Summary
Hier methoden worden gepresenteerd om te begrijpen anti-kanker effecten van Lactobacillus celvrije supernatant (LCFS). Colorectale kankercellijnen tonen celsterfte bij behandeling met LCFS in 3D-culturen. Het proces van het genereren van sferoïden kan worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de steiger en de gepresenteerde analysemethoden zijn nuttig voor het evalueren van de betrokken signaleringsroutes.
Abstract
Dit manuscript beschrijft een protocol om sterfgevallen door kankercellen te evalueren in driedimensionale (3D) sferoïden van meercellige soorten kankercellen met behulp van supernatanten uit lactobacillus fermentumcelcultuur , beschouwd als probioticaculturen. Het gebruik van 3D-culturen om Lactobacillus celvrij supernatant (LCFS) te testen is een betere optie dan testen in 2D-monolagen, vooral omdat L. fermentum antikankereffecten in de darm kan veroorzaken. L. fermentum supernatant bleek verhoogde antiprolifererende effecten te bezitten tegen verschillende colorectale kankercellen (CRC) in 3D-kweekomstandigheden. Interessant is dat deze effecten sterk gerelateerd waren aan het kweekmodel, wat het opmerkelijke vermogen van L. fermentum aantoonde om kankerceldood te induceren. Stabiele sferoïden werden gegenereerd uit verschillende CRC's (colorectale kankercellen) met behulp van het onderstaande protocol. Dit protocol van het genereren van 3D spheroid is tijdbesparend en kosteneffectief. Dit systeem is ontwikkeld om eenvoudig de antikankereffecten van LCFS in meerdere soorten CRC-sferoïden te onderzoeken. Zoals verwacht, crc spheroids behandeld met LCFS sterk geïnduceerde celdood tijdens het experiment en uitgedrukt specifieke apoptosis moleculaire markers zoals geanalyseerd door qRT-PCR, western blotting, en FACS analyse. Daarom is deze methode waardevol voor het onderzoeken van de levensvatbaarheid van cellen en het evalueren van de werkzaamheid van antikankergeneesmiddelen.
Introduction
Probiotica zijn de meest voordelige micro-organismen in de darm die de immuunhomeostase verbeteren en het energiemetabolisme hosten1. Probiotica van Lactobacillus en Bifidobacterium zijn de meest geavanceerde in zijn soort gevonden in de darm2,3. Eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat Lactobacillus remmende en antiproliferatieve effecten heeft op verschillende kankers, waaronder colorectale kanker4. Bovendien voorkomen probiotica inflammatoire darmziekten, de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa5,6. Echter, de meeste studies met probiotica werden uitgevoerd in tweedimensionale (2D) monolagen die worden gekweekt op vaste oppervlakken.
Kunstmatige kweeksystemen missen omgevingskenmerken, wat niet natuurlijk is voor kankercellen. Om deze beperking te overwinnen, zijn driedimensionale (3D) kweeksystemen ontwikkeld7,8. Kankercellen in 3D vertonen verbeteringen in termen van biologische basismechanismen, zoals cel levensvatbaarheid, proliferatie, morfologie, celcelcommunicatie, medicijngevoeligheid en in vivo relevantie9,10. Bovendien zijn sferoïden gemaakt van meercellige soorten colorectale kanker en zijn ze afhankelijk van cel-celinteracties en de extracellulaire matrix (ECM)11. Onze vorige studie heeft gemeld dat probiotische celvrije supernatant (CVS) geproduceerd met behulp van Lactobacillus fermentum toonde anti-kanker effecten op 3D culturen van colorectale kanker (CRC) cellen12. We stelden voor dat CVS een geschikte alternatieve strategie is voor het testen van probiotische effecten op 3D-sferoïden12.
Hier presenteren we een aanpak die geschikt is voor meercellige soorten 3D-colorectale kanker voor de analyse van therapeutische effecten van probiotische celvrije supernatant (CVS) op verschillende 3D-colorectale kanker mimicry systemen. Deze methode biedt een middel voor de analyse van gerelateerde probiotische en anti-kanker effecten in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bacteriële celculturen en bereiding van Lactobacillus celvrij supernatans (LCFS)
OPMERKING: De stappen 1.2 – 1.9 worden uitgevoerd in een anaerobe kamer.
- Bereid een MRS-agarplaat en bouillon met L-cysteïne en steriliseer door autoclaaf.
- Voorbevroom de MRS-agarplaat in de anaerobe H2-kamer bij 37 °C met 20 ppm zuurstof.
- Ontdooi lactobacillus bacteriebestand en ent de agarplaat met de bacteriecultuur (figuur 1A (i)).
- Incubeer bacteriën gedurende 2 - 3 dagen in H2 anaerobe kamer bij 37 °C en 20 ppm zuurstof totdat enkelvoudige bacteriële kolonies worden verkregen.
- Was en droog de Anerobische kweekbuis van het Hungate-type. Autoclaaf de kweekbuis bij 121 °C gedurende 15 min.
- Incubeer vervolgens de buis in H2 anaerobe kamer bij 37 °C en 20 ppm zuurstof om zuurstof te verwijderen.
- Plaats 2 - 3 ml MRS-bouillon in de buis. Sluit de buis af met een butylrubberen stop en schroef de dop vast.
- Verkrijg een enkele kolonie met een lus en plaats deze in de 1,5 ml kweekbuis met 500 μL 1x PBS. (Figuur 1A, onder ii)).
- Schors de kolonie met een spuit van 1 ml (figuur 1A (iii)). Doe dit door de naald van de 1 ml spuit in het midden van het buisdeksel te steken, de zwevende kolonie te aspireren en vervolgens terug te suspenden in de MRS-bouillonmedia. (Figuur 1A (iv)).
- Incubeer de MRS bouillonmedia gedurende 2 dagen in een shaker incubator (37 °C, 5% CO2, 200 tpm).
- Meet de optische dichtheid (OD) met behulp van een spectrofotometer om bacteriële groeicurven te bewaken totdat de absorptie bij OD620 tot 2,0 reikt.
- Scheid de bacteriële pellets en de geconditioneerde media door gedurende 15 minuten bij 1.000 x g te centrifugeren. Was de verzamelde bacteriële pellets met 1x PBS en resuspend in 4 ml RPMI 1640 aangevuld met 10% foetale runderserum. Neem geen antibiotica op in het medium.
- Houd de bacteriële pellets in RPMI en incubeer in een shaker incubator gedurende 4 uur bij 37 °C met 5% CO2 bij een snelheid van 100 tpm.
- Voor de bereiding van de probiotische supernatans, verwijder de bacteriële pellet via centrifugeren bij 1000 x g, gedurende 15 minuten bij 4 °C. Filter het teruggewonnen supernatant steriel met een filter van 0,22 μm en bewaar het bij −80 °C tot gebruik.
2. Generatie van sferoïden
-
Het voorbereiden van colorectale kankercellijnen
- Kweek DLD-1, HT-29 en WiDr cellijnen als monolagen tot 70-80% samenvloeiing en incubeer de plaat bij 37 °C in een 5% CO2 incubator (Groeimedium: RPMI met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine).
- Voor cellen gekweekt in 100 mm Petrischaal, was de plaat twee keer met 4 ml 1x PBS. Voeg 1 ml 0,25% trypsine-EDTA toe en incubeer de Petrischaal gedurende 2 minuten bij 37 °C in een CO2-incubator van 5% om de cellen te dissociaten.
- Controleer na incubatie op de celdissociatie onder een microscoop en neutraliseer trypsine-EDTA met 5 ml groeimedium.
- Breng de gedissocieerde cellen over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 300 x g.
- Gooi het supernatant weg en resuspend voorzichtig met 3 ml groeimedia.
- Tel de cellen met trypan blauw om levensvatbare cellen te bepalen met behulp van een hemocytometer. (Figuur 1B (i))
-
Sferoïde vorming
- Verdun in een conische buis van 15 ml de cellen van 2,1,5 om 1 - 2 x 105 cellen/ml te verkrijgen (figuur 1B (ii))
- Voeg de eindconcentratie van 0,6% methylcellulose toe aan de celsuspensie en breng de verdunde cellen over naar een steriel reservoir.
OPMERKING: Voor elke cellijn moet de benodigde hoeveelheid methylcellulose worden getitreerd en dienovereenkomstig worden bepaald. - Gebruik een meerkanaals pipet om 200 μL cellen af te geven aan elke put van een ultralage bevestiging 96-put ronde bodemmicroplaat. (Figuur 1B ( iii))
- Incubeer de plaat bij 37 °C in een CO2-incubator van 5% gedurende 24 - 36 uur.
- Observeer na 24 - 36 uur de plaat onder een lichtmicroscoop om sferoïde vorming te garanderen.
3. Behandeling van 3D colorectale kankercellen met LCFS
- Genereer sferoïden zoals beschreven in stap 2 en 3.
- Ontdooi de bevroren LCFS vóór het uitvoeren van de LCFS-behandeling gedurende 10 - 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Ent de LCFS-voorraadoplossing in een groeimedium. Serieel verdunnen tot 25%, 12,5% en 6% in het groeimedium (d.w.z. 25% LCFS = 150 μL groeimedium + 50 μL LCFS).
- Haal de celkweekplaat met sferoïden uit de incubator en verwijder zoveel mogelijk van het groeimedium uit elke put met behulp van een pipet van 200 μL.
- Voeg de groeimedia met LCFS toe aan de cellen en incubeer bij 37 °C in een CO2-incubator van 5% gedurende 24 - 48 uur.
OPMERKING: Het te gebruiken volume is als volgt afhankelijk van de plaatgrootte: 2 ml voor 6-put celkweekplaten; 200 μL voor 96-put celkweekplaten.
4. Levensvatbaarheid van cellen voor sferoïden
- Bereid 8 - 10 met LCFS behandelde colorectale kankersferoïden voor in ondoorzichtige meerputplaten (cel levensvatbaarheidstesten worden 48 uur na lcfs-behandeling uitgevoerd).
- Ontdooi het celreagens (zie tabel met materialen)bij 4 °C voor een nacht.
- Equilibreer het cel levensvatbaarheidsreagens tot kamertemperatuur voor gebruik.
- Verwijder voor het uitvoeren van de test 50% van de groeimedia uit de sferoïden.
- Voeg 100 μL cel levensvatbaarheidsreagens toe aan elke put.
OPMERKING: Het te gebruiken volume is als volgt afhankelijk van de plaatgrootte: 100 μL voor 96-put celkweekplaten. - Meng het reagens gedurende 5 minuten krachtig om cellysis te bevorderen.
- Incubeer gedurende 30 min – 2 uur bij 37 °C.
- Neem de luminescentie op.
5. Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactieanalyse voor sferoïden
- Bereid voor elke toestand 10 - 15 sferoïden in een buis van 2 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 400 x g.
- Gooi het supernatant weg en was de sferoïden tweemaal in 1 ml ijskoud 1x PBS.
OPMERKING: Vermijd centrifugeren, laat de sferoïden bezinken. - Aspireer zoveel mogelijk van de 1x PBS en isoleer RNA met behulp van een in de handel verkrijgde kit.
- Synthetiseer cDNA vanaf 1 μg RNA met behulp van een in de handel verkrijgbaar pakket volgens het protocol van de fabrikant.
- Bereid een mastermix voor om alle monsters in drievoud uit te voeren (zie tabel 1 en tabel 2).
- Voer de versterking uit in een 20 μL van de sjabloon master mix in elke qPCR plaat goed.
- Meng reacties goed en draai indien nodig.
- Voer monsters uit volgens de aanbevelingen van de fabrikant van het instrument (tabel 3).
6. Westerse blotting van sferoïden
OPMERKING: Gebruik bij het verzamelen van sferoïden een pipet van 200 μL en snijd het uiteinde van de uiteinden door om te voorkomen dat de structuur wordt verstoord.
- Bereid voor elke aandoening 30 - 40 sferoïden in een buis van 2 ml.
- Plaats de buis op ijs en laat de sferoïden tot op de bodem van de buis van 2 ml bezinken.
- Gooi het supernatant weg en was de sferoïden tweemaal in 1 ml ijskoud 1x PBS
OPMERKING: Vermijd centrifugeren, laat de sferoïden bezinken. - Aspireer zoveel mogelijk van de 1x PBS en voeg RIPA buffer toe met een protease inhibitor cocktail (10 sferoïden = 30 μL RIPA buffer).
- Lyse de cellen door pipetten op en neer en uitvoeren sonicatie voor 30 s met 30 s rusten op ijs voor 10 cycli.
- Centrifugeer het eiwitlysaten bij 15000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.
- Bepaal de eiwitconcentratie voor elk cellysaat.
- Kook voor het laden elke cel lysaat gedurende 10 minuten in een monsterbuffer bij 100 °C.
- Laad gelijke hoeveelheden eiwit in de putten van de SDS-PAGE gel en voer de gel 1 - 2 uur uit op 100 V.
- Breng het eiwit over van de gel naar het PVDF-membraan.
- Blokkeer na het overbrengen het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met behulp van een blokkeerbuffer (5% magere melk + TBS met 0,05% Tween-20).
- Incubeer het membraan met 1:1.000 verdunningen van primair antilichaam (Tabel 4) in 1x TBST met 5% BSA buffer bij 4 °C 's nachts.
- Was het membraan drie keer met TBST, 15 minuten voor elke wasbeurt.
- Incubeer het membraan met 1:2.500 verdunningen van secundair antilichaam in de blokkeerbuffer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur (zie tabel met materialen).
- Was het membraan drie keer met TBST, 15 minuten voor elke wasbeurt.
- Bereid het membraan voor op HRP-detectie met een chemiluminescent substraat.
- Verkrijg chemiluminescente afbeeldingen.
7. Propidium jodide (PI) kleuring van sferoïden
- Bereid 5-10 sferoïden zoals beschreven in stap 4.1 en plaats de sferoïden in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Verdun een voorraad van 1 mg/ml PI 1:100 in 1x PBS.
- Verwijder 50% van het medium uit elke put van de 96-put plaat.
- Voeg 100 μL van de PI-oplossing toe aan elke put en plaats de putten in een incubator op 37 °C en 5% CO2 gedurende 10 - 15 minuten.
- Was de PI-oplossing uit met 1x PBS.
- Voeg 200 μL groeimedium toe en maak een beeld met een fluorescentiemicroscoop. Analyseer de fluorescentie-intensiteit met behulp van afbeelding J om het aantal levensvatbaarheid van de sferoïde te krijgen.
8. FACS-analyse van sferoïden
- Genereer sferoïden zoals eerder beschreven.
- Bereid voor elke toestand 30 - 40 sferoïden in een FACS-buis en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 400 x g en RT.
- Aspireer het supernatant en was de sferoïden in 3 ml 1x PBS en centrifugeer vervolgens op 400 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
- Aspireer het supernatant en voeg 200 μL 0,25% Trypsine-EDTA toe en incubeer vervolgens 2 -3 minuten bij RT.
OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van de grootte van de sferoïde en het celtype. - Voeg 1 ml FACS-buffer toe en dissocieer de sferoïden voorzichtig met behulp van een pipet van 200 μL.
- Centrifugeer de gedissocieerde cellen gedurende 3 min bij 400 x g en 4 °C.
OPMERKING: FACS buffer = 1x PBS + 2,5% FBS, gefilterd met een 0,22 μm bovenfilter. - Gooi het supernatant weg en voeg 7-AAD/Annexin V-reagens (7AAD (5 μL), annexine V (5 μL)/monster toe).
- Draai de cellen voorzichtig om en incubeer gedurende 13 - 30 minuten bij RT in het donker.
- Voeg 500 μL FACS-buffer toe en filter de cellen met behulp van conische polystyreen reageerbuizen om geaggregeerde cellen te verwijderen.
- Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 400 x g en 4 °C.
- Voeg 500 μL annexine V bindingsbuffer toe aan elke buis en resuspend.
- Analyseer met behulp van een flow cytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We beschrijven het protocol van het verkrijgen van sferoïden uit verschillende colorectale kankercellijnen. Suppletie met methylcellulose was nodig om sferoïden te genereren. We presenteren ook een methode van LCFS voorbereiding en presenteren een model om de correlatie tussen probiotica en colorectale kanker te bestuderen. Sferoïde vormings - en LCFS-voorbereidingsprotocollen worden schematisch geïllustreerd in figuur 1A,B. Zoals weergegeven in figuur 2A,transformeert de methylcelluloseconcentratie van 0,6% de kankercellen in compacte sferoïden. Dit resultaat geeft aan dat sferoïden kunnen worden gegenereerd uit verschillende soorten colorectale kanker met behulp van ons methylcelluloseprotocol. Vervolgens werden de sferoïden behandeld met 25% LCFS en werd de morfologie na 48 uur bestudeerd met behulp van een lichtmicroscoop. Zoals weergegeven in figuur 3Avertoonden de sferoïden van de groepen die met LCFS werden behandeld verstoorde oppervlakken. Om de antikankereffecten van LCFS in geschikte concentraties te onderzoeken, werden de sferoïden gedurende 48 uur behandeld met verschillende doseringen LCFS: 0 (controle), 6%, 12,5% en 25%. Verstoringen in de sferoïde morfologie werden waargenomen bij sferoïden behandeld met 25% LCFS, zoals weergegeven in figuur 3B. Bovendien werden de sferoïden behandeld met 25% LCFS gedurende 24 uur en 48 uur, en verstoringen in de sferoïde morfologie werden waargenomen na 48 uur behandeling. Microscopische afbeeldingen van de sferoïden zijn weergegeven in figuur 3C.
Na 48 uur werden de monsters beoordeeld met cel levensvatbaarheidstest, en colorectale kankerceldood werd waargenomen bij behandeling met LCFS op een dosisafhankelijke manier, hoger de LCFS-hoeveelheid hoger de waargenomen celdood (Figuur 3D). Vervolgens hebben we de monsters bevlekt met propidiumjodide (PI) om apoptose te observeren. Zoals verwacht was de inductie van apoptose afhankelijk van de LCFS-dosis (figuur 4A,B,C). RT-PCR werd uitgevoerd om de veranderingen in moleculaire markers van apoptose te detecteren, d.w.z. BAX, BAK en NOXA (figuur 5A,B). Ten slotte werden apoptosemarkers bestudeerd met behulp van western blotting en Annexin V/7AAD via FACS (figuur 6A,B,C,D). Deze observaties tonen aan dat LCFS effectief apoptose veroorzaakte in het 3D-model.
Figuur 1: Schematische weergave van sferoïde vorming en LCFS-voorbereiding.
(A) Schematische weergavebeelden van het LCFS-generatieprotocol worden gemarkeerd door (i-iv) (B) Schema's van de methylcellulosegemedieerde bolvormige vorming worden gemarkeerd door (i-iii). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Methylcellulose-gemedieerde sferoïde vorming.
(A) Representatieve beelden van methylcellulose-gemedieerde sferoïde vorming van HT-29, DLD1 en WiDr. Cellen werden gezaaid in ultralage aanhechting 96-put ronde bodemplaten met methylcelluloseconcentraties van 0,1-1,2% gedurende 48 uur. Schaalbalk 10 μm (n=3 voor elk experiment). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Evaluatie van lcfsconcentratie en sferoïde morfologie.
(A) Representatieve beelden van HT-29 behandeld met LCFS gedurende 48 uur. Schaalbalk 100 μm. (B) HT-29, DLD1 en WiDr sferoïden behandeld met toenemende doses LCFS gedurende 48 uur. Alle sferoïden hadden verstoorde randen bij 12,5-25% LCFS. Schaalbalk 20 μm (n=3 voor elk experiment) (C) Sferoïde morfologieën van HT-29, DLD1 en WiDr sferoïden behandeld met 25% LCFS gedurende 24 en 48 uur. Schaalbalk 20 μm (n = 3) (D) Gemeten levensvatbaarheid van de cel, weergegeven als gemiddelde ± SEM. ***, P < 0,05 (n = 3 voor elk experiment). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Propidiumjodide kleuring van de sferoïden.
Representatieve afbeeldingen van PI-kleuring in (A) HT-29, (B) DLD1 en (C) WiDr-sferoïden na 48 uur LCFS-behandeling. De beelden werden verkregen met behulp van een fluorescentiemicroscoop en de toename van de PI-intensiteit werd gemeten met behulp van Beeld J. Schaalbalk 10 μm. De gemiddelde ± SEM wordt weergegeven. , P < 0,05 (n = 3 voor elk experiment). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Apoptose markers werden geïdentificeerd met behulp van qRT-PCR.
Apoptosemarkers, zoals BAX, BAK en NOXA, werden gekwantificeerd. mRNA-kwantificering wordt gepresenteerd als een relatieve expressie genormaliseerd naar (A) β-actine en (B) 18s rRNA. De gemiddelde ± SEM wordt weergegeven. , P < 0,05 (n=3 voor elk experiment). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Apoptose markers werden bepaald via Western blotting en FACS analyse van de sferoïden.
In de afbeelding zijn westelijke vlekken van (A) HT-29, (B) DLD1 en (C) WiDr-cellen na LCFS-behandeling. PARP1, BCL-XL en p-IκBα werden gedetecteerd. β-actine werd gebruikt als interne controle. (D) FACS-analyse van apoptose bij HT-29, DLD1 en WiDr-sferoïden geïncubeerd met LCFS. Apoptotische cellen werden gedetecteerd door de toename van de fluorescentie-intensiteit van annexin V-FITC. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Reactie | Volume per enkele 20 μL |
| 2x qPCR mix | 10 μL |
| Voorwaartse primer (10 pmol/μL) | 1 μL |
| Omgekeerde primer (10 pmol/μL) | 1 μL |
| cDNA (50 ng/μL) | 1 μL |
| PCR-kwaliteit water | 7 μL |
Tabel 1: PCR-reactiemengsel.
| Abc | Volgorde |
| BAX-Voorwaarts | CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG |
| BAX-Achteruit | CCAGCCCATGATGGTTCTGAT |
| BAK-Vooruit | ATGGTCACCTTACCTCTGCAA |
| BAK-Achteruit | TCATAGCGTCGGTTGATGTCG |
| NOXA-Vooruit | ACCAAGCCGGATTTGCGATT |
| NOXA-Achteruit | ACTTGCACTTGTTCCTCGTGG |
| 18s rRNA-Voorwaarts | GATGGGCGGCGGAAAATAG |
| 18s rRNA-Achteruit | GCGTGGATTCTGCATAATGGT |
| β-Actin-Forward | TCCTGTGGCATCCACGAAACT |
| β-Actin-Reverse | GAAGCATTTGCGGTGGACGAT |
Tabel 2: Primersequenties gebruikt in qRT-PCR analyse.
| Podium | Temperatuur (ºC) | Tijd |
| Initiële denaturatie | 95 | 10 min |
| 40 cycli: | ||
| Stap 1 | 95 | 15 seconden |
| Stap 2 | 60 | 60 seconden |
| Smeltcurvefase | 95 | 15 seconden |
| 60 | 60 seconden | |
| 95 | 15 seconden | |
Tabel 3: qRT-PCR voorwaarden.
| Antistof | Verdunning |
| PARP 1 (C2-10) | 1:1000 |
| BCL-XL (H-5) | 1:1000 |
| p-IκBα (B-9) | 1:1000 |
| β-actine (C4) | 1:1000 |
| Geit Anti-Muis IgG (H+L) | 1:2500 |
| Geit Anti-Konijn IgG (H+L) | 1:2500 |
Tabel 4: Antilichamen gebruikt bij westerse vlekanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het weefselmicromilieu, met inbegrip van naburige cellen en de extracellulaire matrix (ECM), is fundamenteel voor weefselgeneratie en cruciaal voor de controle van celgroei en weefselontwikkeling13. 2D-culturen hebben echter verschillende nadelen, zoals de verstoring van cellulaire interacties, evenals veranderingen in de celmorfologie, extracellulaire omgevingen en de benadering van divisie14. 3D-celkweeksystemen zijn grondig bestudeerd om in vivo effecten beter te reproduceren en zijn bewezen als nauwkeurigere systemen voor in-vitrokankertests15,16. Er is behoefte aan modelsystemen om gepersonaliseerde reacties op chemotherapeutica nauwkeuriger te voorspellen17.
3D steigers zijn ontwikkeld voor weefseltechniek. Het fungeert als een surrogaatverlies van ECM, dat de beschikbare ruimte van tumorcellen vertegenwoordigt. Bovendien zorgt de steiger voor fysieke interacties voor celadhesie en proliferatie en zorgt ervoor dat cellen geschikte ruimtelijke verdelingen en cel-ECM- of celcelinteracties vormen18. Het methylcellulose (MC) polymeer is voortdurend bestudeerd om de geschiktheid ervan te bepalen bij het genereren van MC-gebaseerde hydrogelsystemen voor toepassingen in 3D-celkweektechniek19,20. De intacte integratie van deze hydrogels in biomaterialen zoals 3D-celnetwerken blijft echter technisch uitdagend21. Daarom beveelt het hier gepresenteerde sferoïde vormingsprotocol de titratie van MC-concentraties en optimalisatie met verschillende tijdspunten voor elke CRC-cellijn aan. Cellijnspecifieke kenmerken, zoals celaggregatie, levensvatbaarheid en overlijden, kunnen een aanzienlijke invloed hebben op elk van de omstandigheden die we hebben getest. Deze methode kan een middel zijn om uniforme sferoïden te genereren voor het testen van LCFS op kankercellen.
Probiotica, die gunstige bacteriën zijn, produceren actieve metabolieten die mogelijk anti-kanker effecten kunnen nabootsen. Onze studie is dus ontworpen om melkzuurbacteriën (LAB) te isoleren en de antikankereffecten van hun metabolische extracten uit celvrije supernatanten (CVS) te testen. Onze studies boden een methode voor het observeren van de effecten van L. fermentum celvrije supernatanten die apoptotische celdood induceren in colorectale kankercellen in een 3D-systeem. De mRNA-niveaus van apoptosemarkers die betrokken zijn bij apoptotische routes worden dramatisch geïnduceerd na lcfs-blootstelling in 3D-omstandigheden. Bovendien werden verlaagde niveaus van PARP1 en BCL-XL uitgedrukt in de met LCFS behandelde 3D-sferoïdecontrole in vergelijking met de controle in figuur 4C,D,E. Remming van NF-κB-activering werd ook waargenomen in 3D-culturen na behandeling met LCFS. Alles bij elkaar genomen omvatten de voordelen van het cultiveren van cellen in 3D het verhogen van cel-celinteracties en reacties op signaalmoleculen om in vivo systemen beter na te bootsen. Westerse blotting met behulp van sferoïden kan leiden tot kwantitatieve inzichten in de toestand van verschillende signaalmoleculen.
Cellijnen hebben bepaalde beperkingen als preklinische modellen van kankeronderzoek. Onlangs, kanker organoïden zijn gebruikt in de modellering van gepersonaliseerde anti-kanker therapie22,23. De behandeling van LCFS met probiotica in organoïden zal naar verwachting worden gebruikt als een krachtig platform om anti-kanker effecten te testen. Bovendien, we hebben slechts getest een van de Lactobacillus soorten onder de verschillende probiotica in het kankermodel. Verschillende probiotica worden ook getest voor de preventie van metabool syndroom, immunologische en neurologische aandoeningen24,25,26. LCFS van Bifidobacterium, Saccharomyces, Streptococcus, Enterococcusen Akkermansia soorten zijn potentiële kandidaten voor het testen van gezondheidsvoordelen door middel van verschillende soorten ziektemodellen27,28,29.
Op basis van deze studie kan worden geconcludeerd dat het begrip van signalering in sferoïden en de verschillende reacties op LCFS-behandeling in 3D-modellen gunstig kunnen zijn voor het testen van antikankereffecten met behulp van de methode die we hebben voorgesteld. Bovendien kunnen 3D-kankermodellen verschillende voordelen bieden die niet mogelijk zijn met traditionele 2D-monolagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen relevante financiële informatie.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de "Vaststelling van meetnormen voor chemie en straling", subsidienummer KRISS-2020-GP2020-0003 en "Ontwikkeling van meetnormen en technologie voor biomaterialen en medische convergentie", subsidienummer KRISS-2020-GP2020-0004-programma's, gefinancierd door het Korea Research Institute of Standards and Science. Dit onderzoek werd ook ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en ICT (MSIT), National Research Foundation of Korea (NRF-2019M3A9F3065868), het Ministerie van Volksgezondheid en Welzijn (MOHW), het Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, HI20C0558), het Ministerie van Handel, Industrie & Energie (MOTIE) en korea Evaluation Institute of Industrial Technology (KEIT, 20009350). ORCID-ID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). We danken Chang Woo Park voor hulp bij experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti - p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
References
- Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
- Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
- Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
- Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
- Harish, K., Varghese, T.
- Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557 (2019).
- Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886 (2018).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
- Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
- Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
- Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
- Drost, J., Clevers, H.
- Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
- Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F.
- Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
- Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
- Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711 (2019).
- Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).
