± SEM é mostrada. , P < 0,05 (n=3 para cada experimento). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Os marcadores de apoptose foram determinados através da mancha ocidental e da análise FACS dos esferoides.
Na figura estão manchas ocidentais de (A) HT-29, (B) DLD1, e(C) Células WiDr após o tratamento LCFS. Foram detectados PARP1, BCL-XL e p-IκBα. β-actin foi usado como controle interno. (D) Análise FACS de apoptose em esferoides HT-29, DLD1 e WiDr incubados com LCFS. As células apoptóticas foram detectadas pelo aumento da intensidade de fluorescência do Anexo V-FITC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reação | Volume por único 20 μL |
| Mistura qPCR de 2X | 10 μL |
| Primer para a frente (10 pmols/μL) | 1 μL |
| Primer reverso (10 pmols/μL) | 1 μL |
| cDNA (50 ng/μL) | 1 μL |
| Água de grau PCR | 7 μL |
Tabela 1: Mistura de reação PCR.
| Cartilha | Seqüenciar |
| BAX-Forward | CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG |
| BAX-Reverso | CCAGCCCATGATGGTTCTGAT |
| BAK-Forward | ATGGTCACCTTACCTCTGCAA |
| BAK-Reverso | TCATAGCGTCGGTTGATGTCG |
| NOXA-Para a frente | ACCAAGCCGGATTTGCGATT |
| NOXA-Reverso | ACTTGCACTTGTTCCTCGTGG |
| 18s rRNA-Forward | GATGGGGCGGAAAAATAG |
| 18s rRNA-Reverse | GCGTGGATTCTGCATAATGGT |
| β-Actin-Forward | TCCTGTGGCATCCACGAAACT |
| β-Actin-Reverse | GAAGCATTTGCGGTGGACGAT |
Tabela 2: Sequências de primer utilizadas na análise qRT-PCR.
| Palco | Temperatura (ºC) | Hora |
| Desnaturação inicial | 95 | 10 min. |
| 40 ciclos: | ||
| Passo 1 | 95 | 15 seg |
| Passo 2 | 60 | 60 seg |
| Estágio de curva de fusão | 95 | 15 seg |
| 60 | 60 seg | |
| 95 | 15 seg | |
Tabela 3: condições qRT-PCR.
| Anticorpo | Diluição |
| PARP 1 (C2-10) | 1:1000 |
| BCL-XL (H-5) | 1:1000 |
| p-IκBα (B-9) | 1:1000 |
| β-actin (C4) | 1:1000 |
| IgG anti-rato de cabra (H+L) | 1:2500 |
| IgG anti-coelho de cabra (H+L) | 1:2500 |
Tabela 4: Anticorpos usados na análise de manchas ocidentais.
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Discussion
O microambiente tecidual, incluindo células vizinhas e a matriz extracelular (ECM), é fundamental para a geração de tecidos e crucial no controle do crescimento celular e desenvolvimento de tecidos13. No entanto, as culturas 2D têm diversas desvantagens, como a interrupção das interações celulares, bem como alterações na morfologia celular, ambientes extracelulares e a abordagem da divisão14. Os sistemas de cultura celular 3D foram rigorosamente estudados para melhor reprodução dos efeitos in vivo, e foram comprovados como sistemas mais precisos para testes in vitro de câncer15,16. Há necessidade de sistemas de modelos preverem com mais precisão respostas personalizadas à quimioterapia17.
Andaimes 3D foram desenvolvidos para engenharia de tecidos. Atua como uma perda de ECM, representando o espaço disponível das células tumorais. Além disso, o andaime proporciona interações físicas para a adesão e proliferação celular e faz com que as células formem distribuições espaciais adequadas e interações célula-ECM ou células18. O polímero de metilcelulose (MC) tem sido continuamente estudado para determinar sua adequação na geração de sistemas de hidrogel baseados em MC para aplicações em engenharia de cultura de células 3D19,20. No entanto, a incorporação intacta desses hidrogéis em biomateriais como redes de células 3D permanece tecnicamente desafiadora21. Portanto, o protocolo de formação de esfóides aqui apresentado recomenda a titulação das concentrações de MC e otimização com vários pontos de tempo para cada linha celular CRC. Características específicas da linha celular, como agregação celular, viabilidade e morte, podem afetar significativamente cada uma das condições que testamos. Este método pode fornecer um meio de gerar esferoides uniformes para testar LCFS em células cancerosas.
Os probióticos, que são bactérias benéficas, produzem metabólitos ativos que podem potencialmente imitar efeitos anticâncológicos. Assim, nosso estudo foi projetado para isolar bactérias de ácido láctico (LAB) e testar os efeitos anticânculares de seus extratos metabólicos de supernantes livres de células (CFS). Nossos estudos forneceram um método para observar os efeitos de supernantes livres de células L. fermentum que induz a morte celular apoptótica em células cancerígenas colorretais em um sistema 3D. Os níveis de mRNA de marcadores de apoptose envolvidos em vias apoptóticas são dramaticamente induzidos após a exposição LCFS em condições 3D. Além disso, os níveis reduzidos de PARP1 e BCL-XL foram expressos no controle 3D 3D tratado pelo LCFS em comparação com o controle na Figura 4C,D,E. A inibição da ativação de NF-κB foi, também, observada em culturas 3D após o tratamento com LCFS. Todas juntas, as vantagens deculturar células em 3D incluem o aumento das interações célula-células e respostas às moléculas de sinalização para melhor imitar sistemas in vivo. Manchas ocidentais usando esferoides podem levar a insights quantitativos sobre o estado de várias moléculas de sinalização.
As linhas celulares têm certas limitações como modelos pré-clínicos de pesquisa sobre câncer. Recentemente, organoides oncológicos têm sido utilizados na modelagem da terapia anticâncer personalizada22,23. Espera-se que o tratamento do LCFS com probióticos em organoides seja usado como uma plataforma poderosa para testar efeitos anticâncizantes. Além disso, só testamos uma das espécies de Lactobacillus entre os vários probióticos no modelo de câncer. Vários probióticos estão, também, sendo testados para a prevenção da síndrome metabólica, imunológica e neurológica24,25,26. As espécies LCFS de Bifidobacterium, Saccharomyces, Streptococcus, Enterococcuse Akkermansia são potenciais candidatas ao teste de benefícios para a saúde através de vários tipos de modelos dedoenças 27,28,29.
Com base neste estudo, pode-se concluir que a compreensão da sinalização em esferoides e as várias respostas ao tratamento LCFS em modelos 3D podem ser benéficas para testar efeitos anticâncológicos usando o método que propusemos. Além disso, modelos de câncer 3D podem fornecer várias vantagens que não são possíveis com as monocamadas 2D tradicionais.
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Disclosures
Os autores não têm divulgações financeiras relevantes.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo "Estabelecimento de padrões de medição para Química e Radiação", número de subvenção KRISS-2020-GP2020-0003, e "Desenvolvimento de Padrões de Medição e Tecnologia para Biomateriais e Convergência Médica", número de subvenção KRISS-2020-GP2020-0004, financiado pelo Korea Research Institute of Standards and Science. Esta pesquisa também contou com o apoio do Ministério da Ciência e TIC (MSIT), Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF-2019M3A9F3065868), Ministério da Saúde e Bem-Estar (MOHW), Instituto de Desenvolvimento da Indústria da Saúde da Coreia (KHIDI, HI20C0558), Ministério do Comércio, Indústria & Energia (MOTIE) e Instituto de Avaliação da Coreia de Tecnologia Industrial (KEIT, 20009350). ID ORCID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Agradecemos ao Parque Chang Woo pela ajuda com experimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti - p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
References
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