Summary
Hier werden Methoden vorgestellt, um die krebshemmende Wirkung von Lactobacillus cell-free superstandant (LCFS) zu verstehen. Darmkrebs-Zelllinien zeigen Zelltod, wenn sie mit LCFS in 3D-Kulturen behandelt werden. Der Prozess der Erzeugung von Sphäroiden kann je nach Gerüst optimiert werden und die vorgestellten Analysemethoden sind nützlich, um die beteiligten Signalwege zu bewerten.
Abstract
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Bewertung des Krebszelltodes in dreidimensionalen (3D) Sphäroiden mehrzelliger Krebsarten unter Verwendung von Überständen aus der Lactobacillus fermentum Zellkultur, die als Probiotika-Kulturen betrachtet werden. Die Verwendung von 3D-Kulturen zum Testen von Lactobacillus zellfreiem Überstand (LCFS) ist eine bessere Option als tests in 2D-Monoschichten, zumal L. fermentum Krebsbekämpfungseffekte im Darm hervorrufen kann. Es wurde festgestellt, dass L. fermentum-Überstand unter 3D-Kulturbedingungen eine erhöhte antiproliferative Wirkung gegen mehrere Darmkrebszellen (CRC) besitzt. Interessanterweise waren diese Effekte stark mit dem Kulturmodell verbunden, was die bemerkenswerte Fähigkeit von L. fermentum zeigte, den Tod von Krebszellen zu induzieren. Stabile Sphäroide wurden aus verschiedenen CRCs (Darmkrebszellen) unter Verwendung des unten vorgestellten Protokolls erzeugt. Dieses Protokoll zur Erzeugung von 3D-Sphäroid ist zeitsparend und kostengünstig. Dieses System wurde entwickelt, um die krebshemmenden Wirkungen von LCFS in mehreren Arten von CRC-Sphäroiden leicht zu untersuchen. Wie erwartet, induzierten CRC-Sphäroide, die mit LCFS behandelt wurden, während des Experiments stark den Zelltod und exprimierten spezifische apoptose-molekulare Marker, die durch qRT-PCR, Western Blotting und FACS-Analyse analysiert wurden. Daher ist diese Methode wertvoll für die Erforschung der Zelllebensfähigkeit und die Bewertung der Wirksamkeit von Krebsmedikamenten.
Introduction
Probiotika sind die vorteilhaftesten Mikroorganismen im Darm, die die Immunhomöostase und den Energiestoffwechsel verbessern1. Probiotika aus Lactobacillus und Bifidobacterium sind die fortschrittlichsten ihrer Art, die im Darm gefunden werden2,3. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Lactobacillus hemmende und antiproliferative Wirkungen auf mehrere Krebsarten hat, einschließlich Darmkrebs4. Darüber hinaus verhindern Probiotika entzündliche Darmerkrankungen, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa5,6. Die meisten Studien mit Probiotika wurden jedoch in zweidimensionalen (2D) Monoschichten durchgeführt, die auf festen Oberflächen gezüchtet werden.
Künstlichen Kultursystemen fehlen Umweltmerkmale, was für Krebszellen nicht natürlich ist. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden dreidimensionale (3D) Kultursysteme entwickelt7,8. Krebszellen in 3D zeigen Verbesserungen in Bezug auf grundlegende biologische Mechanismen wie Zelllebensfähigkeit, Proliferation, Morphologie, Zell-Zell-Kommunikation, Arzneimittelempfindlichkeit und In-vivo-Relevanz9,10. Darüber hinaus werden Sphäroide aus mehrzelligen Arten von Darmkrebs hergestellt und sind abhängig von Zell-Zell-Interaktionen und der extrazellulären Matrix (ECM)11. Unsere vorherige Studie hat berichtet, dass probiotische zellfreie Überstände (CFS), die mit Lactobacillus fermentum hergestellt wurden, krebshemmende Wirkungen auf 3D-Kulturen von Darmkrebszellen (CRC) zeigten12. Wir schlugen vor, dass CFS eine geeignete alternative Strategie zum Testen probiotischer Wirkungen auf 3D-Sphäroideist 12.
Hier stellen wir einen Ansatz vor, der mehrzellige Arten von 3D-Darmkrebs für die Analyse der therapeutischen Wirkungen von probiotischen zellfreien Überständen (CFS) auf mehrere 3D-Darmkrebs-Mimikrysysteme aufnehmen kann. Diese Methode bietet ein Mittel zur Analyse verwandter probiotischer und krebshemmenden Wirkungen in vitro.
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Protocol
1. Bakterielle Zellkulturen und Herstellung von Lactobacillus zellfreiem Überstand (LCFS)
HINWEIS: Die Schritte 1.2 – 1.9 werden in einer anaeroben Kammer durchgeführt.
- Bereiten Sie eine MRS-Agarplatte und eine Brühe mit L-Cystein vor und sterilisieren Sie sie durch Autoklavieren.
- Die MRS-Agarplatte wird in der anaerobenH2-Kammer bei 37 °C mit 20 ppm Sauerstoff vorinkubiert.
- Lactobacillus-Bakterienbestand auftauen und die Agarplatte mit der Bakterienkultur impfen (Abbildung 1A (i)).
- Inkubieren Sie Bakterien für 2 - 3 Tage in der anaerobenH2-Kammer bei 37 °C und 20 ppm Sauerstoff, bis einzelne Bakterienkolonien erhalten sind.
- Waschen und trocknen Sie das anerobe Kulturröhrchen vom Typ Hungate. Autoklaven Sie das Kulturröhrchen bei 121 °C für 15 min.
- Anschließend wird das Röhrchen in der anaerobenH2-Kammer bei 37 °C und 20 ppm Sauerstoff inkubiert, um Sauerstoff zu entfernen.
- 2 - 3 ml MRS-Brühe in die Tube geben. Verschließen Sie das Rohr mit einem Butylgummi-Stopfen und schrauben Sie den Verschluss.
- Erhalten Sie eine einzelne Kolonie mit einer Schleife und legen Sie sie in die 1,5 ml Kulturröhre mit 500 μL 1x PBS. (Abbildung 1A (ii)).
- Suspendieren Sie die Kolonie mit einer 1-ml-Spritze (Abbildung 1A (iii)). Führen Sie dazu die Nadel der 1-ml-Spritze in die Mitte des Röhrchendeckels ein, saugen Sie die suspendierte Kolonie an und setzen Sie sie dann wieder in das MRS-Brühemedium aus. (Abbildung 1A (iv)).
- Inkubieren Sie das MRS-Brühemedium in einem Shaker-Inkubator für 2 Tage (37 °C, 5% CO2,200 U/min).
- Messen Sie die optische Dichte (OD) mit einem Spektralphotometer, um Bakterienwachstumskurven zu überwachen, bis die Absorption bei OD620 bis 2,0 erreicht.
- Trennen Sie die Bakterienpellets und die konditionierten Medien durch Zentrifugieren bei 1.000 x g für 15 min. Waschen Sie die gesammelten Bakterienpellets mit 1x PBS und resuspendieren Sie in 4 ml RPMI 1640, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum. Fügen Sie keine Antibiotika in das Medium ein.
- Die Bakterienpellets in RPMI aufbewahren und in einem Shaker-Inkubator für 4 h bei 37 °C mit 5% CO2 bei einer Drehzahl von 100 U/min inkubieren.
- Zur Herstellung des probiotischen Überstandes das Bakterienpellet durch Zentrifugation bei 1000 x gfür 15 min bei 4 °C entfernen. Den zurückgewonnenen Überstand mit einem 0,22 μm Filter steril filtern und bis zur Verwendung bei −80 °C lagern.
2. Erzeugung von Sphäroiden
-
Vorbereitung von Darmkrebs-Zelllinien
- DlD-1-, HT-29- und WiDr-Zelllinien als Monoschichten bis zu 70-80% Konfluenz züchten und die Platte bei 37 °C in einem 5% CO 2-Inkubator (Wachstumsmedium: RPMI mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin) züchten.
- Für Zellen, die in einer 100-mm-Petrischale gezüchtet werden, waschen Sie die Platte zweimal mit 4 ml 1x PBS. Fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie die Petrischale für 2 min bei 37 °C in einem 5% CO 2-Inkubator, um die Zellen zu dissoziieren.
- Überprüfen Sie nach der Inkubation die Zelldissoziation unter dem Mikroskop und neutralisieren Sie Trypsin-EDTA mit 5 ml Wachstumsmedium.
- Die dissoziierten Zellen in ein 15 mL konisches Röhrchen und eine Zentrifuge für 3 min bei 300 x g geben.
- Entsorgen Sie den Überstand und ruhen Sie ihn vorsichtig mit 3 ml Wachstumsmedium.
- Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau, um lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer zu bestimmen. (Abbildung 1B (i))
-
Sphäroide Bildung
- In einem konischen Röhrchen von 15 ml werden die Zellen von 2.1.5 verdünnt, um 1 - 2 x 105 Zellen/ml zu erhalten(Abbildung 1B (ii))
- Fügen Sie der Zellsuspension eine Endkonzentration von 0,6% Methylcellulose hinzu und übertragen Sie die verdünnten Zellen in ein steriles Reservoir.
HINWEIS: Für jede Zelllinie sollte die benötigte Menge an Methylcellulose titriert und entsprechend bestimmt werden. - Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 200 μL Zellen in jede Vertiefung einer ultra-niedrigen 96-Well-Rundboden-Mikroplatte zu dosieren. (Abbildung 1B (iii))
- Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem 5% CO2 Inkubator für 24 - 36 h.
- Nach 24 - 36 h beobachten Sie die Platte unter einem Lichtmikroskop, um die Sphäroidalbildung sicherzustellen.
3. Behandlung von 3D-Darmkrebszellen mit LCFS
- Generieren Sie Sphäroide wie in den Schritten 2 und 3 beschrieben.
- Bevor Sie die LCFS-Behandlung durchführen, tauen Sie das gefrorene LCFS bei Raumtemperatur (RT) für 10 - 20 min auf.
- Impfen Sie die LCFS-Aktienlösung in ein Wachstumsmedium. Seriell verdünnt auf 25%, 12,5% und 6% im Wachstumsmedium (d.h. 25% LCFS = 150 μL Wachstumsmedium + 50 μL LCFS).
- Nehmen Sie die Zellkulturplatte mit Sphäroiden aus dem Inkubator und entfernen Sie mit einer 200 μL-Pipette so viel Wie möglich aus jeder Vertiefung.
- Die Wachstumsmedien mit LCFS auf die Zellen geben und bei 37 °C in einem 5% CO2 Inkubator für 24 - 48 h inkubieren.
HINWEIS: Das zu verwendende Volumen hängt wie folgt von der Plattengröße ab: 2 ml für 6-Well-Zellkulturplatten; 200 μL für 96-Well-Zellkulturplatten.
4. Zelllebensfähigkeit für Sphäroide
- Bereiten Sie 8 - 10 LCFS-behandelte Darmkrebssphäroide in undurchsichtigen Multi-Well-Platten vor (Zelllebensfähigkeitstests werden 48 Stunden nach der LCFS-Behandlung durchgeführt).
- Das Zelllebensfähigkeitsreagenz (siehe Materialtabelle)über Nacht bei 4 °C auftauen.
- Gleichen Sie das Zelllebensfähigkeitsreagenz vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur aus.
- Bevor Sie den Assay durchführen, entfernen Sie 50% der Wachstumsmedien aus den Sphäroide.
- Fügen Sie 100 μL Zelllebensfähigkeitsreagenz zu jeder Vertiefung hinzu.
HINWEIS: Das zu verwendende Volumen hängt wie folgt von der Plattengröße ab: 100 μL für 96-Well-Zellkulturplatten. - Mischen Sie das Reagenz 5 minuten lang kräftig, um die Zelllyse zu fördern.
- 30 min – 2 h bei 37 °C inkubieren.
- Zeichnen Sie die Lumineszenz auf.
5. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse für Sphäroide
- Für jede Bedingung 10 - 15 Sphäroide in einem 2 ml Röhrchen und zentrifugieren Sie für 3 min bei 400 x g.
- Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Sphäroide zweimal in 1 ml eiskaltem 1x PBS.
HINWEIS: Vermeiden Sie Zentrifugation, lassen Sie die Sphäroide sich absetzen. - Saugen Sie so viel wie möglich von dem 1x PBS ab und isolieren Sie RNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit.
- Synthetisieren Sie cDNA aus 1 μg RNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Bereiten Sie einen Mastermix vor, um alle Proben in dreifacher Ausfertigung auszuführen (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2).
- Führen Sie die Verstärkung in einem 20 μL des Template-Master-Mixes in jede qPCR-Plattenbohrung durch.
- Mischen Sie die Reaktionen gut und drehen Sie sie bei Bedarf.
- Führen Sie Proben gemäß den Empfehlungen des Geräteherstellers aus (Tabelle 3).
6. Westliches Blotting von Sphäroide
HINWEIS: Verwenden Sie beim Sammeln von Sphäroide eine 200 μL-Pipette und schneiden Sie das Ende der Spitzen ab, um deren Struktur nicht zu stören.
- Bereiten Sie für jede Bedingung 30 - 40 Sphäroide in einem 2-ml-Röhrchen vor.
- Legen Sie das Rohr auf Eis und lassen Sie die Sphäroide auf den Boden des 2-ml-Rohrs absetzen.
- Den Überstand entsorgen und die Sphäroide zweimal in 1 mL eiskalt 1x PBS waschen
HINWEIS: Vermeiden Sie Zentrifugation, lassen Sie die Sphäroide sich absetzen. - Saugen Sie so viel wie möglich von dem 1x PBS ab und fügen Sie RIPA-Puffer mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail hinzu (10 Sphäroide = 30 μL RIPA-Puffer).
- Lyse der Zellen durch Pipettieren auf und ab und führt eine Beschallung für 30 s durch, wobei 30 s 10 Zyklen lang auf Eis ruhen.
- Zentrifuge das Protein Lysate bei 15000 x g für 15 min bei 4 °C.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration für jedes Zelllysat.
- Vor dem Laden jedes Zelllysat in einem Probenpuffer bei 100 °C für 10 min kochen.
- Laden Sie gleiche Mengen Protein in die Vertiefungen des SDS-PAGE Gels und lassen Sie das Gel für 1 - 2 h bei 100 V laufen.
- Übertragen Sie das Protein vom Gel auf die PVDF-Membran.
- Nach dem Transfer die Membran für 1 h bei Raumtemperatur mit einem Sperrpuffer (5% Magermilch + TBS mit 0,05% Tween-20) blockieren.
- Inkubieren Sie die Membran mit 1:1.000 Verdünnungen des primären Antikörpers (Tabelle 4) in 1x TBST mit 5% BSA-Puffer bei 4 °C über Nacht.
- Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST, 15 min für jede Wäsche.
- Inkubieren Sie die Membran mit 1:2.500 Verdünnungen des sekundären Antikörpers im Sperrpuffer bei Raumtemperatur für 2 h (siehe Materialtabelle).
- Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST, 15 min für jede Wäsche.
- Bereiten Sie die Membran für den HRP-Nachweis mit einem chemiluminineszierenden Substrat vor.
- Erfassen Sie chemiluminineszierende Bilder.
7. Propidiumiodid (PI) Färbung von Sphäroide
- Bereiten Sie 5-10 Sphäroide wie in Schritt 4.1 beschrieben vor und legen Sie die Sphäroide in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.
- Verdünnen Sie eine 1 mg/ml Menge PI 1:100 in 1x PBS.
- Entfernen Sie 50% des Mediums aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte.
- Fügen Sie 100 μL der PI-Lösung zu jeder Vertiefung hinzu und legen Sie die Vertiefungen für 10 - 15 min in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.
- Waschen Sie die PI-Lösung mit 1x PBS aus.
- Fügen Sie 200 μL Wachstumsmedium hinzu und nehmen Sie ein Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop auf. Analysieren Sie die Fluoreszenzintensität mit Bild J, um die Lebensfähigkeit des Sphäroids zu erhalten.
8. FACS-Analyse von Sphäroiden
- Generieren Sie Sphäroide wie zuvor beschrieben.
- Bereiten Sie für jede Bedingung 30 - 40 Sphäroide in einem FACS-Röhrchen und einer Zentrifuge für 3 minuten bei 400 x g und RT vor.
- Saugen Sie den Überstand an und waschen Sie die Sphäroide in 3 mL 1x PBS, dann zentrifugieren Sie bei 400 x g für 3 min bei 4 °C.
- Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie 200 μL 0,25% Trypsin-EDTA hinzu, dann inkubieren Sie es bei RT für 2 -3 min.
HINWEIS: Die Inkubationszeit ist abhängig von der Sphäroidgröße und dem Zelltyp. - Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer hinzu und dissoziieren Sie die Sphäroide vorsichtig mit einer 200 μL-Pipette.
- Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 400 x g und 4 °C für 3 min.
HINWEIS: FACS-Puffer = 1x PBS + 2,5% FBS, gefiltert mit einem 0,22 μm Top-Filter. - Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 7-AAD/Annexin V Reagenz (7AAD (5 μL), Annexin V (5 μL)/Probe) hinzu.
- Die Zellen vorsichtig durchwirbeln und 13 - 30 min bei RT im Dunkeln inkubieren.
- Fügen Sie 500 μL FACS-Puffer hinzu und filtern Sie die Zellen mit konischen Polystyrol-Reagenzgläsern, um Aggregatzellen zu entfernen.
- Zentrifuge bei 400 x g und 4 °C für 3 min.
- 500 μL Annexin V-Bindungspuffer in jedes Röhrchen geben und wieder aufschnüssen.
- Analysieren Sie mit einem Durchflusszytometer.
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Representative Results
Wir beschreiben das Protokoll der Gewinnung von Sphäroiden aus verschiedenen Darmkrebszelllinien. Eine Supplementierung mit Methylcellulose war erforderlich, um Sphäroide zu erzeugen. Wir stellen auch eine Methode der LCFS-Vorbereitung vor und präsentieren ein Modell, um die Korrelation zwischen Probiotika und Darmkrebs zu untersuchen. Sphäroidbildungs- und LCFS-Präparationsprotokolle sind schematisch in Abbildung 1A,Bdargestellt. Wie in Abbildung 2Agezeigt, wandelt eine Methylcellulosekonzentration von 0,6% die Krebszellen in kompakte Sphäroide um. Dieses Ergebnis zeigt, dass Sphäroide aus verschiedenen Arten von Darmkrebs mit unserem Methylcellulose-Protokoll erzeugt werden können. Als nächstes wurden die Sphäroide mit 25% LCFS behandelt und die Morphologie nach 48 h mit einem Lichtmikroskop untersucht. Wie in Abbildung 3Agezeigt, wiesen die Sphäroide der mit LCFS behandelten Gruppen gestörte Oberflächen auf. Um die krebshemmenden Wirkungen von LCFS in geeigneten Konzentrationen zu untersuchen, wurden die Sphäroide 48 h lang mit verschiedenen Dosierungen von LCFS behandelt: 0 (Kontrolle), 6%, 12,5% und 25%. Störungen in der Sphäroidmorphologie wurden bei Sphäroiden beobachtet, die mit 25% LCFS behandelt wurden, wie in Abbildung 3B gezeigt. Darüber hinaus wurden die Sphäroide mit 25% LCFS für 24 h und 48 h behandelt, und nach 48 h Behandlung wurden Störungen in der sphäroiden Morphologie beobachtet. Mikroskopische Aufnahmen der Sphäroide sind in Abbildung 3C dargestellt.
Nach 48 h wurden die Proben mit einem Zelllebensfähigkeitstest bewertet, und der Zelltod von Darmkrebs wurde bei der Behandlung mit LCFS dosisabhängig beobachtet, wobei die LCFS-Menge höher war als der beobachtete Zelltod (Abbildung 3D). Wir färbten die Proben dann mit Propidieniodid (PI), um die Apoptose zu beobachten. Wie erwartet, war die Induktion der Apoptose abhängig von der LCFS-Dosis (Abbildung 4A,B,C). RT-PCR wurde durchgeführt, um die Veränderungen der molekularen Marker der Apoptose, d.h. BAX, BAK und NOXA, nachzuweisen (Abbildung 5A,B). Schließlich wurden Apoptosemarker mittels Western Blotting und Annexin V/7AAD durch FACS untersucht (Abbildung 6A,B,C,D). Diese Beobachtungen zeigen, dass LCFS die Apoptose im 3D-Modell effektiv induzierte.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Sphäroidbildung und LCFS-Vorbereitung.
(A) Schematische Darstellungsbilder des LCFS-Erzeugungsprotokolls sind gekennzeichnet durch (i-iv) (B) Schematische Der Methylcellulose-vermittelten Sphäroidbildung sind durch (i-iii) gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Methylcellulose-vermittelte Sphäroidbildung.
(A) Repräsentative Bilder der Methylcellulose-vermittelten Sphäroidbildung von HT-29, DLD1 und WiDr. Die Zellen wurden in ultra-low attachment 96-well runden Bodenplatten mit Methylcellulosekonzentrationen von 0,1-1,2% für 48 h ausgesät. Maßstabsbalken 10 μm (n=3 für jedes Experiment). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bewertung der LCFS-Konzentration und der Sphäroidmorphologie.
(A) Repräsentative Bilder von HT-29, die mit LCFS für 48 h behandelt wurden. Maßstabsleiste 100 μm. (B) HT-29-, DLD1- und WiDr-Sphäroide, die mit steigenden Dosen von LCFS für 48 h behandelt wurden. Alle Sphäroide hatten gestörte Kanten bei 12,5-25% LCFS. Maßstabsbalken 20 μm (n=3 für jedes Experiment) (C) Sphäroidmorphologien von HT-29-, DLD1- und WiDr-Sphäroiden, die mit 25% LCFS für 24 und 48 h behandelt wurden. Maßstabsbalken 20 μm (n = 3) (D) Gemessene Zelllebensfähigkeit, dargestellt als mittlere ± REM. ***, P < 0,05 (n = 3 für jedes Experiment). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Propidiumiodidfärbung der Sphäroide.
Repräsentative Bilder von PI-Färbungen in (A) HT-29, (B) DLD1 und (C) WiDr-Sphäroide nach 48 h LCFS-Behandlung. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen und die Zunahme der PI-Intensität wurde mit Image J. Scale bar 10 μm gemessen. Der Mittelwert ± SEM wird angezeigt. , P < 0,05 (n = 3 für jedes Experiment). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Apoptosemarker wurden mittels qRT-PCR identifiziert.
Apoptose-Marker wie BAX, BAK und NOXA wurden quantifiziert. Die mRNA-Quantifizierung wird als relative Expression dargestellt, die auf (A) β-Actin und (B) 18s rRNA normalisiert ist. Der Mittelwert ± SEM wird angezeigt. , P < 0,05 (n=3 für jedes Experiment). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Apoptosemarker wurden mittels Western Blotting und FACS-Analyse der Sphäroide bestimmt.
In der Abbildung sind westliche Flecken von (A) HT-29, (B) DLD1 und (C) WiDr-Zellen nach LCFS-Behandlung dargestellt. PARP1, BCL-XL und p-IκBα wurden nachgewiesen. β-Actin wurde als interne Kontrolle eingesetzt. (D) FACS-Analyse der Apoptose in HT-29-, DLD1- und WiDr-Sphäroiden, die mit LCFS inkubiert wurden. Apoptotische Zellen wurden durch die Erhöhung der Fluoreszenzintensität von Annexin V-FITC nachgewiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Reaktion | Volumen pro Einzel 20 μL |
| 2X qPCR-Mix | 10 μL |
| Vorwärtsprimer (10 pmol/μL) | 1 μL |
| Reverse Primer (10 pmol/μL) | 1 μL |
| cDNA (50 ng/μL) | 1 μL |
| PCR-Wasser | 7 μL |
Tabelle 1: PCR-Reaktionsgemisch.
| Fibel | Reihenfolge |
| BAX-Vorwärts | CCCGAGAGGTCTTTTTTCCGAG |
| BAX-Rückwärts | CCAGCCCATGATGGTTCTGAT |
| BAK-Vorwärts | ATGGTCACCTTACCTCTGCAA |
| BAK-Rückseite | TCATAGCGTCGGTTGATGTCG |
| NOXA-Vorwärts | ACCAAGCCGGATTTGCGATT |
| NOXA-Rückseite | ACTTGCACTTGTTCCTCGTGG |
| 18s rRNA-Vorwärts | GATGGGCGGCGGAAAATAG |
| 18s rRNA-Reverse | GCGTGGATTCTGCATAATGGT |
| β-Actin-Forward | TCCTGTGGCATCCACGAAACT |
| β-Aktin-Reverse | GAAGCATTTGCGGTGGACGAT |
Tabelle 2: Primersequenzen, die in der qRT-PCR-Analyse verwendet werden.
| Bühne | Temperatur (ºC) | Zeit |
| Anfängliche Denaturierung | 95 | 10 Min. |
| 40 Zyklen: | ||
| Schritt 1 | 95 | 15 Sek. |
| Schritt 2 | 60 | 60 Sek. |
| Stufe der Schmelzkurve | 95 | 15 Sek. |
| 60 | 60 Sek. | |
| 95 | 15 Sek. | |
Tabelle 3: qRT-PCR-Bedingungen.
| Antikörper | Verdünnung |
| PARP 1 (C2-10) | 1:1000 |
| BCL-XL (H-5) | 1:1000 |
| p-IκBα (B-9) | 1:1000 |
| β-Aktin (C4) | 1:1000 |
| Ziegen-Anti-Maus IgG (H+L) | 1:2500 |
| Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) | 1:2500 |
Tabelle 4: Antikörper, die in der Western-Blot-Analyse verwendet werden.
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Discussion
Die Gewebemikroumgebung, einschließlich benachbarter Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM), ist grundlegend für die Gewebeerzeugung und entscheidend für die Kontrolle des Zellwachstums und der Gewebeentwicklung13. 2D-Kulturen haben jedoch mehrere Nachteile, wie die Störung zellulärer Interaktionen sowie Veränderungen in der Zellmorphologie, extrazellulären Umgebungen und dem Ansatz derDivision 14. 3D-Zellkultursysteme wurden gründlich untersucht, um In-vivo-Effekte besser zu reproduzieren, und haben sich als präzisere Systeme für In-vitro-Krebstests erwiesen15,16. Es besteht ein Bedarf an Modellsystemen, um personalisierte Reaktionen auf Chemotherapeutika genauer vorherzusagen17.
Für das Tissue Engineering wurde ein 3D-Gerüst entwickelt. Es wirkt als Ersatzverlust von ECM und repräsentiert den verfügbaren Raum von Tumorzellen. Darüber hinaus sorgt das Gerüst für physikalische Wechselwirkungen für Zelladhäsion und -proliferation und bewirkt, dass Zellen geeignete räumliche Verteilungen und Zell-ECM- oder Zell-Zell-Interaktionen bilden18. Das Methylcellulose (MC)-Polymer wurde kontinuierlich untersucht, um seine Eignung bei der Erzeugung von MC-basierten Hydrogelsystemen für Anwendungen in der 3D-Zellkulturtechnik zu bestimmen19,20. Der intakte Einbau dieser Hydrogele in Biomaterialien wie 3D-Zellnetzwerke bleibt jedoch technisch anspruchsvoll21. Daher empfiehlt das hier vorgestellte Sphäroidbildungsprotokoll die Titration der MC-Konzentrationen und die Optimierung mit verschiedenen Zeitpunkten für jede CRC-Zelllinie. Zelllinienspezifische Eigenschaften wie Zellaggregation, Lebensfähigkeit und Tod können jede der von uns getesteten Bedingungen erheblich beeinflussen. Diese Methode kann ein Mittel zur Erzeugung einheitlicher Sphäroide für die Prüfung von LCFS an Krebszellen sein.
Probiotika, die nützliche Bakterien sind, produzieren aktive Metaboliten, die möglicherweise Anti-Krebs-Effekte nachahmen können. Daher wurde unsere Studie entwickelt, um Milchsäurebakterien (LAB) zu isolieren und die krebshemmenden Wirkungen ihrer Stoffwechselextrakte aus zellfreien Überständen (CFS) zu testen. Unsere Studien lieferten eine Methode zur Beobachtung der Auswirkungen von L. fermentum zellfreien Überständen, die den apoptotischen Zelltod in Darmkrebszellen in einem 3D-System induzieren. Die mRNA-Spiegel von Apoptosemarkern, die an apoptotischen Signalwegen beteiligt sind, werden nach LCFS-Exposition unter 3D-Bedingungen dramatisch induziert. Darüber hinaus wurden in der LCFS-behandelten 3D-Sphäroidkontrolle im Vergleich zur Kontrolle in Abbildung 4C, D,Everminderte Konzentrationen von PARP1 und BCL-XL ausgedrückt. Eine Hemmung der NF-κB-Aktivierung wurde auch in 3D-Kulturen nach der Behandlung mit LCFS beobachtet. Insgesamt umfassen die Vorteile der Kultivierung von Zellen in 3D die Erhöhung der Zell-Zell-Interaktionen und der Reaktionen auf Signalmoleküle, um In-vivo-Systeme besser nachzuahmen. Western Blotting mit Sphäroide kann zu quantitativen Einblicken in den Zustand verschiedener Signalmoleküle führen.
Zelllinien haben gewisse Einschränkungen als präklinische Modelle der Krebsforschung. In jüngster Zeit wurden Krebsorganoide bei der Modellierung der personalisierten Anti-Krebs-Therapieverwendet 22,23. Es wird erwartet, dass die Behandlung von LCFS mit Probiotika in Organoiden als leistungsstarke Plattform zum Testen von Krebswirkungen eingesetzt wird. Darüber hinaus haben wir nur eine der Lactobacillus-Arten unter den verschiedenen Probiotika im Krebsmodell getestet. Verschiedene Probiotika werden auch zur Vorbeugung von metabolischen Syndromen, immunologischen und neurologischen Störungen getestet24,25,26. LCFS von Bifidobacterium, Saccharomyces, Streptococcus, Enterococcusund Akkermansia Arten sind potenzielle Kandidaten für die Prüfung des gesundheitlichen Nutzens durch verschiedene Arten von Krankheitsmodellen27,28,29.
Basierend auf dieser Studie kann gefolgert werden, dass das Verständnis der Signalübertragung in Sphäroide und die verschiedenen Reaktionen auf die LCFS-Behandlung in 3D-Modellen für die Prüfung von Krebswirkungen mit der von uns vorgeschlagenen Methode von Vorteil sein kann. Darüber hinaus können 3D-Krebsmodelle mehrere Vorteile bieten, die mit herkömmlichen 2D-Monoschichten nicht möglich sind.
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Disclosures
Den Autoren sind keine relevanten finanziellen Angaben vor.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch die "Etablierung von Messstandards für Chemie und Strahlung", Förderkennzeichen KRISS-2020-GP2020-0003, und "Entwicklung von Messstandards und -technologien für Biomaterialien und medizinische Konvergenz", Förderkennzeichen KRISS-2020-GP2020-0004 Programme, finanziert vom Korea Research Institute of Standards and Science, unterstützt. Diese Forschung wurde auch vom Ministerium für Wissenschaft und IKT (MSIT), der National Research Foundation of Korea (NRF-2019M3A9F3065868), dem Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt (MOHW), dem Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, HI20C0558), dem Ministerium für Handel, Industrie und Energie (MOTIE) und dem Korea Evaluation Institute of Industrial Technology (KEIT, 20009350) unterstützt. ORCID ID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Wir danken Chang Woo Park für die Unterstützung bei experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti - p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
References
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